הערכת הכדאיות של קונסורציום חיידקי סינתטי על הממשק מארח-חיידק במעיים במבחנה

מודל זה הוא השלב הבא בקביעת מיקרו-כיווני מארח לדרכי העיכול העליונות. זה מאפשר לענות על שאלות מחקר מכניסטיות והוא מציע הזדמנויות רבות לתעשיית המזון, הפארמה והתזונה וגם טוקסיקולוגיה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא משלבת מודל של מערכת העיכול עם ממשק המיקרו המארח הכולל קהילת מיקרואורגניזמים מורכבת.

זה מאוד ישים וזה מאוד גמיש גם כן. ניתן לאמץ מתודולוגיה זו באמצעות סוגי תאים אחרים כדי להעריך את כדאיות הפתוגן והמידע שלאחר מכן. ניתן להשתמש בשינויים גם כדי לסייע ליכולת ההתיישבות של תערובות פרוביוטיות ובסופו של דבר להשפעה הפוטנציאלית של חיידקים על זרימת הדם המערכתית.

כדי להתחיל, יש לבצע חיטוי של המדיום, ולאחר מכן להוסיף חמישה מיקרוגרם למיליליטר המן ומיקרוגרם אחד למיליליטר מנדיון. הוציאו תשעה מיליליטר מהמדיום לצינורות הונגייט, וסגרו את הצינורות עם פקק גומי ומכסה אלומיניום. לאחר מכן שטפו את הצינורות בתערובת של 90% חנקן ו -10% פחמן דו חמצני.

השתמש במזרק כדי לאחזר מיליליטר אחד של מדיום אנאירובי, והעביר אותו לצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. בחר מושבות בודדות מכל מין חיידקים והשהה אותן מחדש במדיום. לאחר מכן העבירו את המושבות לתוך ה-BHI האנאירובי המותאם, ודגרו אותן בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות.

לאחר הדגירה, השתמש ב-PBS מעוקר מסונן כדי לדלל את התרביות ל-10 עד 5 תאים למיליליטר. לאחר מכן השתמש בזרימה ציטומטרית עם כתם יודיד פרופידיום ירוק סייבר כדי למדוד את מספר התא. הערכת הרכב קהילת המיקרוביום והכדאיות חיונית למניעת הטיה בניסוי שלנו.

הסר את מדיום תרבית התאים מהצלוחיות, ואז השתמש בחמישה מיליליטר PBS ללא סידן או מגנזיום כדי לשטוף את התאים פעם אחת. הוסף שני מיליליטר של תמיסת טריפסין EDTA לתאים. מחלקים את התמיסה על ידי הזזת הבקבוק בעדינות.

לאחר מכן הסר 1.5 מיליליטר מתמיסת הטריפסין, ודגר את הבקבוק בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר בדיקה תחת המיקרוסקופ אם התאים התנתקו, הוסף חמישה מיליליטר של מדיום תרבית תאים בתוספת לבקבוק כדי לנטרל את הטריפסין, ופיפטה למעלה ולמטה כדי לקבל תרחיף תא בודד הומוגני. מערבבים מיד 50 מיקרוליטר של תרחיף התא עם תמיסה סטרילית של 0.4% טריפן כחול ביחס נפח לנפח של 1:1 עבור תאי KCO2 עבור נפח לנפח של 1:5 עבור HT29MTX.

מערבבים על ידי פיפטינג, וטוענים את התרחיף לתא ספירה לפני ספירת התאים מתחת למיקרוסקופ. לאחר הכנת תרחיפי KCO2 ותאי HT29MTX על פי פרוטוקול הטקסט, הומוגניזציה של המתלים והוסף את הנפח המתאים של תאי KCO2 ו-HT29MTX למיכל סטרילי מלא מראש עם מדיום תרבית תאים משלים. שאפו את המדיום שהודגר מראש מהצד האפיקלי של החדר שהוכן בעבר.

ערבבו בעדינות את תרחיף התא על ידי פיפטינג, והעבירו 1.5 מיליליטר לתא האפיקלי של תוספות התא תוך ערבוב תרחיף התא כל באר אחת עד שלוש בארות כדי להבטיח הומוגניזציה מתמדת. הזיזו בעדינות את הצלחות קדימה ואחורה ואז מימין לשמאל כדי לפזר באופן שווה את התאים בבאר. העבירו את הצלחות לחממה, וחזרו על תנועת הצלחות.

ישיבת התאים צריכה להיעשות עם הומוגניזציה מתמדת של תרחיף התאים כדי להבטיח התפשטות אחידה בבאר. כדי למדוד את תקינות מחסום האפיתל לפני תחילת ה-ASA, ודא שציוד השכבה טעון במלואו לפני תחילת המדידות. נתק את ציוד השכבה מאספקת החשמל, וכסה בשקית חיטוי מפלסטיק.

צור חור בשקית כדי להכניס את האלקטרודה ליציאת הקלט במונה. לאחר מכן רססו את השקית באתנול 70% לפני העברת ציוד השכבה לארון הזרימה. כדי לחטא את האלקטרודה, טבלו את קצות האלקטרודה באתנול 70% למשך 15 דקות.

הניחו לקצוות להתייבש באוויר למשך 15 שניות, ולאחר מכן השתמשו במדיום תרבית תאים כדי לשטוף את האלקטרודה. אפשר לתאים להגיע לטמפרטורת החדר בתוך ארון הזרימה. ודא שהמונה מנותק מהמטען, ולאחר מכן הגדר את מתג המצב לאוהם והפעל את מתג ההפעלה.

מדוד את התנגדות התא על ידי טבילת האלקטרודה עם הקצה הקצר יותר בתוספת והקצה הארוך יותר מחוץ לבאר. שמור את האלקטרודה בזווית של 90 מעלות להכנסת הצלחת. כדי לדמות עיכול דרך הפה, העבירו שלושה מיליליטר מקהילת החיידקים בצינור סטרילי של 50 מיליליטר, וערבבו עם שלושה מיליליטר של נוזל רוק מדומה או SSF.

הוסיפו 75 יחידות למיליליטר של אלפא-עמילאז מרוק אנושי מסוג 9A ושני גרם לליטר מוצין מקיבה חזירית מסוג 2. דוגרים את התערובת בחום של 37 מעלות צלזיוס ו -100 סל"ד למשך שתי דקות. אסוף דגימה של שני מיליליטר למיצוי DNA וכימות ציטומטריית זרימה.

כדי לדמות עיכול קיבה, הוסף ארבעה מיליליטר של נוזל קיבה מדומה או SGF לשלושה מיליליטר של החיידקים. השתמש ב-HCl טוחנת אחת כדי להתאים את ה-pH ל-3 במידת הצורך. דגרו את הדגימה ב-37 מעלות צלזיוס ו-100 סל"ד למשך שתי דקות.

לאחר מכן אסוף דגימה של שני מיליליטר. לעיכול המעי הדק, הוסף לחיידקים ארבעה מיליליטר נוזל מעיים מדומה או SIF. השתמש בנתרן הידרוקסיד כדי להתאים את ה-pH במידת הצורך.

לאחר מכן דגרו את הדגימה ב-37 מעלות צלזיוס ו-100 סל"ד למשך שתי דקות. ולאסוף דגימה של שני מיליליטר. לאחר שטיפה והתאמת צפיפות התאים של עיכול המעי הדק על פי פרוטוקול הטקסט, הסר את המדיום האפיקלי ממערכת הטרנסוול והוסף 1.5 מיליליטר של התרחיף החיידקי.

תרבית משותפת של המערכת בתנאים כלליים של תרבית תאים למשך שעתיים. לאחר הדגירה, מדוד את ערכי השכבה כדי להעריך את שלמות מחסום האפיתל כפי שהודגם קודם לכן בסרטון. הוסף 0.5 מיליליטר של 10 מילי-מולארי n-אצטילציסטאין ו-HPSS כדי להמיס את הריר המיוצר על ידי HT29MTX ולשקם את החיידקים שנדבקו.

דגרו את הצלחות בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה תחת תסיסה. שחזר את ה-NAC HPSS בצינור מיקרו-צנטריפוגה, והשתמש במיליליטר אחד של DPBS כדי לשטוף את התאים פעמיים. הוסף 0.5 מיליליטר של 0.5% טריטון-x100 על גבי החד-שכבות, ושבש את התאים על ידי פיפטינג.

לאחר מכן שחזר במהירות את הנוזל במערבולת למשך דקה אחת. המהירות היא קריטית כדי למנוע פגיעה בתאי החיידקים עם חומר הניקוי. נתח את הדגימות על פי פרוטוקול הטקסט.

כפי שדווח כאן, ספירת התאים השלמים מזנים בודדים הייתה בערך 10 עד 8 תאים למיליליטר לפני יצירת הקהילה הסינתטית, בעוד שהמיקרוקוסמוס הרב-מיני הכיל מעל 90% תאים ברי קיימא במהלך הקמת הקהילה. בהתבסס על כימות חי-מת, כדאיות החיידקים פוחתת לאחר כל שלב עיכול כתוצאה מ-pH חומצי במהלך מעבר הקיבה ושל מלחים ביולוגיים הכלולים בנוזלי העיכול של המעי הדק. התנאים הקשים של עיכול הקיבה והמעי הדק יכולים להפוך חיידקים לתאים ברי קיימא, אך לא בתאים הניתנים לתרבית, שהם חיידקים חיים שאינם גדלים או מתחלקים.

כפי שמודגם באיור זה, תאים ברי קיימא ששוחזרו מהממשק הרירי צבועים בכחול בתרשים הזרימה-ציטומטריה. עם זאת, לא נצפתה צמיחה כאשר דגימות הריר הללו היו מצופות. החלק שבו חיידקים מראים שיעורי כדאיות גבוהים יותר הוא הפסולת התאית כפי שמתגלה על ידי ספירת הלוחות.

מספר המושבות עשוי להיות משתנה, אך נוכחותם של חיידקים פעילים מטבולית נמצאת בדגימות הפחות מדוללות. לאחר פיתוח זה, טכניקה זו יכולה לשמש חוקרים מתחומי הנוטריגנומיקה או הפרמקומיקרוביומיקה כדי לחקור את המארח באופן מיקרוקוסמי. בעקבות פרוטוקול זה, ניתן לבצע טכניקות אחרות כמו טרנסקריפטום או ניתוח מטבולי כדי להשיג הבנה מכניסטית בתהליך הקולוניזציה המוצלח בהתאם.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להקים מודל מורכב במבחנה המייצג את תהליכי העיכול כולל הדיבור ההדדי בין התאים המארחים לשאר המיקרוביום. אל תשכח שעבודה עם חיידקים פתוגניים עלולה להיות מסוכנת ביותר, וחשוב לשקול אמצעי זהירות ביולוגיים.