לשעבר Vivo הדמיית סידן להמחשת התגובות המוח איתות האנדוקרינית ב דרוזופילה

שיטה זו יכולה לסייע לענות על שאלות מפתח בתחום האנדוקרינולוגיה, כמו גם בתחום מדעי המוח, כמו למשל המחקר שלנו לסקירת תגובות המוח לאותות אנדוקריניים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לבחון השפעות ישירות של אותות אנדוקריניים על המוח המופרד מרקמות אחרות. כדי להתחיל בהליך זה, השתמש במלקחיים כדי לגרד את המרכז התחתון של צלחת תרבית פלסטית כדי ליצור שקע להרכבה קלה יותר של הגנגליון הגחוני של מוח הזחל לאחר הדיסקציה.

בעזרת קיסם, הניחו טיפה קטנה של דבק-על משני צידי השקע, והצמידו מוט טונגסטן לדבק. לאחר מכן, בעזרת חתיכה קטנה של דבק רב פעמי דמוי מרק, צור קיר עגול המקיף את השקע. כדי לנתח את מוח הזחל, 90 עד 120 שעות לאחר הטלת הביצים אוספים זחלים ושוטפים אותם לפחות שלוש פעמים במים מזוקקים כדי להסיר שאריות מזון דביקות.

לאחר מכן, הניחו זחל על שעון מרובעת בגודל סנטימטר וחצי מלאה ב-PBS קר כקרח. השתמש בזוג מלקחיים כדי לתפוס בעדינות את החלק האמצעי של הזחל. השתמש בזוג מלקחיים נוסף כדי לתפוס ולמשוך את ווי הפה בעדינות כדי להפריד את החלק הקדמי של הזחל המכיל את המוח משאר הגוף.

לאחר מכן, החזק את הקצה הקדמי עם המלקחיים והפוך את הזחל כלפי חוץ. הסר את הרקמות הזרות המחוברות למוח, כגון דיסקים דמיוניים, גופי שומן ובלוטת הטבעת. הפרד בעדינות את המוח מחלקי הפה.

לאחר מכן, יש למרוח 200 מיקרוליטר PBS על החלק הפנימי של טבעת ההדבקה שהוכנה קודם לכן בתא ההדמיה. מצצו בעדינות את המוח המנותח עם PBS לתוך פיפטה של פסטר, והעבירו אותו לתא ההדמיה. בתא ההדמיה, תפוס את סיבי השריר המשתרעים מגרעיני הגחון והכניס את המוח בעדינות לשקע שמתחת לחוט הטונגסטן.

לאחר מכן, משכו את חוט הטונגסטן מעט כלפי מעלה כדי למקם את המוח במיקום הנכון להדמיה. כדי להשיג תמונות פלואורסצנטיות של סידן, מקם את תא ההדמיה המכיל את צמח המוח מתחת למיקרוסקופ. הורד את עדשת האובייקט עד שהיא נוגעת ב-PBS, ותחת תאורת שדה בהיר מקם את המוח והביא אותו למיקוד.

עבור לאור פלואורסצנטי והתאם את המיקוד על התאים המסומנים בהצלחה של GCaMP. התחל את הרכישה ב-250 אלפיות השנייה למסגרת, ברזולוציה של 512 x 512 פיקסלים במצב מקורר מים. לאחר מכן, התאם את זמן החשיפה כדי לקבל את ערכי הקרינה בטווח הדינמי של מצלמת CCD, אך לא נמוך מ-1000 יחידות שרירותיות עם תמונות של 16 סיביות.

לאחר קביעת פרמטרי ההדמיה, צלם את התמונות למשך דקה אחת לפני מתן פפטיד כדי לזהות עוצמות אות בסיסיות. לאחר מכן, יש למרוח את פפטיד הבדיקה ישירות, על ידי פיפטינג של 100 מיקרוליטר מתמיסת הפפטיד המוכנה לאמבט הזחלים. רשום את פליטת ההצלחה של GCaMP למשך מספר דקות.

כדי לנתח את הנתונים, פתח את תוכנת הניתוח והשתמש במסגרת הראשונה שהייתה לפני יישום הפפטיד כתמונת ייחוס. לאחר מכן, בחר תוספים, TurboReg. בחר את קובץ התמונה הטורית כמקור, ואת תמונת הייחוס כיעד.

לאחר מכן, בדוק את Rigid Body ו-Accurate עבור שיטת העיבוד והאיכות, בהתאמה. לאחר מכן, לחץ על אצווה כדי להתחיל בעיבוד תמונה. בחר אזורי עניין מרובים באמצעות ניתוח, כלים, מנהל החזר ROI במגש התמונות.

לאחר מכן, מדוד את עוצמת הפיקסלים על ידי לחיצה על עוד, רב מדידה, אישור, בחלון מנהל החזר ההשקעה. בניסוי זה, מוח מסוג Wild נחשף ל-CCHa2, גרלין ונוציספטין, בעוד שהמוח המוטנטי של קולטן CCHa2 נחשף ל-CCHa2. אותות GCaMP6 בתאים המייצרים אינסולין זוהו על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית במהירות של 250 אלפיות השנייה למסגרת, והנה תמונות סטילס של נקודות זמן נבחרות.

היחס בין השינוי בעוצמת ה-ROI לעוצמת האות הבסיסית בכל נקודת זמן שורטט. החזר ROI נקבע על גופי תאים שזוהו באותו מישור מוקד. הקווים המוצקים מציינים את הממוצע של חמש עד 10 דגימות, והקווים המקווקוים מסמנים את הגבולות העליונים והתחתונים של שגיאת התקן של הממוצע.

האזורים המוצללים מציינים את השונות של האותות בניסויים. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שעה אחת, אם היא מבוצעת כראוי. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להכין את דגימת המוח במהירות, כדי למנוע נזק לה.

ניתן לשלב הליך זה עם גנטיקה על מנת לענות על שאלות נוספות כמו ספציפיות הקולטן. המערכת המשמשת בפרוטוקול זה קלה להכנה וניתנת לשימוש חוזר. לפיכך, פרוטוקול זה יהיה שימושי עבור, כמו בהקרנה.

לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום האנדוקרינולוגיה ומדעי המוח לחקור רשתות הורמונליות השולטות בתפקוד המוח בדרוזופילה.