לשעבר Vivo הדמיית סידן להמחשת התגובות המוח איתות האנדוקרינית ב דרוזופילה
June 2nd, 2018
מאמר זה מתאר פרוטוקול עבור ex-vivo סידן הדמיה של המוח דרוזופילה . בשיטה זו, תרכובות טבעי או סינתטי ניתן להחיל את המאגר כדי לבחון את היכולת שלהם להפעיל את המסוים הנוירונים במוח.
שיטה זו יכולה לסייע לענות על שאלות מפתח בתחום האנדוקרינולוגיה, כמו גם בתחום מדעי המוח, כמו למשל המחקר שלנו לסקירת תגובות המוח לאותות אנדוקריניים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לבחון השפעות ישירות של אותות אנדוקריניים על המוח המופרד מרקמות אחרות. כדי להתחיל בהליך זה, השתמש במלקחיים כדי לגרד את המרכז התחתון של צלחת תרבית פלסטית כדי ליצור שקע להרכבה קלה יותר של הגנגליון הגחוני של מוח הזחל לאחר הדיסקציה.
בעזרת קיסם, הניחו טיפה קטנה של דבק-על משני צידי השקע, והצמידו מוט טונגסטן לדבק. לאחר מכן, בעזרת חתיכה קטנה של דבק רב פעמי דמוי מרק, צור קיר עגול המקיף את השקע. כדי לנתח את מוח הזחל, 90 עד 120 שעות לאחר הטלת הביצים אוספים זחלים ושוטפים אותם לפחות שלוש פעמים במים מזוקקים כדי להסיר שאריות מזון דביקות.
לאחר מכן, הניחו זחל על שעון מרובעת בגודל סנטימטר וחצי מלאה ב-PBS קר כקרח. השתמש בזוג מלקחיים כדי לתפוס בעדינות את החלק האמצעי של הזחל. השתמש בזוג מלקחיים נוסף כדי לתפוס ולמשוך את ווי הפה בעדינות כדי להפריד את החלק הקדמי של הזחל המכיל את המוח משאר הגוף.
לאחר מכן, החזק את הקצה הקדמי עם המלקחיים והפוך את הזחל כלפי חוץ. הסר את הרקמות הזרות המחוברות למוח, כגון דיסקים דמיוניים, גופי שומן ובלוטת הטבעת. הפרד בעדינות את המוח מחלקי הפה.
לאחר מכן, יש למרוח 200 מיקרוליטר PBS על החלק הפנימי של טבעת ההדבקה שהוכנה קודם לכן בתא ההדמיה. מצצו בעדינות את המוח המנותח עם PBS לתוך פיפטה של פסטר, והעבירו אותו לתא ההדמיה. בתא ההדמיה, תפוס את סיבי השריר המשתרעים מגרעיני הגחון והכניס את המוח בעדינות לשקע שמתחת לחוט הטונגסטן.
לאחר מכן, משכו את חוט הטונגסטן מעט כלפי מעלה כדי למקם את המוח במיקום הנכון להדמיה. כדי להשיג תמונות פלואורסצנטיות של סידן, מקם את תא ההדמיה המכיל את צמח המוח מתחת למיקרוסקופ. הורד את עדשת האובייקט עד שהיא נוגעת ב-PBS, ותחת תאורת שדה בהיר מקם את המוח והביא אותו למיקוד.
עבור לאור פלואורסצנטי והתאם את המיקוד על התאים המסומנים בהצלחה של GCaMP. התחל את הרכישה ב-250 אלפיות השנייה למסגרת, ברזולוציה של 512 x 512 פיקסלים במצב מקורר מים. לאחר מכן, התאם את זמן החשיפה כדי לקבל את ערכי הקרינה בטווח הדינמי של מצלמת CCD, אך לא נמוך מ-1000 יחידות שרירותיות עם תמונות של 16 סיביות.
לאחר קביעת פרמטרי ההדמיה, צלם את התמונות למשך דקה אחת לפני מתן פפטיד כדי לזהות עוצמות אות בסיסיות. לאחר מכן, יש למרוח את פפטיד הבדיקה ישירות, על ידי פיפטינג של 100 מיקרוליטר מתמיסת הפפטיד המוכנה לאמבט הזחלים. רשום את פליטת ההצלחה של GCaMP למשך מספר דקות.
כדי לנתח את הנתונים, פתח את תוכנת הניתוח והשתמש במסגרת הראשונה שהייתה לפני יישום הפפטיד כתמונת ייחוס. לאחר מכן, בחר תוספים, TurboReg. בחר את קובץ התמונה הטורית כמקור, ואת תמונת הייחוס כיעד.
לאחר מכן, בדוק את Rigid Body ו-Accurate עבור שיטת העיבוד והאיכות, בהתאמה. לאחר מכן, לחץ על אצווה כדי להתחיל בעיבוד תמונה. בחר אזורי עניין מרובים באמצעות ניתוח, כלים, מנהל החזר ROI במגש התמונות.
לאחר מכן, מדוד את עוצמת הפיקסלים על ידי לחיצה על עוד, רב מדידה, אישור, בחלון מנהל החזר ההשקעה. בניסוי זה, מוח מסוג Wild נחשף ל-CCHa2, גרלין ונוציספטין, בעוד שהמוח המוטנטי של קולטן CCHa2 נחשף ל-CCHa2. אותות GCaMP6 בתאים המייצרים אינסולין זוהו על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית במהירות של 250 אלפיות השנייה למסגרת, והנה תמונות סטילס של נקודות זמן נבחרות.
היחס בין השינוי בעוצמת ה-ROI לעוצמת האות הבסיסית בכל נקודת זמן שורטט. החזר ROI נקבע על גופי תאים שזוהו באותו מישור מוקד. הקווים המוצקים מציינים את הממוצע של חמש עד 10 דגימות, והקווים המקווקוים מסמנים את הגבולות העליונים והתחתונים של שגיאת התקן של הממוצע.
האזורים המוצללים מציינים את השונות של האותות בניסויים. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שעה אחת, אם היא מבוצעת כראוי. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להכין את דגימת המוח במהירות, כדי למנוע נזק לה.
ניתן לשלב הליך זה עם גנטיקה על מנת לענות על שאלות נוספות כמו ספציפיות הקולטן. המערכת המשמשת בפרוטוקול זה קלה להכנה וניתנת לשימוש חוזר. לפיכך, פרוטוקול זה יהיה שימושי עבור, כמו בהקרנה.
לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום האנדוקרינולוגיה ומדעי המוח לחקור רשתות הורמונליות השולטות בתפקוד המוח בדרוזופילה.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה כללית
המחקר הנוכחי מציג פרוטוקול לצילום סידן אקס-ויוו של מוחו של הדרוזופילה, במטרה לחקור את התגובות הנוירוניות לאותות אנדוקריניים. השיטה מאפשרת לבדוק תרכובות טבעיות או סינתטיות כדי להפעיל נוירונים ספציפיים, ומספקת תובנות לגבי החיתוכים בין אנדוקרינולוגיה למדעי המוח.
רכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- מדעי המוח
- אנדוקרינולוגיה
- נוירוביולוגיה של דרוזופילה
רקע
- המחקר חוקר את ההשפעות הישירות של אותות אנדוקריניים על המוח.
- משתמש בדרוזופילה כדי לספק מודל להבנת רשתות הורמונליות.
- מתמקד באופן שבו פפטידים ספציפיים יכולים להשפיע על הפעלת נוירונים.
- ביסס את הבסיס למחקר נוסף על ספציפיות הקולטן.
מטרת המחקר
- לפתח פרוטוקול המאפשר הערכת תגובות המוח לאותות אנדוקריניים.
- לאפשר לחוקרים לבחון פעילות נוירונית בנפרד מרקמות אחרות.
- להקל על סינון תרכובות שעלולות להשפיע על התפקוד הנוירוני.
שיטות ששימשו
- השיטה כוללת ניתוח והדמיה של מוח הזחל של דרוזופילה באמצעות מדדי סידן.
- הזחלים נאספים ומוכנים להדמיה בערך 90-120 שעות לאחר הטלת הביצים.
- פרמטרים להדמיית פלואורסצנטית של סידן נקבעים, ומאפשרים תצפית מפורטת על פעילות נוירונית.
- יישום פפטידים לבדיקה מאפשר מדידה של אותות התגובה של המוח לאורך זמן.
תוצאות עיקריות
- הדמיה מוצלחת של אותות GCaMP6 מגלה הפעלה נוירונית בתגובה לפפטידים שונים.
- ניתוח סטטיסטי משלב עוצמת אותות בסיס כדי להעריך את התגובות הנוירוניות לאחר החלת הפפטידים.
- התוצאות מאשרות את התועלת של טכניקה זו לחקר השליטה ההורמונלית על תפקוד המוח.
מסקנות
- מחקר זה מדגים פרוטוקול בעל ערך לחקר ההשפעה האנדוקרינית על פעילות נוירונית בדרוזופילה.
- הוא מאפשר חקר ספציפיות הקולטן ורשתות הורמונליות במחקר מדעי המוח.
- ההשלכות מתפרשות להבנת הפלסטיות והמנגנונים העומדים בבסיס התפקוד והתגובות של המוח.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Ex vivo calcium imaging in Drosophila brain explants enables direct visualization of neuronal responses to endocrine signals, supporting mechanistic de-risking in early discovery. This approach isolates brain-specific effects of peptide hormones, providing predictive confidence for target validation and pathway interrogation. The method's adaptability and quantitative outputs position it as a reusable capability for neuroendocrine research pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of hormone-receptor interactions in neural tissue.
- Supports functional target validation by isolating brain responses from peripheral confounders.
- Facilitates mechanistic de-risking through quantitative calcium signal measurement.
- Provides predictive confidence for advancing neuroendocrine targets.
Screening & Assay Development
- Prepares validated brain explant systems for compound or peptide screening.
- Delivers reproducible, quantitative fluorescence readouts for assay standardization.
- Enables scalable screening of water-soluble molecules affecting neural activation.
- Supports platform reuse across different peptides and genetic backgrounds.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant neuroendocrine pathways for translational biomarker exploration.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation of hormone-brain interactions.
- De-risks advancement decisions by providing direct evidence of neural activation mechanisms.
Pipeline & Workflow Integration
This ex vivo imaging method bridges early discovery and lead identification by enabling hypothesis-driven testing of endocrine signaling in neural circuits.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of peptide hormone effects on brain activity.
- Screening: Provides assay-ready explant systems with reproducible, quantitative outputs.
- Analytics: Generates time-resolved fluorescence data for robust statistical comparison of conditions.
- Translational Research: Facilitates alignment with neuroendocrine biomarkers relevant to disease models.
- Enterprise Reuse: Adaptable for other organs or species, enhancing cross-program utility.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neuroendocrine target validation.
- Operational Value: Standardizes imaging and analysis workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and improves capital efficiency by clarifying direct brain responses.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neuroendocrine targets and pathways.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila genetics and neuroanatomy for precise dissection and imaging.
- Needs access to spinning disc confocal microscopy and quantitative image analysis software.
- Demands cross-team standardization of imaging parameters and data analysis protocols.
- Adaptable to other organs or animal models with chamber modifications.
- Sample preparation speed and tissue integrity are critical for reliable results.
