Name: לשעבר Vivo הדמיית סידן להמחשת התגובות המוח איתות האנדוקרינית ב דרוזופילה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 49 s
Description: למדו הדמיית סידן ex vivo במוח Drosophila לחקירת תגובות נוירונליות לאותות אנדוקריניים. שיטה זו מאפשרת לבחון השפעות ישירות של הורמונים על המוח בנפרד מרקמות אחרות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו היה נתמך על ידי Grants-in-Aid למחקר מדעי (15K 07147, 17K 07419) מ- JSPS (כדי הירושי Ishimoto, סנו לובה פריז), על Inamori קרן המחקר מענק (איץ ' אי), ואת התוכנית של המרכז השימוש/מחקר משותף ללימודי רפואה התפתחותית, ב המכון אמבריולוגיה מולקולרית, גנטיקה, קאמאמוטו אוניברסיטת (HS). אנו מודים ד ר אזוסה Kamikouchi, מר דאיצ'י יאמאדה לעזרה שלהם באמצעות מערכת הדמיה.

1. הכנת המוח זחל Explants
<ol><li>להפוך חדר הדמיה. הערה: הקלטה יציבה מחייבת explants המוח להיות קשורה. . הנה, תא הדמיה נמוכים, בעבודת יד משמש את Ca2 + מערכת הדמיה.<ol>
<li>באמצעות מלקחיים, לגרד במרכז תחתית לצלחת פלסטיק תרבות (35 מ"מ x 10 מ"מ) כדי ליצור גומה עבור גנגליון הגחוני של המוח זחל שהופך הרכבה קלה יותר (שלב 1.3, איור 1).</li>
		<li>עם קיסם, במקום טיפה קטנה של דבק מגע על צדי השקע וחבר מוט טונגסטן (0.125 מ"מ קוטר, 6-7 מ מ אורך) הדבק.</li>
		<li>באמצעות פיסה קטנה של דבק לשימוש חוזר, כמו מרק, יצירת קיר עגול (10 מ מ בקוטר של 3 מ מ) סביב השקע שנוצר (איור 1). הערה: החלל בתוך הקיר אחר כך יתמלא buffered פוספט תמיסת מלח (PBS; 0.14 M NaCl, 0.0027 M אשלגן כלורי, פו40.01 M3 -, pH 7.4 ± 0.05 25 ° c).</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכנת בעלי חיים הערה: עבור הדמיה סידן, מחוון סידן, GCaMP6s, מתבטאת בסוג התא של עניין, אשר בדרך כלל מושגת באמצעות שילובים של רקמות ספציפיות GAL4 ו UAS-GCaMP6s. כדי להבטיח כי האות מתווך באמצעות הקולטן המועמד, GCaMP6s מתבטאת גם מוטציה פגומה של הקולטן.<ol>
<li>כאשר השוואות ניסיוני עבור אחרים שונים כגון סוג הפרוע מוטציות נדרשים, הזחלים מבחן התאמה גיל כדי להימנע GCaMP6 ביטוי ברמה וריאציות, הבדלים פיזיולוגיים עקב שלבים התפתחותיים.</li>
		<li>שמור הורים זבובים (30 זבובים לסקס כל) מבחנה אחת תרבות המכיל מזון לטוס סטנדרטי עבור 8 שעות לאפשר הטלת ביצים על פני השטח של המזון. הזחלים תרבות המונית תחת מחזור בהירה-כהה 12-h ב- 25 ° C ו- 60-70% לחות יחסית.</li>
	</ol>
</li>
	<li>דיסקציה של המוח זחל<ol>
<li>90-120 h לאחר ביצה הנחת (AEL), לאסוף את הזחלים, לשטוף אותם לפחות 3 פעמים עם מים מזוקקים להסרת פסולת מזון חסיד.</li>
		<li>המקום זחל על זכוכית השעון סקוור 1.5 אינץ מלא PBS קר קרח. הערה: השלבים שני הבא מתבצעות בכוס הזו לצפות במיקרוסקופ ויבתר.</li>
		<li>להשתמש מלקחיים לאחוז בעדינות את החלק האמצעי של הזחל. להשתמש מלקחיים אחר כדי לתפוס את הווים הפה ומשוך את הווים הפה בעדינות כדי להפריד בין החלק הקדמי של הזחל המכיל את המוח משאר חלקי הגוף. הערה: לחלופין, מספריים כירורגיים יכול לשמש.</li>
		<li>להחזיק את הקצה הקדמי על ידי מלקחיים ופנו הזחל מבפנים החוצה. הסרת רקמת חיצוני המחובר אל המוח, כגון דיסקים דמותי, שומן הגוף ובלוטת טבעת. בעדינות להפריד בין המוח לבין mouthparts.</li>
		<li>µL 200 ל- PBS חלות על החלק הפנימי של הטבעת עשוי דבק לשימוש חוזר דבק שפכטל דמוי בבית הבליעה הדמיה. למצוץ בעדינות את המוח ביתור עם PBS לתוך פיפטה פסטר, ולאחר מכן להעביר אותו לחדר ההדמיה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הגדרת המוח לחדר ההדמיה<ol>
<li>להשתמש מלקחיים לתפוס סיבי השריר המשתרעת הגרעינים הגחון. הכנס המוח בעדינות לתוך השקע שנוצר מתחת לגדר טונגסטן.</li>
		<li>באמצעות מלקחיים אחר, משוך החוט טונגסטן מעט עד מקום המוח במיקום הנכון הדמיה (איור 1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. רכישת Ca2 + זריחה תמונות
הערה: המוח explants שקוע PBS הם צילמו באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות מצויד 20 X עדשה המטרה טבילה במי (נ. א = 0.5). PBS אינו מפעיל תאים במוח. אם ציר z תמונות נדרשים, העדשה המטרה נטענה עם mover עדשה פיזואלקטריים מופעל. ראש ספינינג דיסק קונאפוקלית משמש כדי לשפר את הרזולוציה זמן. עבור תאורה הדמיה, אלקטרון הכפלת תשלום מצמידים מכשיר המצלמה נטענה על המיקרוסקופ. ההדמיה של זריחה GCaMP6s (עירור/פליטה: 488/509 ננומטר) דורש 488 ננומטר לייזר עבור עירור עם מפצל קרן ודיקרואיק זוהר, מסנן פליטה (למשל., 528 ± 38 nm הלהקה bandpass מסנן).
<ol><li>המקום תא הדמיה המכיל את explant המוח מתחת למיקרוסקופ.</li>
	<li>. תוריד את העדשה המטרה עד שייגע מגניב. תחת תאורה בהירים-שדה, מקם את המוח ולהביא אותה לידי המוקד. לעבור אור ניאון והתאימו את המוקד על תאים התווית על-ידי GCaMP6s. הערה: קרינה פלואורסצנטית ירוק הבזליים של GCaMP6s צריכים להיות גלויים.</li>
	<li>התחלה רכישה ב 250 ms/מסגרת ברזולוציה של 512 × 512 פיקסלים במצב water-cooled באמצעות התוכנה רכישת המתאים (למשל., µManager). להתאים את זמן החשיפה להשיג ערכי פלורסצנטיות בתוך הטווח הדינמי של מצלמה CCD, אבל לא נמוכה יותר 1000 (יחידות שרירותיות), עם תמונות 16 סיביות (טווח דינמי 0-65,535). הערה: זמן חשיפה נמוכה אמור לשמש כדי למזער את הלבנת לצילום של GCaMP6s. זמן החשיפה צריך להיות מוטבת ניסוי זה תלוי רמות הביטוי של GCaMP6 ואת הרגישות של מערכת זיהוי. . זה היה 100 ms שלנו באמצעות ניסוי dilp2 > GCaMP6s. כאשר z-סעיפים הנדרשים עבור עומק הדמיה נתון, ניתן לרכוש מספר תמונות z-סעיף בהתאם מרווחי הזמן ומסגרת של חשיפה. אם המצלמה יש מספיק רזולוציה מרחבית, גודל binning (מספר הקופות על השבב זה להיות מנופה לתוך פיקסל דיגיטלית אחד) צריך להיות מוגברת כדי לצמצם את זמן החשיפה.</li>
	<li>ברגע דימות פרמטרים נקבעים, לקחת את תמונות עבור 1 דקות לפני פפטיד המינהל כדי לזהות עוצמות האות הבסיסית (F0).</li>
	<li>להחיל את מבחן פפטיד; בשביל זה, להמיס 100 µL של פתרון פפטיד PBS, pipette זה ישירות לתוך האמבט זחל להניב תשואה של ריכוז אופטימלי. הערה: הפתרון פפטיד צריך להיות מוזרק לאט (למשל, תזרים שיעור 20 µL/s) בתוך תמיסת אמבט באמצעות פיפטה של. לא קשורים פפטיד סינתטי מומס PBS משמש פקד שלילי.</li>
	<li>להקליט את פליטת GCaMP6s לכמה דקות.</li>
</ol>3. ניתוח נתונים
הערה: הדמיה הנתונים מנותחים במצב לא מקוון עם ImageJ. במהלך ההדמיה זמן לשגות, pipetting גורמת למוח זחל להזיז. לכן, יש לתקן סטיות לפי מיקום של תמונות טורי לפני ניתוח. התיקון יכול להתבצע באמצעות ImageJ של התוספת, TurboReg כפי שמוצג להלן.
<ol><li>פתח את תוכנת ניתוח ועושים שימוש המסגרת הראשונה (לפני יישום פפטיד) תמונת ייחוס.</li>
	<li>בחר תוספים | רישום | TurboReg.</li>
	<li>לבחור את קובץ התמונה טורי מקור התמונה התייחסות היעד.</li>
	<li>בדוק אם גוף קשיח (מקביל הזחה וסיבוב של תמונות), מדויקות ("מהיר" הוא גס אבל ניתוח מהיר במקום) שיטת העיבוד ואת איכות, בהתאמה.</li>
	<li>לחץ על אצווה כדי להפעיל את העיבוד תמונה.</li>
	<li>בחר אזורים מרובים עניין (ROIs) באמצעות נתח | כלים | רועי מנהל ב ImageJ.</li>
	<li>למדוד את עוצמת פיקסל על ידי לחיצה על יותר | ריבוי אמצעי | טוב בחלון מנהל רועי.</li>
	<li>חישוב ΔF/F0 = (F - F0) /F0, כאשר F הוא עוצמת ROI בזמן הגירוי ו- F0 היא עוצמת-חלון זמן מיד לפני אירוע מסוים ניסיוני (למשל, 30 מסגרות מקדים תחילת גירוי).</li>
	<li>חזור על הניסוי באמצעות דגימות מוח מרובים, בניהול עיבוד סטטיסטי של הנתונים כדי לקבל ממוצע של שגיאת התקן של הממוצע (SEM) בכל נקודה בזמן.</li>
</ol>

<ol><li>Morton, G. J., Schwartz, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptin+and+the+central+nervous+system+control+of+glucose+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Leptin and the central nervous system control of glucose metabolism.</a> Physiological Reviews. 91 (2), 389-411 (2011).</li>
<li>Stanley, S., Wynne, K., McGowan, B., Bloom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormonal+regulation+of+food+intake%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Hormonal regulation of food intake.</a> Physiological Reviews. 85 (4), 1131-1158 (2005).</li>
<li>Goodman, W. G., Cusson, M. The juvenile hormones. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B9780123847492100081">Insect Endocrinology</a>. Gilbert, L. I. , Academic Press. 310-365 (2012).</li>
<li>Lafont, R., Dauphin-Villemant, C., Warren, J. T., Rees, H. Ecdysteroid chemistry and biochemistry. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B9780123847492100044">Insect Endocrinology</a>. Gilbert, L. I. , Academic Press. 106-176 (2012).</li>
<li>Smith, W., Rybczynski, R. Protothoracicotropic hormone. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B9780123847492100019">Insect Endocrinology</a>. Gilbert, L. I. , Academic Press. 1-62 (2012).</li>
<li>Claeys, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+neuropeptide+and+peptide+hormone+receptors%3A+current+knowledge+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Vitamins+and+Hormones%22%5BJournal%5D)">Insect neuropeptide and peptide hormone receptors: current knowledge and future directions.</a> Vitamins and Hormones. 73, 217-282 (2005).</li>
<li>Gade, G., Goldsworthy, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+peptide+hormones%3A+a+selective+review+of+their+physiology+and+potential+application+for+pest+control%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Management+Science%22%5BJournal%5D)">Insect peptide hormones: a selective review of their physiology and potential application for pest control.</a> Pest Management Science. 59 (10), 1063-1075 (2003).</li>
<li>Adams, M. D., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10731132">The genome sequence of Drosophila melanogaster.</a> Science. 287 (5461), 2185-2195 (2000).</li>
<li>Park, D., Veenstra, J. A., Park, J. H., Taghert, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+peptidergic+cells+in+Drosophila%3A+where+DIMM+fits+in%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mapping peptidergic cells in Drosophila: where DIMM fits in.</a> PLoS One. 3 (3), 1896(2008).</li>
<li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8381210">Inositol trisphosphate and calcium signalling.</a> Nature. 361 (6410), 315-325 (1993).</li>
<li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+signal-to-noise+Ca%282%2B%29+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).</li>
<li>Rulifson, E. J., Kim, S. K., Nusse, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ablation+of+insulin-producing+neurons+in+flies%3A+growth+and+diabetic+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Ablation of insulin-producing neurons in flies: growth and diabetic phenotypes.</a> Science. 296 (5570), 1118-1120 (2002).</li>
<li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
<li>Nassel, D. R., Kubrak, O. I., Liu, Y., Luo, J., Lushchak, O. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+that+regulate+insulin+producing+cells+and+their+output+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Factors that regulate insulin producing cells and their output in Drosophila.</a> Frontiers in Physiology. 4, 252(2013).</li>
<li>Sano, H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26020940">The Nutrient-Responsive Hormone CCHamide-2 Controls Growth by Regulating Insulin-like Peptides in the Brain of Drosophila melanogaster.</a> PLoS Genetics. 11 (5), 1005209(2015).</li>
<li>Tsao, C. K., Ku, H. Y., Lee, Y. M., Huang, Y. F., Sun, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+Term+Ex+Vivo+Culture+and+Live+Imaging+of+Drosophila+Larval+Imaginal+Discs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Long Term Ex Vivo Culture and Live Imaging of Drosophila Larval Imaginal Discs.</a> PLoS One. 11 (9), 0163744(2016).</li>
<li>Sabado, V. aN., Nagoshi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+Resolution+Fluorescence+Live+Imaging+of+Drosophila+Circadian+Clocks+in+Larval+Brain+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. 131, e57015(2018).</li>
<li>Apostolopoulou, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caffeine+Taste+Signaling+in+Drosophila+Larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Caffeine Taste Signaling in Drosophila Larvae.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 193(2016).</li>
<li>Cao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+targeted+optical+electrophysiology+in+intact+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genetically targeted optical electrophysiology in intact neural circuits.</a> Cell. 154 (4), 904-913 (2013).</li>
<li>Nikolaev, V. O., Bunemann, M., Hein, L., Hannawacker, A., Lohse, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+single+chain+cAMP+sensors+for+receptor-induced+signal+propagation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Novel single chain cAMP sensors for receptor-induced signal propagation.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (36), 37215-37218 (2004).</li>
<li>Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+pHluorins+for+optical+measurements+of+presynaptic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">The use of pHluorins for optical measurements of presynaptic activity.</a> Biophysical Journal. 79 (4), 2199-2208 (2000).</li>
<li>Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+minimal+hemolymph-like+solution%2C+HL3.1%2C+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurogenetics%22%5BJournal%5D)">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> Journal of Neurogenetics. 18 (2), 377-402 (2004).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

Ca2 + הדמיה בשיטה המתוארת כאן היא מערכת שימושית לבדיקה את הפונקציה של הורמונים במוח. אין ויוו, המוח מקבל הורמונים של האורגנים האנדוקרינית. בנוסף, המוח רואה כל הזמן עולה המידע החושי, הגורמת הפעלה עצביים ספונטנית. מערכת זו שמחוץ מבטל רעש נורא ותשואות יחס אות/רעש טוב יותר מאשר ויוו הדמיה. במערכת זו, ניתן לבדוק מולקולות ביחידים או במשולב. בנוסף פפטיד ההורמונים, כל מולקולות מסיסים במים, כולל תרכובות טבעיים או סינתטיים, ניתן ליישם את explant במוח.
עבור Ca2 ...

עוגב-כדי-איבר תקשורת היא אסטרטגיית אבולוציונית שנשמרת על שמירה על הומאוסטזיס להתמודד עם שינויים סביבתיים. בבני אדם, מגוון רחב של הורמונים arereleased של בלוטות אנדוקריניות למחזור. רבים של הורמונים אלה יעד ההיפותלמוס במוח, אשר מווסת תהליכים מטבוליים והתנהגויות יסוד כגון האכלה1,2. הורמונים רבים כבר גילו באמצעות מודלים בתרבית. עם זאת, מנגנוני הפעולה שלהם, במיוחד הרשתות interorgan בהם הם משתתפים, נותרו בלתי ברורים במידה רבה.
דרוזופילה melanogaster התפתחה מודל שימושי עבור לימוד אורגן-כדי-איבר תקשורת. בחרקים, תהליכים פיזיולוגיים רבים נשלטים על ידי הורמונים. לימודי התמקדות צמיחה ושינוי צורה להשתמש חרקים גדולים. במחקרים אלה, הסרה או השתלת איברים ספציפיים ניבא את קיומו של מולקולות איתות בין איברים; מאוחר יותר, הורמון נעורים (JH), הורמון Prothoracicotropic (PTTH) Ecdysone היו מבחינה ביוכימית מטוהרים3,4,5. משפחה גדולה של פפטידים איתות המערכת נחשב להיות מעורבים באירועים פיזיולוגיים שונים במהלך מחזור חיי חרק6,7. רוב פפטידים אלה פועלים על G-חלבון בשילוב קולטנים (GPCRs), למרות GPCRs ספציפי היו בתחילה קשה לזהות באמצעות גישות קונבנציונליות. הפרסום של רצף הגנום כולו דרוזופילה 8 היה פריצת הדרך שאיפשר את הזיהוי של פפטידים ביו דרוזופילה בהתבסס על שלהם הומולוגיה לאלה שנמצאו ושאר חרקים. בנוסף, קולטני עבור מספר פפטידים אותרו מ GPCRs חזה הגנום באמצעות מבחני הכריכה GPCR-ליגנד המבוססות על התא-תרבות. בשלב הבא, ביטוי ניתוח חזה המסלולים איברים-כדי-איבר שהפיק אלה פפטידים, קולטנים. ראוי לציין, רבים של קולטני פפטיד בשם באים לידי ביטוי במוח, רומז המוח הוא יעד מרכזי של פפטיד ההורמונים9. יתר על כן, כלים גנטיים מתקדמים בדרוזופילה תרמו זיהוי תפקידים פיזיולוגיים של שילובים פפטיד-GPCR. למשל, GAL4 ואת לקסה בינארי תעתיק מערכות מבוססות להפעיל גנים או ביטוי בצורה מבוקרת במרחב של חנותם. GAL4, גורם שעתוק שזוהתה שמרים, נקשר לרצף cis-רגולציה ספציפי שנקרא רצף ההפעלה נגד הזרם (UAS). במערכת GAL4/UAS, הקו מנהל התקן מספק רקמות ספציפיות או ביטוי GAL4 שלב ספציפי לבין הקו המשיב נושא UAS במעלה הזרם של הגן מעניינים או הבונה לביטוי shRNA נסיעה. לקסה/LexAop מערכת מבוססת על מנגנון דומה. ניתוחים פנוטיפי של פפטיד-נוקאאוט רקמות ספציפיות ובעלי GPCR-נוקאאוט רקמות ספציפיות יכול לחשוף מידע אודות מצב של פפטיד-GPCR באיתות האתר של פעילות. אולם, המסקנות כי ניתן להגיע אך ורק על ידי מידע גנטי מוגבלים. מצד שני, ברגע בשם היעד של הורמון מסוים הוא צימצמת לסוג הרקמה או תא, שמחוץ סידן דימות in איברים explants ניתן להבהיר את התקשורת איברים-כדי-איבר מתווכת על-ידי איתות פפטיד-GPCR. בעת ההפעלה של GPCR מצמידים Gq, הריכוז2 + Ca תאיים גדל בשל שחרורו של Ca2 + מ ה ER10. במוח, הפעלה עצבית גם מעלה רמות2 + Ca תאיים. Ca2 + עליות כאלה ניתן להבחין באמצעות חיישן סידן, GCaMP, אשר עובר שינויים הסתגלותי בנוכחות Ca2 + וכתוצאה מכך פליטת קרינה פלואורסצנטית11.
במאמר זה מתואר של סידן שיטת הדמיה באמצעות המוח דרוזופילה explants. כדי לבדוק את היכולת של פפטיד להפעלת נוירונים ספציפיים, פפטיד המבחן חל את explant המוח לבטא GCaMP, שינויים פלורסצנטיות המפוקחים על-ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. המעורבות של GPCR אז אושר על ידי ביצוע וזמינותו אותו באמצעות מוח מוטציה חסר את GPCR. שילוב זה של הדמיה וגנטיקה מספק מידע מדויק על איבר-כדי-איבר תקשורת על-ידי פפטידים-GPCRs. האפשר שינויים ויישומים של פרוטוקול זה נדונות גם.

<table><tbody><tr><td>מערכות מוט טונגסטן</td><td>A-M, Sequim, WA, ארה"ב</td><td>717000</td><td></td></tr><tr><td>Blu Tack</td><td>Bostik, פריז, צרפת</td><td>3049100</td><td>דבקים לשימוש חוזר דמויי שפכטל</td></tr> זכוכית <tr><td>שעון, מרובעת, 1 5/8</td><td>בחברת האספקה הביולוגית של קרוליינה, ברלינגטון, קרוליינה הצפונית, ארה"</td>ב <td>742300</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>TAKARA Bio Inc., Kusatsu, Shiga, יפן</td><td>T900</td><td>מלחים חוצצים פוספטים</td></tr><tr><td>CCHa2</td><td>SCRUM Inc., טוקיו, יפן</td><td></td><td>פפטיד מסונתז Custum</td></tr><tr><td>Ghrerin</td><td>Peptide institute Inc., אוסקה, יפן</td><td>4372-s</td><td></td></tr><tr><td>Nociceptin</td><td>Peptide institute Inc., אוסקה, יפן</td><td>4313-v</td><td></td></tr><tr><td>Axio Imager A2</td><td>Carl Zeiss, Oberkochen, גרמניה</td><td>Axio Imager A2</td><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי</td></tr><tr><td>Objective W N-Achroplan 20x/0.5 M27</td><td>Carl Zeiss, אוברקוכן, גרמניה</td><td>420957-9900-000</td><td>עדשת אובייקט טבילה במים</td></tr><tr><td>P-725 PIFOC סורק אובייקטיבי עם טווח נסיעה ארוך</td><td>Physik Instrumente GmbH & Co. KG, קרלסרוהה, גרמניה</td><td>N/A</td> יחידת סורק קונפוקלי <td>המופעלת על ידי פיזואלקטרי</td></tr><tr><td>CSU-W1</td><td>תאגיד החשמל יוקוגאווה, טוקיו, יפן</td><td>CSU-W1</td><td>ראש קונפוקלי דיסק מסתובב</td></tr><tr><td>ImagEM C9100-13</td><td>Hamamatsu Photonics, סיזואוקה, יפן</td><td>C9100-13</td><td>EM-CCD מצלמה</td></tr><tr><td>OBIS 488 ננומטר LS 60 mW</td><td>קוהרנטי, סנטה קלרה, קליפורניה, ארה"ב</td><td>1178770</td><td>לייזר 488 ננומטר 488</td></tr><tr><td>/568/647 ננומטר מפצל קרן דיכרואי יוקוגאווה</td><td>סמרוק, רוצ'סטר, ניו יורק, ארה"ב</td><td>Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5</td><td>מפצל קרן דיכרואי</td></tr><tr><td>528/38 ננומטר BrightLine מסנן פס פס יחיד</td><td>סמרוק, רוצ'סטר, ניו יורק, ארה"ב</td><td>FF01-528/ 38-25</td><td>מסנן פליטה</td></tr> <tr><td>ומיקרו; מנהל</td><td>Open Imaging, Inc.</td><td>N/A</td><td>https://micro-manager.org</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>U.S. המכונים הלאומיים לבריאות</td><td>N/A</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr> <tr><td>TurboReg</td><td>Philippe Th&eacute; venaz, קבוצת הדמיה ביומדיקלית, המכון הטכנולוגי הפדרלי השוויצרי לוזאן</td><td>N/A</td><td>http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/</td></tr></tbody></table>

לשעבר vivo הדמיית סידן להמחשת התגובות המוח איתות האנדוקרינית ב דרוזופילה

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

עוגב-כדי-איבר תקשורת על-ידי איתות האנדוקרינית, לדוגמה, מהפריפריה למוח חיונית על שמירה על הומאוסטזיס. כחיה דגם למחקר האנדוקרינית, דרוזופילה melanogaster, אשר מורכבת גנטי כלים ומידע הגנום, משמשת יותר ויותר. מאמר זה מתאר שיטת ההדמיה סידן של explants המוח דרוזופילה . שיטה זו מאפשרת זיהוי ישיר באיתות של הורמון במוח. זה ידוע כי רבים פפטיד ההורמונים לפעול דרך G-חלבון בשילוב קולטנים (GPCRs), הפעלת אשר גורמת לעלייה בריכוז2 +Ca תאיים. הפעלה עצבית גם מגביה תאיים Ca2 + רמות, Ca2 + זרם והן על שחרורו של Ca2 + המאוחסן תוך-פלזמית (ER). חיישן סידן, GCaMP, באפשרותך לפקח על Ca2 + שינויים אלה. בשיטה זו, GCaMP מתבטאת הנוירונים עניין, וה -המוח זחל GCaMP-לבטא ביתר תרבותי ex-vivo. מבחן פפטיד מחילה על explant המוח, שינויים פלורסנט GCaMP מזוהים באמצעות ספינינג דיסק מיקרוסקופ קונפוקלי מצויד with a מצלמה CCD. באמצעות שיטה זו, ניתן לבחון את כל מולקולה מסיסים במים, הסלולר אירועים שונים הקשורים עם הפעלה עצבית יכולה לדימות באמצעות האינדיקטורים פלורסנט המתאים. יתר על כן, על-ידי שינוי התא הדמיה, ניתן בשיטה זו לשיקוף איברים דרוזופילה אחרים או האברים של בעלי חיים אחרים.

באמצעות פרוטוקול זה, נבחן את ההפעלה של מייצרי אינסולין תאי המוח (IPCs) על ידי הורמון פפטידי, CCHa2. IPCs של המוח פראי-סוג הודבקו תוויות עם GCaMP6s באמצעות שילוב של dilp2 -GAL412 (מתנה רוליפסון ד ר), UAS-GCaMP6s13 (מתנה ד ר קים). Explants המוח זחל שטופלו פפטיד CCHa2 סינתטי, הוקלט על ידי קרינה פלואורסצנטית מ- GCaMP6s בזמן אמת. בניסוי זה, תמונות, התקבלו מוקד מטוס בודד. כל אשכול IPC מכילה תאים בסביבות 1414</su...

מאמר זה מתאר פרוטוקול עבור ex-vivo סידן הדמיה של המוח דרוזופילה . בשיטה זו, תרכובות טבעי או סינתטי ניתן להחיל את המאגר כדי לבחון את היכולת שלהם להפעיל את המסוים הנוירונים במוח.

לשעבר Vivo הדמיית סידן להמחשת התגובות המוח איתות האנדוקרינית ב דרוזופילה

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

שיטה זו יכולה לסייע לענות על שאלות מפתח בתחום האנדוקרינולוגיה, כמו גם בתחום מדעי המוח, כמו למשל המחקר שלנו לסקירת תגובות המוח לאותות אנדוקריניים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לבחון השפעות ישירות של אותות אנדוקריניים על המוח המופרד מרקמות אחרות. כדי להתחיל בהליך זה, השתמש במלקחיים כדי לגרד את המרכז התחתון של צלחת תרבית פלסטית כדי ליצור שקע להרכבה קלה יותר של הגנגליון הגחוני של מוח הזחל לאחר הדיסקציה.בעזרת קיסם, הניחו טיפה קטנה של דבק-על משני צידי השקע, והצמידו מוט טונגסטן לדבק. לאחר מכן, בעזרת חתיכה קטנה של דבק רב פעמי דמוי מרק, צור קיר עגול המקיף את השקע. כדי לנתח את מוח הזחל, 90 עד 120 שעות לאחר הטלת הביצים אוספים זחלים ושוטפים אותם לפחות שלוש פעמים במים מזוקקים כדי להסיר שאריות מזון דביקות.לאחר מכן, הניחו זחל על שעון מרובעת בגודל סנטימטר וחצי מלאה ב-PBS קר כקרח. השתמש בזוג מלקחיים כדי לתפוס בעדינות את החלק האמצעי של הזחל. השתמש בזוג מלקחיים נוסף כדי לתפוס ולמשוך את ווי הפה בעדינות כדי להפריד את החלק הקדמי של הזחל המכיל את המוח משאר הגוף.לאחר מכן, החזק את הקצה הקדמי עם המלקחיים והפוך את הזחל כלפי חוץ. הסר את הרקמות הזרות המחוברות למוח, כגון דיסקים דמיוניים, גופי שומן ובלוטת הטבעת. הפרד בעדינות את המוח מחלקי הפה.לאחר מכן, יש למרוח 200 מיקרוליטר PBS על החלק הפנימי של טבעת ההדבקה שהוכנה קודם לכן בתא ההדמיה. מצצו בעדינות את המוח המנותח עם PBS לתוך פיפטה של פסטר, והעבירו אותו לתא ההדמיה. בתא ההדמיה, תפוס את סיבי השריר המשתרעים מגרעיני הגחון והכניס את המוח בעדינות לשקע שמתחת לחוט הטונגסטן.לאחר מכן, משכו את חוט הטונגסטן מעט כלפי מעלה כדי למקם את המוח במיקום הנכון להדמיה. כדי להשיג תמונות פלואורסצנטיות של סידן, מקם את תא ההדמיה המכיל את צמח המוח מתחת למיקרוסקופ. הורד את עדשת האובייקט עד שהיא נוגעת ב-PBS, ותחת תאורת שדה בהיר מקם את המוח והביא אותו למיקוד.עבור לאור פלואורסצנטי והתאם את המיקוד על התאים המסומנים בהצלחה של GCaMP. התחל את הרכישה ב-250 אלפיות השנייה למסגרת, ברזולוציה של 512 x 512 פיקסלים במצב מקורר מים. לאחר מכן, התאם את זמן החשיפה כדי לקבל את ערכי הקרינה בטווח הדינמי של מצלמת CCD, אך לא נמוך מ-1000 יחידות שרירותיות עם תמונות של 16 סיביות.לאחר קביעת פרמטרי ההדמיה, צלם את התמונות למשך דקה אחת לפני מתן פפטיד כדי לזהות עוצמות אות בסיסיות. לאחר מכן, יש למרוח את פפטיד הבדיקה ישירות, על ידי פיפטינג של 100 מיקרוליטר מתמיסת הפפטיד המוכנה לאמבט הזחלים. רשום את פליטת ההצלחה של GCaMP למשך מספר דקות.כדי לנתח את הנתונים, פתח את תוכנת הניתוח והשתמש במסגרת הראשונה שהייתה לפני יישום הפפטיד כתמונת ייחוס. לאחר מכן, בחר תוספים, TurboReg. בחר את קובץ התמונה הטורית כמקור, ואת תמונת הייחוס כיעד.לאחר מכן, בדוק את Rigid Body ו-Accurate עבור שיטת העיבוד והאיכות, בהתאמה. לאחר מכן, לחץ על אצווה כדי להתחיל בעיבוד תמונה. בחר אזורי עניין מרובים באמצעות ניתוח, כלים, מנהל החזר ROI במגש התמונות.לאחר מכן, מדוד את עוצמת הפיקסלים על ידי לחיצה על עוד, רב מדידה, אישור, בחלון מנהל החזר ההשקעה. בניסוי זה, מוח מסוג Wild נחשף ל-CCHa2, גרלין ונוציספטין, בעוד שהמוח המוטנטי של קולטן CCHa2 נחשף ל-CCHa2. אותות GCaMP6 בתאים המייצרים אינסולין זוהו על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית במהירות של 250 אלפיות השנייה למסגרת, והנה תמונות סטילס של נקודות זמן נבחרות.היחס בין השינוי בעוצמת ה-ROI לעוצמת האות הבסיסית בכל נקודת זמן שורטט. החזר ROI נקבע על גופי תאים שזוהו באותו מישור מוקד. הקווים המוצקים מציינים את הממוצע של חמש עד 10 דגימות, והקווים המקווקוים מסמנים את הגבולות העליונים והתחתונים של שגיאת התקן של הממוצע.האזורים המוצללים מציינים את השונות של האותות בניסויים. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שעה אחת, אם היא מבוצעת כראוי. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להכין את דגימת המוח במהירות, כדי למנוע נזק לה.ניתן לשלב הליך זה עם גנטיקה על מנת לענות על שאלות נוספות כמו ספציפיות הקולטן. המערכת המשמשת בפרוטוקול זה קלה להכנה וניתנת לשימוש חוזר. לפיכך, פרוטוקול זה יהיה שימושי עבור, כמו בהקרנה.לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום האנדוקרינולוגיה ומדעי המוח לחקור רשתות הורמונליות השולטות בתפקוד המוח בדרוזופילה.

ex-vivo-calcium-imaging-for-visualizing-brain-responses-to-endocrine

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

אנו מתארים טכניקה הוקמה כדי למדוד ולנתח ריח עוררו תגובות סידן באונה מחושים...

סידן הדמיה של ריח עוררו התגובות תסיסנית מחושים האונה

סרטון זה מתאר הדמיית סידן in vivo בנוירונים דרוזופילה באמצעות GCaMP. סרטון הפרוטוקול המוצג מראה כיצד לתעד שינויים בפלואורסצנטיות GCaMP מנוירונים בגוף פטריות במהלך ניסוי מיזוג ריח.

דרוזופילה אין ויוו דימות סידן: שיטה לדימות פונקציונלי של פעילות עצבית

סרטון זה מדגים שיטה להדמיית סידן in vivo באמצעות חיישני סידן סינפטיים מקומיים בזבובים. הוא מתאר את השלבים להכנת הזבובים למיקרוסקופיה, ביצוע מיזוג חוש הריח, והדמיית זרימת סידן הנגרמת על ידי ריח.

ב Vivo הדמיית סידן באמצעות חיישני סידן סינפטיים מקומיים בדרוזופילה מלנוגסטר

מקור: Ishimoto, H. et. al., הדמיית סידן ex vivo להמחשת תגובות המוח לאיתות אנדוקריני בדרוזופילה. J. Vis. exp. (2018)}{{}}} {{}}} סרטון זה מדגים הדמיית סידן למחקרDrosophila תגובות מוח לנוירופפטידים. נוירונים המבטאים אינדיקטור סידן פלואורסצנטי חושפים דינמיקת סידן תוך תאית ותגובות תפקודיות למולקולות איתות.

הדמיית סידן ex vivo לחקר תגובות המוח של דרוזופילה לנוירופפטידים

מקור: Lark, A. R., et. al., In vivo Functional Brain Imaging Approach המבוסס על אינדיקטור סידן ביולומינסנט GFP-aequorin. J. Vis. Exp. (2016)סרטון זה מדגים הדמיה בזמן אמת של דינמיקת סידן באמצעות חלבון פלואורסצנטי ירוק-aequorin bioluminescence ב Drosophila's מבני מוח עמוקים.

הדמיית ביולומינסנציה לחקר מעברי סידן במבני מוח של דרוזופילה

הרגליים הקדמיות והפרובוסקיס של דרוזופילה מכילים רפרטואר עשיר של נוירונים חושיים טעמיים. כאן, אנו מציגים שיטה המשתמשת בהדמיית סידן כדי למדוד תגובות פיזיולוגיות מנוירונים חושיים ברגל הקדמית וחוטם של זבובים חיים ביישום אקסוגני של פרומון טעם.

מדידת תגובות פיזיולוגיות של<em&gt; תסיסנית</em&gt; עצב סנסורי כדי ליפידים פרומונים שימוש סידן הדמיה חיה

כאן אנו מציגים רומן Ca 2 + גישת -imaging באמצעות כתב bioluminescent. גישה זו משתמשת בGFP-aequorin מבנה התמזגה אשר נקשר Ca 2 + ופולט אור, ומבטל את הצורך בעירור אור. באופן משמעותי בשיטה זו מאפשרת הדמיה ארוכה רציפה, גישה למבני מוח עמוקים ורזולוציה גבוהה זמנית.

בגישת ההדמיה התפקודי של מוח Vivo בהתבסס על סידן Bioluminescent המחוון GFP-aequorin

מאמר זה מתאר פרוטוקול לשעבר vivo להתאמה המאפשר הדמיה Ca 2+ במהלך ההפעלה ביצה תסיסנית.

סידן הדמיה ב<em&gt; תסיסנית</em&gt; ב ביצת הפעלה

כאן אנו מציגים פרוטוקול שבו ניתן לדמיין את הסידן הטרום ו/או הפוסט-סינפטיות בהקשר של למידה וזיכרון של דרוזוהילה . בשנת הדמיה vivo סידן באמצעות synaptically חיישנים סידן מקומי משולב עם הפרדיגמה הקלאסית מיזוג ריח כגון הפלסטיות הסינפטית הבסיסית בבסיס סוג זה של למידה אסוציאטיבית עשוי להיקבע.

ב-Vivo סידן הדמיה אופטית של למידה הנגרמת הפלסטיות הסינפטית בדרוזופילה מלאנוסטר

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להדמיית סידן ex vivo בדרוזופילה למבוגרים המבטאים GCaMP6 לניטור פעילויות אפילפטיפורמיות. הפרוטוקול מספק כלי רב ערך לחקר אירועים איקטליים בדרוזופילה בוגרת באמצעות הדמיית סידן ex vivo , המאפשר לחקור את המנגנונים הפוטנציאליים של אפילפסיה ברמה התאית.

אקס ויוו הדמיית סידן למודל דרוזופילה לאפילפסיה

אנו מציגים פרוטוקולי הדמיית סידן עבור נוירון ריח של זחל דרוזופילה, באמצעות דבק רקמות מקומי לקיבוע. שיטה זו משפרת את היציבות, ומאפשרת ניסויים אמינים in vivo ו-ex-vivo. סקריפטים מותאמים אישית של R מנתחים אותות סידן, ומספקים פלטפורמה יעילה למחקר נוירופיזיולוגי מפורט.

הדמיית סידן in vivo ו-ex-vivo של נוירון במעגל הריח בזחל Drosophila melanogaster בכוכב השלישי

למדו הדמיית סידן ex vivo במוח Drosophila לחקירת תגובות נוירונליות לאותות אנדוקריניים. שיטה זו מאפשרת לבחון השפעות ישירות של הורמונים על המוח בנפרד מרקמות אחרות.

לשעבר Vivo הדמיית סידן להמחשת התגובות המוח איתות האנדוקרינית ב דרוזופילה

גלה סרטונים נוספים