לשעבר Vivo הדמיית סידן להמחשת התגובות המוח איתות האנדוקרינית ב דרוזופילה
2 ביוני 2018
מאמר זה מתאר פרוטוקול עבור ex-vivo סידן הדמיה של המוח דרוזופילה . בשיטה זו, תרכובות טבעי או סינתטי ניתן להחיל את המאגר כדי לבחון את היכולת שלהם להפעיל את המסוים הנוירונים במוח.
שיטה זו יכולה לסייע לענות על שאלות מפתח בתחום האנדוקרינולוגיה, כמו גם בתחום מדעי המוח, כמו למשל המחקר שלנו לסקירת תגובות המוח לאותות אנדוקריניים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לבחון השפעות ישירות של אותות אנדוקריניים על המוח המופרד מרקמות אחרות. כדי להתחיל בהליך זה, השתמש במלקחיים כדי לגרד את המרכז התחתון של צלחת תרבית פלסטית כדי ליצור שקע להרכבה קלה יותר של הגנגליון הגחוני של מוח הזחל לאחר הדיסקציה.
בעזרת קיסם, הניחו טיפה קטנה של דבק-על משני צידי השקע, והצמידו מוט טונגסטן לדבק. לאחר מכן, בעזרת חתיכה קטנה של דבק רב פעמי דמוי מרק, צור קיר עגול המקיף את השקע. כדי לנתח את מוח הזחל, 90 עד 120 שעות לאחר הטלת הביצים אוספים זחלים ושוטפים אותם לפחות שלוש פעמים במים מזוקקים כדי להסיר שאריות מזון דביקות.
לאחר מכן, הניחו זחל על שעון מרובעת בגודל סנטימטר וחצי מלאה ב-PBS קר כקרח. השתמש בזוג מלקחיים כדי לתפוס בעדינות את החלק האמצעי של הזחל. השתמש בזוג מלקחיים נוסף כדי לתפוס ולמשוך את ווי הפה בעדינות כדי להפריד את החלק הקדמי של הזחל המכיל את המוח משאר הגוף.
לאחר מכן, החזק את הקצה הקדמי עם המלקחיים והפוך את הזחל כלפי חוץ. הסר את הרקמות הזרות המחוברות למוח, כגון דיסקים דמיוניים, גופי שומן ובלוטת הטבעת. הפרד בעדינות את המוח מחלקי הפה.
לאחר מכן, יש למרוח 200 מיקרוליטר PBS על החלק הפנימי של טבעת ההדבקה שהוכנה קודם לכן בתא ההדמיה. מצצו בעדינות את המוח המנותח עם PBS לתוך פיפטה של פסטר, והעבירו אותו לתא ההדמיה. בתא ההדמיה, תפוס את סיבי השריר המשתרעים מגרעיני הגחון והכניס את המוח בעדינות לשקע שמתחת לחוט הטונגסטן.
לאחר מכן, משכו את חוט הטונגסטן מעט כלפי מעלה כדי למקם את המוח במיקום הנכון להדמיה. כדי להשיג תמונות פלואורסצנטיות של סידן, מקם את תא ההדמיה המכיל את צמח המוח מתחת למיקרוסקופ. הורד את עדשת האובייקט עד שהיא נוגעת ב-PBS, ותחת תאורת שדה בהיר מקם את המוח והביא אותו למיקוד.
עבור לאור פלואורסצנטי והתאם את המיקוד על התאים המסומנים בהצלחה של GCaMP. התחל את הרכישה ב-250 אלפיות השנייה למסגרת, ברזולוציה של 512 x 512 פיקסלים במצב מקורר מים. לאחר מכן, התאם את זמן החשיפה כדי לקבל את ערכי הקרינה בטווח הדינמי של מצלמת CCD, אך לא נמוך מ-1000 יחידות שרירותיות עם תמונות של 16 סיביות.
לאחר קביעת פרמטרי ההדמיה, צלם את התמונות למשך דקה אחת לפני מתן פפטיד כדי לזהות עוצמות אות בסיסיות. לאחר מכן, יש למרוח את פפטיד הבדיקה ישירות, על ידי פיפטינג של 100 מיקרוליטר מתמיסת הפפטיד המוכנה לאמבט הזחלים. רשום את פליטת ההצלחה של GCaMP למשך מספר דקות.
כדי לנתח את הנתונים, פתח את תוכנת הניתוח והשתמש במסגרת הראשונה שהייתה לפני יישום הפפטיד כתמונת ייחוס. לאחר מכן, בחר תוספים, TurboReg. בחר את קובץ התמונה הטורית כמקור, ואת תמונת הייחוס כיעד.
לאחר מכן, בדוק את Rigid Body ו-Accurate עבור שיטת העיבוד והאיכות, בהתאמה. לאחר מכן, לחץ על אצווה כדי להתחיל בעיבוד תמונה. בחר אזורי עניין מרובים באמצעות ניתוח, כלים, מנהל החזר ROI במגש התמונות.
לאחר מכן, מדוד את עוצמת הפיקסלים על ידי לחיצה על עוד, רב מדידה, אישור, בחלון מנהל החזר ההשקעה. בניסוי זה, מוח מסוג Wild נחשף ל-CCHa2, גרלין ונוציספטין, בעוד שהמוח המוטנטי של קולטן CCHa2 נחשף ל-CCHa2. אותות GCaMP6 בתאים המייצרים אינסולין זוהו על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית במהירות של 250 אלפיות השנייה למסגרת, והנה תמונות סטילס של נקודות זמן נבחרות.
היחס בין השינוי בעוצמת ה-ROI לעוצמת האות הבסיסית בכל נקודת זמן שורטט. החזר ROI נקבע על גופי תאים שזוהו באותו מישור מוקד. הקווים המוצקים מציינים את הממוצע של חמש עד 10 דגימות, והקווים המקווקוים מסמנים את הגבולות העליונים והתחתונים של שגיאת התקן של הממוצע.
האזורים המוצללים מציינים את השונות של האותות בניסויים. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שעה אחת, אם היא מבוצעת כראוי. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להכין את דגימת המוח במהירות, כדי למנוע נזק לה.
ניתן לשלב הליך זה עם גנטיקה על מנת לענות על שאלות נוספות כמו ספציפיות הקולטן. המערכת המשמשת בפרוטוקול זה קלה להכנה וניתנת לשימוש חוזר. לפיכך, פרוטוקול זה יהיה שימושי עבור, כמו בהקרנה.
לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום האנדוקרינולוגיה ומדעי המוח לחקור רשתות הורמונליות השולטות בתפקוד המוח בדרוזופילה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג פרוטוקול לדימוי סידן ex vivo של מוח ה-Drosophila, במטרה לחקור תגובות עצביות לאותות אנדוקריניים. השיטה מאפשרת לבחון תרכובות טבעיות או סינתטיות להפעלת נוירונים ספציפיים, ובכך מספקת תובנות לגבי נקודות המפגש בין אנדוקרינולוגיה למדעי המוח.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- אנדוקרינולוגיה
- נוירוביולוגיה של Drosophila
רקע
- המחקר בוחן את ההשפעות הישירות של אותות אנדוקריניים על המוח.
- עושה שימוש ב-Drosophila כדי לספק מודל להבנת רשתות הורמונליות.
- מתמקד באופן שבו פפטידים ספציפיים יכולים להשפיע על הפעלה נוירונלית.
- הניח את התשתית למחקרים נוספים על ספציפיות של רצפטורים.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקול המאפשר הערכה של תגובות המוח לאותים אנדוקריניים.
- מתן אפשרות לחוקרים לבחון פעילות עצבית בנפרד מרקמות אחרות.
- סיוע בסינון של תרכובות שעשויות להשפיע על התפקוד העצבי.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- השיטה כוללת דיסקציה והדמיה של מוח זחלי ה-Drosophila באמצעות אינדיקטורים של סידן.
- הזחלים נאספים ומוכנים להדמיה כ-90-120 שעות לאחר הנחת הביצים.
- נקבעים פרמטרים להדמיית פלואורסצנציית סידן, המאפשרים תצפית מפורטת על פעילות נוירונלית.
- יישום של פפטידים לבדיקה מאפשר מדידה של אותות התגובה של המוח לאורך זמן.
תוצאות עיקריות
- דימות מוצלח של אותות GCaMP6 חושף הפעלה עצבית בתגובה לפפטידים שונים.
- הניתוח הסטטיסטי משלב את עוצמת אות הבסיס כדי להעריך תגובות עצביות לאחר יישום הפפטידים.
- הממצאים מאשרים את יעילותה של טכניקה זו לחקר הבקרה ההורמונלית על תפקוד המוח.
מסקנות
- מחקר זה מדגים פרוטוקול בעל ערך לבדיקת השפעה אנדוקרינית על פעילות נוירונלית ב-Drosophila.
- הוא מאפשר חקירה של ספציפיות רספטורים ורשתות הורמונליות במחקרים בתחום מדעי המוח.
- ההשלכות של מחקר זה חולות על הבנת הפלסטיות והמנגנונים העומדים בבסיס תפקודי המוח ותגובותיו.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית ניהולית
דימוי סידן ex vivo בתרביתי מוח של Drosophila מאפשר ויזואליזציה ישירה של תגובות נוירונליות לאותים אנדוקריניים, ובכך תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים בשלבי הגילוי המוקדמים. גישה זו מבודדת השפעות ספציפיות למוח של הורמוני פפטידים, ובכך מספקת ביטחון חזוי לתיקוף מטרות ולבדיקת מסלולים. יכולת ההתאמה של השיטה והפלט הכמותי שלה ממצבים אותה כיכולת הניתנת לשימוש חוזר בקווי מחקר נוירואנדוקריניים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקירה ישירה של אינטראקציות בין הורמונים לרצפטורים ברקע עצבי.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות על ידי בידוד תגובות מוחיות מגורמים מתערבים פריפריאליים.
- מקל על הפחתת סיכונים מכניסטיים באמצעות מדידה כמותית של אות סידן.
- מספק ביטחון חיזוי להמשך קידום מטרות נוירואנדוקריניות.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay Development)
- מכין מערכות מתועדות של שתלי מוח (brain explants) לסריקת תרכובות או פפטידים.
- מספק קריאות פלואורסצנציה כמותיות וניתנות לשחזור לצורך סטנדרטיזציה של הבדיקה.
- מאפשר סריקה ניתנת להרחבה (scalable) של מולקולות מסיסות במים המשפיעות על אקטיבציה עצבית.
- תומך בשימוש חוזר בפלטפורמה עבור פפטידים ורקעים גנטיים שונים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתיישב עם מסלולים נוירואנדוקריניים הרלוונטיים למחלה לצורך חקירת ביומרקרים תרגומיים.
- שומר על רצף משלב הגילוי ועד לאישוש פרה-קליני של אינטראקציות בין הורמונים למוח.
- מפחית סיכונים בקבלת החלטות על קידום המחקר על ידי אספקת ראיות ישירות למנגנוני הפעלה עצבית.
שילוב של תהליכי עבודה וסבבי עיבוד
שיטה זו לדימיון ex vivo מגשרת בין שלבי הגילוי המוקדמים לזיהוי המולקולות המובילות (lead identification), על ידי כך שהיא מאפשרת בדיקה מונחית-השערות של סיגנלינג אנדוקריני במעגלים עצביים.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת השערות לגבי השפעות של הורמוני פפטידים על פעילות המוח.
- סריקה: מספק מערכות של רקמות מושתלות (explants) מוכנות לבדיקה, עם תוצרים כמותיים הניתנים לשחזור.
- אנליטיקה: מייצר נתוני פלואורסצנציה רזולוציוניים בזמן עבור השוואה סטטיסטית חסונה של תנאים.
- מחקר תרגומי: מקל על התאמה לסמנים ביולוגיים נוירואנדוקריניים הרלוונטיים למודלים של מחלות.
- שימוש חוזר ארגוני: ניתן להתאמה לאיברים או למינים אחרים, מה שמשפר את התועלת במגוון תוכניות מחקר.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף יעדים נוירואנדוקריניים.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של תהליכי דימות ואנליזה לצורך הדירות ויכולת הרחבה.
- ערך אסטרטגי: מספק בסיס להחלטות go/no-go ומשפר את יעילות ההון על ידי הבהרה של תגובות מוחיות ישירות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף של יעדים ומסלולים נוירואנדוקריניים מותאם לסיכון.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בגנטיקה ובנוירו-אנטומיה של Drosophila לצורך דיסקציה והדמיה מדויקות.
- נדרשת גישה למיקרוסקופ קונפוקאלי מסוג spinning disc ותוכנה לניתוח כמותי של תמונות.
- נדרש סטנדרטיזציה של פרמטרי ההדמיה ופרוטוקולי ניתוח הנתונים בין צוותים שונים.
- ניתן להתאימו לאיברים אחרים או למודלים של בעלי חיים באמצעות התאמות של התא המכני.
- מהירות הכנת הדגימה והשלמות של הרקמה הן קריטיות לקבלת תוצאות מהימנות.
