Name: ניתוח חישובית של Germline Caenorhabditis elegans ללמוד הפצה של גרעינים, חלבונים ו את שלד התא (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: למד ניתוח חישובי של Germline Caenorhabditis elegans לחקר הפצת גרעינים, חלבונים ושלד תא. השיטה מייעלת את ניתוח הזרע ומפחיתה שגיאות אנוש.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים Microimaging מונש לתמיכה טכנית שלהם. זנים מסוימים נמסרו על ידי המרכז גנטיקה Caenorhabditis , אשר ממומן על ידי משרד NIH תוכניות תשתית מחקר (P40 OD010440). עבודה זו נתמכה על ידי מלגת גילוי וההתערבות של אוניברסיטת מונש, גרנט פרויקט NHMRC (GNT1105374), מלגת מחקר בכיר NHMRC (GNT1137645), וסקי חדשנות מלגת: 23 ערנית על רוג'ר Pocock.

1. גידול תולעת והכנה
הערה: עיין טבלה של חומרים עבור כל מוצר המידע.
<ol><li>OP50 Escherichia coli תרבות: התרבות חיידקים OP50 Lysogeny מרק בשר (ליברות) (טריפטון 1% 0.5% שמרים, 0.5% NaCl, pH 7.0) בן לילה ב 37 ° C ללא אנטיביוטיקה.</li>
	<li>זרע µL 400 של חיידקים OP50 ללוחות מדיה (NGM) צמיחה נמטודות (1.5 גר' NaCl, 8.5 גר' אגר, 1.25 גרם peptone, 1 מ"ל של CaCl 1 מ'2, 1 מ"ל של כולסטרול 5 מ"ג/מ"ל אתנול, 1 מ"ל של 1 מ' MgSO4 ו- 25 מ של 1 מ' KPO4 מאגר) אוויר יבש החיידקים במשך 48 שעות.</li>
	<li>לבחור תולעים על צלחות NGM הזריעה, דגירה 15 ° C או 20 º C.<ol>
<li>לניתוח של germline אנדרוגינוס למבוגרים, לאסוף מוזן היטב תולעים L4 לדשא חיידקי ואת דגירה בין לילה ב 20 º C.</li>
		<li>בשביל הניקוד זרע מספר אנדרוגינוסים, דגירה L4 תולעים ב 20 מעלות צלזיוס במשך 12 שעות עד התולעים מגיעים את הנשירה L4/למבוגרים בלבד. כדי לסנכרן את התולעים לבמה L4, להכין ביצים על-ידי בחירת תולעים בוגרות עם הרבה ביצים בפתרון אקונומיקה (1 M NaOH ואקונומיקה ביחס 1:1). לאפשר את הביצים בוקעות ולקחת L4 חיות בשביל הניסוי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכן שקופיות מיקרוסקופ טפלון על ידי הצבת µL 25 של פולי-L-ליזין פתרון בשקופית והפצת הפתרון, באמצעות טיפ פיפטה. לאחר הסרת העודפים פולי-L-ליזין עם מגבת נייר, לאפשר שהשקופיות אוויר יבש, דגירה השקופיות ב 65 מעלות צלזיוס למשך 15-20 דקות.</li>
</ol>2. Germline לנתיחה,6,מכתימים13
<ol><li>ספוט µL 10 של 0.01% tetramisole (הרדמה) ב- coverslip 22 מ"מ × 22 מ"מ ולבחור אחד - בן יום תולעים בוגרות לתוכו.</li>
	<li>לנתח את התולעת בזנב כמו זה הופך להיות מורדם באמצעות מזרק (5 מ"ל) ומחט (24" פרק 1"), ולוודא כי germline אינו פגום. הערה: הקרע צריך להתבצע לפני התולעת הופך משותק לחלוטין כך הלחץ השלילי התולעת ואת תנועת תולעת סיוע של הוצאה של germline. הבקיע זרע, עבור לנקוט שלא יגרמו נזק את spermatheca על ידי המחט במהלך ניתוח. להימנע מלגעת את germline עם המחט למעט הנקודה לנתיחה לאחר spermatheca. אם יש לשבור בתא germline או הפרשות germline נצפית, אמור germline לא לשמש לניתוח.</li>
	<li>מקם את coverslip הפוכה בשקופית מצופה פולי-L-ליזין, שמירה על ביתור germline בשקופית.</li>
	<li>להסיר עודפי נוזלים תחת coverslip על ידי הצבת מגדל נייר בפינה של coverslip, ולאחר מכן המקום השקופית של חנקן נוזלי עבור מינימלית 1 להסיר במהירות את coverslip באמצעות מחט עם germlines על השקופית.</li>
	<li>להעביר את השקופיות-20 ° C מתנול עבור 30-60 s בחדר ולאחר מכן תקופת דגירה של 30 דקות בתמיסה תיקון המוכנים באופן טרי (1 x פוספט buffered מלוחים (PBS) המכיל מ' 0.08 HEPES pH 6.9, 1.6 מ מ MgSO4, מ מ 0.8 אתילן גליקול-bis(beta-aminoethyl אתר)-N, N, N', N'-paraformaldehyde חומצה (EGTA) ו- 3.7% tetraacetic) בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לשטוף את השקופיות על-ידי הצבת בחדר המכיל 1 x PBS, pH 7.4 עם 0.1% Tween-20 במשך 10 דקות חזור על שלב זה פעם אחת.</li>
	<li>לחסום את germlines עם µL 30 של חסימת פתרון (30% של נסיוב עז שהוכנו על ידי הוספת µL 900 של עז נסיוב 1700 µL של מזוקקים H2O ו- 300 µL של 10 x PBS) בחדר לחים שהוכנו על ידי הנחת מגבת נייר רטובה בתוך קופסת פלסטיק בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.</li>
	<li>הוסף µL 50 של REC-8 נוגדן פתרון מוכן בנסיוב עז 30% ב- 1:300 יחס אל כל דגימה. דגירה בין לילה ב 4 º C.</li>
	<li>לשטוף את השקופיות על-ידי הצבת בחדר המכיל PBS x 1 עם 0.1% Tween-20 במשך 10 דקות חזור על השלב פעם ולהסיר עודפי נוזלים על ידי הנחת מגבת נייר בפינה של השקופית.</li>
	<li>להכין נוגדן משני פתרון על ידי דילול fluorophore ירוק (488 ננומטר פליטה אורך גל) מצומדת נוגדנים משניים (1:1000), phalloidin (אקטין הכתם, בקני) ודאפי (DNA הכתם, בקני) 30% עז נורמלית בסרום.</li>
	<li>הוסף µL 50 של נוגדנים משניים פתרון לשקופית.</li>
	<li>תקופת דגירה של h 1 בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לשטוף את השקופיות פעמיים על-ידי הצבת בחדר המכיל PBS x 1 עם 0.1% Tween-20 במשך 10 דקות תנגבי עודף נוזלים.</li>
	<li>להוסיף 30 µL של תיקון ריאגנט אותן לשקופית במקום 12 מ מ2 x 1.5 מיקרומטר coverslip על העליונה, לייבש את השקופיות ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.</li>
</ol>3. מיקרוסקופיה קונפוקלית
<ol><li>הפעל את מיקרוסקופ קונפוקלי, לייזרים, סורק תהודה ותוכנות מיקרוסקופ קונפוקלי. במקום את השקופיות עם germlines מוכתם על המחזיק שקופית מעל המטרה X 63.</li>
	<li>לאתר של germline, להתמקד בחלק העליון germline ולסמן אותו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי תוכנה. באופן דומה להתמקד בתחתית germline ולסמן אותו כדי לקבוע את עובי germline הכולל.</li>
	<li>תמונה germline כולו על-ידי הגדרת עובי כל פרוסה עד 0.5 מיקרומטר. לסמן את רכישת germline ולהתחיל להשלים. לסרוק כל פרוסה 8 פעמים, ממוצע של הערכים לשיפור איכות התמונה. בסורק התהודה יאפשר סריקה מהירה כדי למנוע הלבנת במהלך דימות. אם לא קיים המיקרוסקופ סורק תהודה, להפחית את מספר סריקות עד ארבע כדי למנוע הלבנת.</li>
</ol>4. post Imaging ניתוח של גרעינים מספר והפצה
הערה: עיין משלים איור 1 לקבלת צילומי מסך של כלי תוכנה, לחצני המשמשים.
<ol><li>ייבאו את התמונה Imaris 8.4.1 או גירסאות מאוחרות יותר של התוכנה.</li>
	<li>הגדרת אזור mitotic אזור המעבר, באזור meiotic, אזור oocyte, spermatheca של germline על-ידי זיהוי המורפולוגיה גרעיני בכל אזור.</li>
	<li>השתמש בלחצן פונקציה פני השטח (איור משלים 1A) של התוכנה כדי לבחור את האזור של ריבית.</li>
	<li>לבטל את אשף יצירת משטח אוטומטי וצייר ידנית האזור של ריבית על הפרוסה הראשונה והאחרונה של התמונה מתוך ערימה תלת מימדי.</li>
	<li>לחץ על משטח יצירה. הערה: התוכנה באופן אוטומטי יפתחו את המחסן בין הראשונים והאחרונים מחסנית.</li>
	<li>להסוות כל הערוצים למעט דאפי על-ידי לחיצה על לחצן מסכת ערוץ (איור משלים 1B-C).</li>
	<li>להגדיר פרמטרים גודל הגרעין באמצעות לחצן function ספוט (איור משלים 1A). עבור האזור mitotic, הגדרה של XY בקוטר של 2 מיקרומטר תוך השארת קוטר Z מוגדר. עבור אזור המעבר, להגדיר XY בקוטר של 2 מיקרומטר, קוטר Z כמו 1.5 מיקרומטר. (1D איור משלים). הערה: פתרון בעיות על הקוטר בהתאם רמת ההגדלה ואת המפרט של המיקרוסקופ. עבור פרוטוקול הנוכחי, המטרה בשימוש היה בן 63 X וסיפק נוסף ההגדלה 1.70 פעמים במהלך דימות. אם המטרה משתנה, למשל 40 X, הקוטר צריך להשתנות בהתאם. פתרון בעיות צריכה להתבצע עם wildtype germlines להקים הפרמטרים הנכונים. האזור mitotic של זרוע germline פראי סוג יש כ 250 גרעינים. הקוטר צריך לשנות כדי להשיג ערך זה. השתמש germlines לפחות 15 כדי לקבוע את ערך אופטימלי עבור הקוטר. בגישה דומה אמור לשמש לכיול אזור המעבר (150-170 גרעינים) ואזור meiotic (600-700 גרעינים).</li>
	<li>להגביל את הגילוי של כתמים על-ידי הגדרת את הסף המינימלי (איור משלים 1E). שימוש דאפי מוכתם פראי סוג germlines להקים את הסף המינימלי על ידי הגדלת את הסף המינימלי עיבוד תלת מימדי עד המקום הראשון מופיע מחוץ germline.</li>
	<li>לשמור את התמונה, לקבל את מספר גרעינים מטבלת שנוצר באופן אוטומטי על ידי התוכנה. ייצוא התמונות כמו קבצים TIF.</li>
</ol>5. post Imaging ניתוח הבקיע הזרע ואת מספר כרומוזום
<ol><li>לבצע עיבוד תלת-ממדית על-ידי בחירה spermatheca את אזור בעל עניין. כדי לזהות כל זרע, להגדיר את קוטר הנקודה בין 0.75 - מיקרומטר 1.0 עבור X ו- Y-ציר, בעוד קוטר Z נשאר לא מוגדר. השתמש בלחצן פונקציה כתמים כמוצג באיור1 משלים.</li>
	<li>להחסיר את הרקע על ידי מתקתק רקע לחסר תיבת ושימוש רקע תיקון ערכים המחושבים על-ידי התוכנה (1D איור משלים). הערה: התוכנה Imaris בוחר נקודות בעוצמה גבוהה קודם, לכן השפעת הרקע הוא מינימלי כל עוד אין הבדל משמעותי בין האזור עניין ואת הרקע. השיטה השנייה היא כדי להגדיר באופן ידני את התיקון רקע, במידת הצורך ערכים שניתן לתת את הרקע. תיקון ידני הרקע יהיה הולם אם האינטנסיביות של דגימות עצמאי צריך השוואה.</li>
	<li>התאם את הסף עיבוד תלת מימדי לזהות כל זרע דאפי צבעונית spermatheca (איור משלים 1E).</li>
	<li>לספירת כרומוזום, להגדיר את קוטר הנקודה < מיקרומטר 0.75 עבור X ו- Y-ציר לפני פיתוח מודלים תלת מימדיים.</li>
	<li>שמור את התמונה וייצא כקובץ TIF.</li>
</ol>6. post Imaging ניתוח עבור שחזור Cytoskeletal של Germline
<ol><li>לזהות את האזור עניין ב germline, להסוות כל הערוצים למעט phalloidin על-ידי לחיצה על לחצן מסיכה ערוצים .</li>
	<li>הגדרת יחידת השטח של 0.25 מיקרומטר באמצעות לחצן פונקציה פני השטח (איור 1 משלים). הערה: פירוש כל מיקרומטר 0.25 יעובד לתוך מודלים תלת מימדיים. פרטי המשטח יכול להיות קבועה עבור כל אזור germline שבו ייווצר מודל פני שטח תלת-ממדי עבור כל מיקרומטר 0.25. עם זאת, עבור האזור oocyte, פרטי המשטח ניתן להגדיל עד 0.35 - 0.5 מיקרומטר בשל הנוכחות של סיבי אקטין מוגדרים היטב באזור זה.</li>
	<li>להחסיר את הרקע על ידי מתקתק רקע לחסר תיבת ושימוש רקע תיקון ערכים המחושבים על-ידי התוכנה (1D איור משלים).</li>
	<li>להתאים את הסף עיבוד תלת מימדיים בהתאם למבנה הדורשים ניתוח (איור משלים 1E).</li>
	<li>שמור את תמונת תלת מימדי מפותחת וייצא כקובץ TIF.</li>
</ol>

<ol><li>Hubbard, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+germ+line%3A+a+model+for+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans germ line: a model for stem cell biology.</a> Dev Dyn. 236 (12), 3343-3357 (2007).</li>
<li>Joshi, P. M., Riddle, M. R., Djabrayan, N. J., Rothman, J. H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20419785">Caenorhabditis elegans as a model for stem cell biology.</a> Dev Dyn. 239 (5), 1539-1554 (2010).</li>
<li>Kershner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+stem+cells+and+their+regulation+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Germline stem cells and their regulation in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Adv Exp Med Biol. 786, 29-46 (2013).</li>
<li>Byrd, D. T., Knobel, K., Affeldt, K., Crittenden, S. L., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DTC+niche+plexus+surrounds+the+germline+stem+cell+pool+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A DTC niche plexus surrounds the germline stem cell pool in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 9 (2), 88372(2014).</li>
<li>Kimble, J., Crittenden, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controls+of+germline+stem+cells%2C+entry+into+meiosis%2C+and+the+sperm%2Foocyte+decision+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Controls of germline stem cells, entry into meiosis, and the sperm/oocyte decision in Caenorhabditis elegans.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 405-433 (2007).</li>
<li>Hansen, D., Hubbard, E. J., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-pathway+control+of+the+proliferation+versus+meiotic+development+decision+in+the+Caenorhabditis+elegans+germline%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Multi-pathway control of the proliferation versus meiotic development decision in the Caenorhabditis elegans germline.</a> Dev Biol. 268 (2), 342-357 (2004).</li>
<li>Crittenden, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+RNA-binding+protein+controls+germline+stem+cells+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A conserved RNA-binding protein controls germline stem cells in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 417 (6889), 660-663 (2002).</li>
<li>Eckmann, C. R., Crittenden, S. L., Suh, N., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GLD-3+and+control+of+the+mitosis%2Fmeiosis+decision+in+the+germline+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">GLD-3 and control of the mitosis/meiosis decision in the germline of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 168 (1), 147-160 (2004).</li>
<li>Schumacher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+repression+of+C.+elegans+p53+by+GLD-1+regulates+DNA+damage-induced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Translational repression of C. elegans p53 by GLD-1 regulates DNA damage-induced apoptosis.</a> Cell. 120 (3), 357-368 (2005).</li>
<li>McMullen, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macro-level+modeling+of+the+response+of+C.+elegans+reproduction+to+chronic+heat+stress%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">Macro-level modeling of the response of C. elegans reproduction to chronic heat stress.</a> PLoS Comput Biol. 8 (1), 1002338(2012).</li>
<li>Hubbard, E. J., Korta, D. Z., Dalfo, D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22872476">Physiological control of germline development.</a> Adv Exp Med Biol. 757, 101-131 (2013).</li>
<li>Wolke, U., Jezuit, E. A., Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin-dependent+cytoplasmic+streaming+in+C.+elegans+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Actin-dependent cytoplasmic streaming in C. elegans oogenesis.</a> Development. 134 (12), 2227-2236 (2007).</li>
<li>Jones, A. R., Francis, R., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GLD-1%2C+a+cytoplasmic+protein+essential+for+oocyte+differentiation%2C+shows+stage-+and+sex-specific+expression+during+Caenorhabditis+elegans+germline+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">GLD-1, a cytoplasmic protein essential for oocyte differentiation, shows stage- and sex-specific expression during Caenorhabditis elegans germline development.</a> Dev Biol. 180 (1), 165-183 (1996).</li>
<li>Hasegawa, E., Karashima, T., Sumiyoshi, E., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+CPB-3+interacts+with+DAZ-1+and+functions+in+multiple+steps+of+germline+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">C. elegans CPB-3 interacts with DAZ-1 and functions in multiple steps of germline development.</a> Dev Biol. 295 (2), 689-699 (2006).</li>
<li>Austin, J., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((glp-1+is+required+in+the+germ+line+for+regulation+of+the+decision+between+mitosis+and+meiosis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">glp-1 is required in the germ line for regulation of the decision between mitosis and meiosis in C. elegans.</a> Cell. 51 (4), 589-599 (1987).</li>
<li>Berry, L. W., Westlund, B., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ-line+tumor+formation+caused+by+activation+of+glp-1%2C+a+Caenorhabditis+elegans+member+of+the+Notch+family+of+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Germ-line tumor formation caused by activation of glp-1, a Caenorhabditis elegans member of the Notch family of receptors.</a> Development. 124 (4), 925-936 (1997).</li>
<li>Fox, P. M., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Germline+Stem+Cell+Differentiation+Following+Loss+of+GLP-1+Notch+Activity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Analysis of Germline Stem Cell Differentiation Following Loss of GLP-1 Notch Activity in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 201 (1), 167-184 (2015).</li>
<li>Pasierbek, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Caenorhabditis+elegans+cohesion+protein+with+functions+in+meiotic+chromosome+pairing+and+disjunction%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">A Caenorhabditis elegans cohesion protein with functions in meiotic chromosome pairing and disjunction.</a> Genes and Development. 15 (11), 1349-1360 (2001).</li>
<li>Klass, M., Wolf, N., Hirsh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+male+reproductive+system+and+sexual+transformation+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of the male reproductive system and sexual transformation in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Dev Biol. 52 (1), 1-18 (1976).</li>
<li>Korta, D. Z., Tuck, S., Hubbard, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S6K+links+cell+fate%2C+cell+cycle+and+nutrient+response+in+C.+elegans+germline+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">S6K links cell fate, cell cycle and nutrient response in C. elegans germline stem/progenitor cells.</a> Development. 139 (5), 859-870 (2012).</li>
<li>Laband, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+segregation+occurs+by+microtubule+pushing+in+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Chromosome segregation occurs by microtubule pushing in oocytes.</a> Nat Commun. 8 (1), 1499(2017).</li>
</ol>

המחברים מצהירים ללא ניגוד אינטרסים.

המטרה של פרוטוקול זה נועד לשפר את הדיוק ולצמצם את משך הזמן הנדרש לצורך ניתוח germline. לאחר הכנת תקן germlines גזור, מודל תלת מימדי של גרעינים germline מוכן על ידי עיבוד חישובית. תוך מתן אפשרות התבוננות germline הפצה גרעינים בחלל, עיבוד תלת מימדי מחשבת את מספר גרעינים על אזורים ספציפיים של germline. היבט קריטי של השיטה שלנו היא הגדרה מדויקת של הפרמטרים הגודל והצורה של גרעין האטום. זה תלוי על בהירות של צביעת ואת ההגדלה המשמש את התמונה. נוכל לאשר את הדיוק של שיטת השוואת לאור נתונים מנותח באופן ידני1...

שימור איתות המסלולים עם יונקים גורם C. elegans מודל מצויין ללמוד תהליכים ביולוגיים מספר1,2. במעבדה שלנו, אנו משתמשים germline C. elegans ללמוד תאי גזע, אפופטוזיס ופיתוח גנים. בעוד germline מבנה תלת מימדי, מחקרים רבים הם שניים בשל אופיו מהגידולים ועתירת של ניתוח תלת-ממדי. זה סביר מאוד כי ניתוח דו מימדי עלול לסלף ויוו אירועים ב germline. ההרמפרודיט למבוגרים C. elegans יש שתי זרועות germline, שכל אחד מהם בתים תא עצה דיסטלי סומאטית (DTC) המתחזק בתאי הנבט דיסטלי מצב וייעודים3,4. אלה בתאי הנבט מתחילים להבחין כאשר הם עוברים מן ה-DTC, בריחה השפעתה, ולהיות oocytes, זרע כפי שהם מגיעים לסוף הפרוקסימלית של germline. במהלך תהליך זה, גרעינים תא הנבט עוברים מיטוזה, לפני המעבר מיוזה5,6. ייצור הזרע מתבצעת באמצעות והעשים 4 (L4) של ההתפתחות, אחרי אשר oocytes מיוצרים במהלך הבגרות. הזרע נשמרות בתיקיה spermatheca שבו הם לדשן את oocytes כדי להפיק עוברי.
ישנם מספר גורמים גנטיים וסביבתיים יכולים להשפיע על התפתחות germline ב- C. elegans וכתוצאה מכך שינויים מספר גרעינים, מספר אירועים אפופטוטיים להיפגע, דינמיקה כרומוזום, ביטוי חלבונים ו/או לוקליזציה7 ,8,9,10,11. הניתוח של אירועים אלה דורש הזיהוי בכל שלב של בידול בהתבסס על מורפולוגיה גרעיני והפצה. לנתח במדויק את הפרמטרים הללו באופן ידני עם גודל מדגם גדולים הוא מהגידולים ולגזול. כדי לעקוף את החסרונות האלה ולאפשר את העקביות של ניתוח, פיתחנו שיטה אוטומטית בחינת תלת מימדי C. elegans germline לספור גרעינים, גרעינים הפצה, ביטוי חלבונים, ו cytoskeletal מבנה. על ידי שילוב מיקרוסקופיה קונפוקלית עם עיבוד תלת מימדי, יצרנו פרמטרים הגודל והצורה לצורך הזיהוי בכל שלב של בידול תא הנבט. יתרה מזאת, שיטה זו מאפשרת ספירת גרעיני תא נבט, זרע בתוספת ניקוד של כרומוזום מספר ב כל oocyte.
מבנה מכריע אחד ב germline הוא שלד התא, אשר מספק יציבות germline תא, איידס cytoplasmic streaming, הגנה germline הגרעינים12. באמצעות עיבוד חישובית, עלינו לבצע שחזור תלת מימדי של שלד התא germline, זיהה תכונות cytoskeletal שונות בתוך germline. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול צעד אחר צעד כדי להמחיש כיצד חישובית ניתוח בשילוב עם קונאפוקלית הדמיה מאפשר ניתוח מקיף של germline C. elegans .
אנו מציעים שיטה מהירה עבור ניתוח תלת-ממדי של C. elegans germline (איור 1). באמצעות ניתוח תלת-ממדי, זה אפשרי ללמוד תלת מימדי התפלגות אוטומטית germline גרעינים (איור 2 , איור 3), ספירת תאים (איור 2), שחזור של שלד התא germline ( איור 3), הפצה של חלבונים (איור 4), וניקוד מספר הזרע אצל spermatheca הכרומוזומים oocytes (איור 5). השיטה לא רק מאפשר כימות קל ומדויק germline אלא מזהה פנוטיפים רלוונטי מבחינה פיזיולוגית.

<table><tbody><tr><td>C. elegans זנים: סוג בר (N2, בריסטול), rnp-8(tm2435) I/hT2[bli-4(e937) let-?( q782) qIs48] (I;III), cpb-3(bt17) I, glp-1 (e2141) III&nbsp; </td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OP50 Escherichia coli חיידקים</td><td>תוצרת בית</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צלחות גידול נמטודות (NGM) ארנב</td> פוליקלונלי <td>תוצרת בית</td><td></td><td></td></tr><tr><td>נגד REC-8&nbsp;</td><td>SDIX</td><td>29470002</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488 נוגדן מצומד שגדל בעז</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A-21236</td><td></td></tr><tr><td>צבע שלד ציטו פלואידין&nbsp;</td><td>תרמופישר סיינטיפיק</td><td>A-12380</td><td></td></tr><tr><td>DAPI&nbsp;</td><td>תרמופישר סיינטיפיק&nbsp;</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>פולי-L-ליזין&nbsp;</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>P5899</td><td></td></tr><tr><td>טטרמיסול&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5899</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>1M מאגר HEPES, pH 7.4&nbsp;</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>G0887</td><td></td></tr><tr><td>10X PBS pH 7.4&nbsp;</td><td>תרמופישר סיינטיפיק</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20&nbsp;</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>P1389</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>37% תמיסת פרפורמלדהיד</td><td>Merck Millipore</td><td>1040031000</td><td></td></tr><tr><td>סרום עיזים רגיל</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>מגיב לקיבוע פלואורושילד&nbsp;</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>F6182</td><td></td></tr><tr><td>אתנול&nbsp;</td><td>מיליפור&nbsp;</td><td></td><td></td>1009832511</tr><tr><td>מתנול</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>20&deg; C & 25&deg; חממה&nbsp;</td><td>כל מותג</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אור</td><td>כל מותג</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי&nbsp; &nbsp;</td><td>כל מותג (Leica, Zeiss)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מחשב המצויד ב-Imaris suit 8.4.1 ואילך, רישיון מלא לשימוש בתוכנה ובתוכנת Matlab.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח חוצצת פוספו, pH 7.4</td> שקופיות מיקרוסקופ <td>טפלון תוצרת בית</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Tekdon&nbsp;</td><td>&nbsp; 941-322-8288</td><td></td></tr></tbody></table>

ניתוח חישובית של germline caenorhabditis elegans ללמוד הפצה של גרעינים, חלבונים ו את שלד התא

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Germline Caenorhabditis elegans (C. elegans) משמש כדי ללמוד מספר תהליכי ביולוגית חשובה כולל תאי גזע, אפופטוזיס ופיתוח כרומוזום דינמיקה. בעוד germline מודל מעולה, הניתוח הוא לעתים קרובות שני עקב זמן העבודה הנדרש לצורך ניתוח תלת-ממדי. המפרט הגדולות במחקרים כאלה הם המיקום/המספר של גרעינים והפצה חלבון בתוך germline. כאן, אנו מציגים שיטה לבצע ניתוח אוטומטיות של germline באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית וגישות חישובית כדי לקבוע את המספר והמיקום של גרעינים בכל אזור של germline... השיטה שלנו מנתחת גם הפצה חלבון germline המאפשרת בחינה תלת מימדי של חלבון ביטוי מרקע גנטי. יתר על כן, המחקר שלנו מראה וריאציות באדריכלות cytoskeletal באזורים שונים של germline עשוי להכיל דרישות ספציפיות מרחבי התפתחותית. לבסוף, השיטה שלנו מאפשר אוטומטיות ספירת הזרע ב spermatheca של כל germline. יחדיו, השיטה שלנו מאפשר ניתוח פנוטיפי מהיר ולא לשחזור germline C. elegans .

איור 1 מציין את משך הזמן הנדרש לצורך ניתוח germline תלת מימדי. אנדרוגינוסים L4 מודגרות ב- 20 ° C היו גזור כדי לבודד germlines, צבעונית עם דאפי, phalloidin נוגדנים נגד germline חלבונים. Germlines הם עם תמונה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. מיקרוסקופ מוכתמים, קונאפוקלית דורש כ 24 ה ניתוח חישובית עבור germline שלם דורש 10-15 דקות כדי לספור את מספר והמיקום של גרעינים, לזהות את התפלגות חלבון, לנתח את המבנה cytoskeletal ואת הציון מספר של זרע. ניתוח ידני מלא דורש מעל...

אנו מציגים שיטה אוטומטית עבור שחזור תלת מימדי של Caenorhabditis elegans germline. השיטה שלנו קובעת את המספר והמיקום של כל גרעין בתוך germline ו ניתוחים germline חלבון הפצה, מבנה cytoskeletal.

ניתוח חישובית של Germline Caenorhabditis elegans ללמוד הפצה של גרעינים, חלבונים ו את שלד התא

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

המטרה הכוללת של שיטה זו היא להפוך את הניתוח של קו הנבט Caenorhabditis elegans לאוטומטי כדי לחקור את התפלגות הגרעין, החלבון והשלד הציטולוגי שלו. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות המפתח בתחום C.Elegans לגבי מספר הגרעינים והזרע, התפלגות גרעינית ומבנה השלד התא של קו הנבט. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שהיא מפחיתה את זמן הניתוח, מגדילה את גודל המדגם ומבטלת את טעות האנוש הקשורה לניתוח הידני.כדי לצלם את הדגימות, הנח שקופיות עם קווי נבט מוכתמים לתוך מחזיק השקופיות מעל האובייקט 63X של מיקרוסקופ קונפוקלי, ואתר קו נבט. התמקדו בחלק העליון של קו הנבט, וסמנו אותו בתוכנת המיקרוסקופ הקונפוקלי. לאחר שנקבע עובי קו הנבט הכולל, הגדירו את העובי של כל פרוסה עד 0.5 מיקרומטר, וסמנו את קו הנבט השלם.לאחר מכן, התחל את הרכישה, סרוק כל פרוסה שמונה פעמים וחשב את ממוצע הערכים כדי לשפר את איכות התמונה. לאחר שכל התמונות התקבלו, ייבא את התמונות לתוכנת ניתוח תמונה מתאימה, והשתמש בכלי פונקציית פני השטח כדי לבחור את האזור המיטוטי. תופיע תמונה של הקצה הדיסטלי של קו הנבט.בטל את אשף יצירת המשטחים האוטומטית, וצייר ידנית אזור עניין סביב האזור המיטוטי בפרוסה הראשונה והאחרונה של התמונה מהערימה התלת-ממדית. לחצו על 'צור משטח' ולאחר מכן על 'ערוץ מסיכה', כדי להוסיף מסיכה לכל הערוצים פרט לערוץ DAPI. בעזרת כלי פונקציית הספוט, הגדר את פרמטרי הגודל של האזור המיטוטי בקוטר XY של שני מיקרומטר ובקוטר Z לא מוגדר.לחץ על הפחת רקע כדי להחסיר את הרקע. להגדרת הסף המינימלי, הגדילו את סף הרינדור התלת-ממדי המינימלי בקו נבט מסוג פרא מוכתם ב-DAPI עד שהנקודה הראשונה תופיע מחוץ לקו הנבט, וצרו מודל תלת-ממד לכל אזור. לאחר שמירת התמונות, לחץ על הטבלה כדי להציג את מספר הגרעינים כפי שנוצר אוטומטית על ידי התוכנה, ולייצא את התמונות כקבצי TIFF.עבור אזור המעבר, צור משטח כפי שהוסבר קודם. לאחר מכן, לחצו על 'ערוץ מסיכה' כדי להוסיף מסיכה לכל הערוצים פרט לערוץ DAPI. באמצעות פונקציית נקודה, הגדר קוטר XY של שני מיקרומטר וקוטר Z של 1.5 מיקרומטר, ולחץ על חיסור רקע כדי להחסיר את הרקע.להגדרת הסף המינימלי, הגדילו את סף הרינדור התלת-ממדי המינימלי בקו נבט מסוג פרא מוכתם ב-DAPI עד שהנקודה הראשונה תופיע מחוץ לקו הנבט, וצרו מודל תלת-ממד לכל אזור. לאחר שמירת התמונות, לחץ על הטבלה כדי להציג את מספר הגרעינים כפי שנוצר אוטומטית על ידי התוכנה, ולייצא את התמונות כקבצי TIFF. לניקוד מספר הזרע, בחר את הזרע כאזור העניין, כפי שמודגם עבור אזורי הגרעין, והשתמש בכלי פונקציית הנקודה כדי להגדיר את קוטר ה-XY בין 0.75 למיקרומטר אחד עם קוטר Z לא מוגדר כדי לזהות כל זרע.בחר בתיבה Background Subtract והשתמש בערכי תיקון הרקע שחושבו על-ידי התוכנה כדי להחסיר את הרקע. לאחר מכן, התאם את סף העיבוד התלת-ממדי כדי לזהות את כל הזרע המוכתם ב-DAPI בזרעונים. לספירת כרומוזומים בביציות, בחר את הביציות והגדר את קוטר ה-XY כפחות מ-0.75 מיקרומטר, והגדר את הסף לפני פיתוח המודלים התלת מימדיים.לאחר מכן, שמור את התמונות לייצוא כקובצי TIFF. לשחזור קו הנבט הציטו-שלד, זהה את האזור המיטוטי המעניין בקו הנבט וצור מסכת משטח כפי שהודגם בעבר. לחצו על 'ערוצי מסיכה' כדי להסוות את כל הערוצים פרט לתעלת הפאלוידין, והשתמשו בכלי פונקציית פני השטח להגדרת פרט פני שטח של 0.25 מיקרומטר.לאחר הפחתת הרקע, התאימו את סף הרינדור בתלת-ממד כדי לשמור את התמונה התלת-ממדית שפותחה לייצוא כקובץ TIFF. התפלגות הגרעינים תלויה בשלב ההתמיינות. לדוגמא, באזור המיטוטי, האקטין הפנימי מופיע כמסה מוצקה שעליה מאורגנים הגרעינים.בקו נבט מסוג בר, האזור המיטוטי מכיל כ-250 גרעינים והוא ארוז היטב בגרעינים בהשוואה לשאר קו הנבט. עם זאת, ככל שהגרעינים מתרחקים מהקצה הדיסטלי, הם נראים קרובים יותר להיקף קו הנבט, כאשר השינוי בהתפלגות מתחיל באזור המעבר ומסתיים כאשר הגרעינים נכנסים לשלב השלישי של הפרופאזה במיוזה. באזור המעבר, האקטין הפנימי של קו הנבט מקבל מבנה גלילי יותר, והופך לגליל חלול כשהוא מגיע לפאצ'יטן.שכבת האקטין השנייה מכסה את השכבה הפנימית, ומעניקה צורה לקו הנבט. גליל זה בתוך מבנה אקטין גלילי נעלם לכיוון אזור הביציות, ובשלב זה האקטין מופיע כסיבים עבים המכסים את הביציות. בזרעונים, האקטין נוצר גם לצרורות עבים של סיבים, אם כי נראה כי סיבים אלה ארוזים קרוב יותר זה לזה מאשר באזור הביציות.עיבוד תלת מימדי של הקצה הפרוקסימלי של קו הנבט, כפי שהודגם, חושף בממוצע 151 זרע בכל זרע. לאחר השליטה, ניתן להשלים ניתוח זה תוך 10 דקות לכל קו נבט. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להגדיר את פרמטרי הניתוח בהתאם להגדלת המטרה המשמשת להמחשת קו הנבט בניסוי שלך.לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע ניתוח אוטומטי של קו נבט ולחקור את מבנה השלד הציטולוגי ולצבור את מספר הגרעינים בתוך קו הנבט.

computational-analysis-caenorhabditis-elegans-germline-to-study

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

הדמיה ג elegans עוברים באמצעות מיקרוסקופ Epifluorescent ותוכנות קוד פתוח

בסיסי<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; שיטות: סנכרון תצפית

כאן מוצג כיצד לעקוב ולכמת תהליכי התפתחות ב-C. elegans. השיטות המוצגות מבוססות על כלי קוד פתוח הניתנים ליישום בקלות. הוא מודגם כיצד לשחזר מודלים תלת מימדיים בצורת תא, כיצד לעקוב באופן ידני אחר מבנים תת-תאיים וכיצד לנתח זרימת התכווצות קליפת המוח.

מעקב וכימות תהליכים התפתחותיים ב<em&gt; C. elegans</em&gt; שימוש בכלי קוד פתוח

אנו מציגים שיטת immunofluorescence מבוסס הדמיה ללוקליזציה במרחב ובזמן של ERK הפעיל הגזור ג בלוטת מין elegans. הפרוטוקול המתואר כאן ניתן להתאים להדמיה של כל איתות או חלבון מבני ג elegans בלוטת המין, סיפק מגיב נוגדן מתאים זמין.

ניתוח במרחב ובזמן של ERK פעיל<em&gt; C. elegans</em&gt; germline

שקופים C. elegans המעי יכול לשמש"ויוו הרקמה תא" ללמוד apicobasal להן קרום ו לומן ברמה תא בודד, subcellular במהלך multicellular tubulogenesis. פרוטוקול זה מתאר כיצד לשלב תיוג סטנדרטי, אובדן-של-פונקציה גנטית/RNAi וגישות מיקרוסקופיים לנתח תהליכים אלה ברמה המולקולרית.

C. elegans המעי כמו המודל עבור המערכת לומן מורפוגנזה ו Vivo ב מקוטב ממברנה להן ברמה תא בודד: תיוג על ידי נוגדנים מכתים, ניתוח אובדן RNAi-של-פונקציה והדמיה

מחקר זה מתאר את המידות הכמותיות של גודל ולוקליזציה, מורפולוגיה שרירים וצורה מיטוכונדרילית ב -C. אלגיה באמצעות כלים זמינים לעיבוד תמונות באופן חופשי. גישה זו מאפשרת לימודים עתידיים ב -C. אלגיה להשוות בין היקף רקמות ושינויים מבניים כתוצאה מוטציות גנטיות.

גישות כמותיים ללימוד מבנים סלולאריים ומורפולוגיה ארגונית בקנבאבדיוטיס

עבודה זו מתארת פרוטוקול של תפוקה חצי-גבוהה המאפשרת הדמיה בו של embryogenesis בזמן בו במהירות של 80-100 ס מ עוברים בריצה אחת ללילה. בנוסף, כלי עיבוד תמונה ופריטים חזותיים נכללים כדי לייעל את ניתוח הנתונים. השילוב של שיטות אלה עם זני כתבת מותאמים אישית מאפשר ניטור מפורט של embryogenesis.

שיטת דימות למחצה של תפוקה גבוהה וערכת כלי הדמיה של נתונים כדי לנתח את הפיתוח העובריים של ס. אלאנס

פרוטוקול זה מדגים את השימוש בסדר הקירבה הצמוד כדי לבדוק את האינטראקציות של חלבון חלבון באתרו בתוך C. אלגיה germline.

באיתור באתרו של האסיפה המורכבת של ריבונאופאנפרוטאין ב -C. אלגיה germline באמצעות שיטת הסמיכות

מחקר זה מציג פרוטוקולים עבור שתי גישות ניתוח פעילות לוקומוטור חצי אוטומטי ב C. elegans קומפלקס I מחלות גז-1(fc21) תולעים, כלומר, ZebraLab (בדיקת תפוקה בינונית) ו- WormScan (בדיקה בעלת תפוקה גבוהה) ומספקים ניתוח השוואתי בין מגוון רחב של שיטות מחקר לכימות התנהגות נמטודה ותפקוד עצבי שרירי משולב.

ניתוח השוואתי של שיטות ניסיוניות לכימות פעילות בעלי חיים בקאנורבדיטיס אלגנס מודלים של מחלות מיטוכונדריאליות

זוהי שיטה נפוצה עבור דיסקציה של גונאד C. elegans ואחריה סדק הקפאה, אשר מייצרת דגימות germline עבור immunofluorescence באמצעות צביעת נוגדנים, או עבור צביעת DAPI פשוטה כדי לדמיין DNA. פרוטוקול זה זכה להצלחה עבור סטודנטים לתואר ראשון במעבדת מחקר ובהתנסות מחקרית לתואר ראשון מבוססת קורסים.

ג. אלגנס גונד דיסקציה והקפאת סדק לאימונופלואורסצנציה וצביעת DAPI

כאן אנו מספקים הוראות לשימוש יעיל ב-SegElegans, מערכת למידה עמוקה שפיתחנו לפילוח אוטומטי של תולעים בודדות בתמונות מיקרוסקופיה רחבות, לשימוש מאוחר יותר בתוכנות ניתוח תמונות כגון ImageJ. אנו מספקים דרכים להשתמש במערכת הן באופן מקוון והן באופן לא מקוון.

ניתוח אוטומטי של תמונות פלואורסצנטיות של C. elegans באמצעות SegElegans

למד ניתוח חישובי של Germline Caenorhabditis elegans לחקר הפצת גרעינים, חלבונים ושלד תא. השיטה מייעלת את ניתוח הזרע ומפחיתה שגיאות אנוש.

ניתוח חישובית של Germline Caenorhabditis elegans ללמוד הפצה של גרעינים, חלבונים ו את שלד התא

גלה סרטונים נוספים