ניתוח חישובית של Germline Caenorhabditis elegans ללמוד הפצה של גרעינים, חלבונים ו את שלד התא
19 באפריל 2018
אנו מציגים שיטה אוטומטית עבור שחזור תלת מימדי של Caenorhabditis elegans germline. השיטה שלנו קובעת את המספר והמיקום של כל גרעין בתוך germline ו ניתוחים germline חלבון הפצה, מבנה cytoskeletal.
המטרה הכוללת של שיטה זו היא להפוך את הניתוח של קו הנבט Caenorhabditis elegans לאוטומטי כדי לחקור את התפלגות הגרעין, החלבון והשלד הציטולוגי שלו. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות המפתח בתחום C.Elegans לגבי מספר הגרעינים והזרע, התפלגות גרעינית ומבנה השלד התא של קו הנבט. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שהיא מפחיתה את זמן הניתוח, מגדילה את גודל המדגם ומבטלת את טעות האנוש הקשורה לניתוח הידני.
כדי לצלם את הדגימות, הנח שקופיות עם קווי נבט מוכתמים לתוך מחזיק השקופיות מעל האובייקט 63X של מיקרוסקופ קונפוקלי, ואתר קו נבט. התמקדו בחלק העליון של קו הנבט, וסמנו אותו בתוכנת המיקרוסקופ הקונפוקלי. לאחר שנקבע עובי קו הנבט הכולל, הגדירו את העובי של כל פרוסה עד 0.5 מיקרומטר, וסמנו את קו הנבט השלם.
לאחר מכן, התחל את הרכישה, סרוק כל פרוסה שמונה פעמים וחשב את ממוצע הערכים כדי לשפר את איכות התמונה. לאחר שכל התמונות התקבלו, ייבא את התמונות לתוכנת ניתוח תמונה מתאימה, והשתמש בכלי פונקציית פני השטח כדי לבחור את האזור המיטוטי. תופיע תמונה של הקצה הדיסטלי של קו הנבט.
בטל את אשף יצירת המשטחים האוטומטית, וצייר ידנית אזור עניין סביב האזור המיטוטי בפרוסה הראשונה והאחרונה של התמונה מהערימה התלת-ממדית. לחצו על 'צור משטח' ולאחר מכן על 'ערוץ מסיכה', כדי להוסיף מסיכה לכל הערוצים פרט לערוץ DAPI. בעזרת כלי פונקציית הספוט, הגדר את פרמטרי הגודל של האזור המיטוטי בקוטר XY של שני מיקרומטר ובקוטר Z לא מוגדר.
לחץ על הפחת רקע כדי להחסיר את הרקע. להגדרת הסף המינימלי, הגדילו את סף הרינדור התלת-ממדי המינימלי בקו נבט מסוג פרא מוכתם ב-DAPI עד שהנקודה הראשונה תופיע מחוץ לקו הנבט, וצרו מודל תלת-ממד לכל אזור. לאחר שמירת התמונות, לחץ על הטבלה כדי להציג את מספר הגרעינים כפי שנוצר אוטומטית על ידי התוכנה, ולייצא את התמונות כקבצי TIFF.
עבור אזור המעבר, צור משטח כפי שהוסבר קודם. לאחר מכן, לחצו על 'ערוץ מסיכה' כדי להוסיף מסיכה לכל הערוצים פרט לערוץ DAPI. באמצעות פונקציית נקודה, הגדר קוטר XY של שני מיקרומטר וקוטר Z של 1.5 מיקרומטר, ולחץ על חיסור רקע כדי להחסיר את הרקע.
להגדרת הסף המינימלי, הגדילו את סף הרינדור התלת-ממדי המינימלי בקו נבט מסוג פרא מוכתם ב-DAPI עד שהנקודה הראשונה תופיע מחוץ לקו הנבט, וצרו מודל תלת-ממד לכל אזור. לאחר שמירת התמונות, לחץ על הטבלה כדי להציג את מספר הגרעינים כפי שנוצר אוטומטית על ידי התוכנה, ולייצא את התמונות כקבצי TIFF. לניקוד מספר הזרע, בחר את הזרע כאזור העניין, כפי שמודגם עבור אזורי הגרעין, והשתמש בכלי פונקציית הנקודה כדי להגדיר את קוטר ה-XY בין 0.75 למיקרומטר אחד עם קוטר Z לא מוגדר כדי לזהות כל זרע.
בחר בתיבה Background Subtract והשתמש בערכי תיקון הרקע שחושבו על-ידי התוכנה כדי להחסיר את הרקע. לאחר מכן, התאם את סף העיבוד התלת-ממדי כדי לזהות את כל הזרע המוכתם ב-DAPI בזרעונים. לספירת כרומוזומים בביציות, בחר את הביציות והגדר את קוטר ה-XY כפחות מ-0.75 מיקרומטר, והגדר את הסף לפני פיתוח המודלים התלת מימדיים.
לאחר מכן, שמור את התמונות לייצוא כקובצי TIFF. לשחזור קו הנבט הציטו-שלד, זהה את האזור המיטוטי המעניין בקו הנבט וצור מסכת משטח כפי שהודגם בעבר. לחצו על 'ערוצי מסיכה' כדי להסוות את כל הערוצים פרט לתעלת הפאלוידין, והשתמשו בכלי פונקציית פני השטח להגדרת פרט פני שטח של 0.25 מיקרומטר.
לאחר הפחתת הרקע, התאימו את סף הרינדור בתלת-ממד כדי לשמור את התמונה התלת-ממדית שפותחה לייצוא כקובץ TIFF. התפלגות הגרעינים תלויה בשלב ההתמיינות. לדוגמא, באזור המיטוטי, האקטין הפנימי מופיע כמסה מוצקה שעליה מאורגנים הגרעינים.
בקו נבט מסוג בר, האזור המיטוטי מכיל כ-250 גרעינים והוא ארוז היטב בגרעינים בהשוואה לשאר קו הנבט. עם זאת, ככל שהגרעינים מתרחקים מהקצה הדיסטלי, הם נראים קרובים יותר להיקף קו הנבט, כאשר השינוי בהתפלגות מתחיל באזור המעבר ומסתיים כאשר הגרעינים נכנסים לשלב השלישי של הפרופאזה במיוזה. באזור המעבר, האקטין הפנימי של קו הנבט מקבל מבנה גלילי יותר, והופך לגליל חלול כשהוא מגיע לפאצ'יטן.
שכבת האקטין השנייה מכסה את השכבה הפנימית, ומעניקה צורה לקו הנבט. גליל זה בתוך מבנה אקטין גלילי נעלם לכיוון אזור הביציות, ובשלב זה האקטין מופיע כסיבים עבים המכסים את הביציות. בזרעונים, האקטין נוצר גם לצרורות עבים של סיבים, אם כי נראה כי סיבים אלה ארוזים קרוב יותר זה לזה מאשר באזור הביציות.
עיבוד תלת מימדי של הקצה הפרוקסימלי של קו הנבט, כפי שהודגם, חושף בממוצע 151 זרע בכל זרע. לאחר השליטה, ניתן להשלים ניתוח זה תוך 10 דקות לכל קו נבט. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להגדיר את פרמטרי הניתוח בהתאם להגדלת המטרה המשמשת להמחשת קו הנבט בניסוי שלך.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע ניתוח אוטומטי של קו נבט ולחקור את מבנה השלד הציטולוגי ולצבור את מספר הגרעינים בתוך קו הנבט.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה אוטומטית לשחזור תלת-ממדי של קו הנבט של Caenorhabditis elegans, תוך התמקדות בניתוח הגרעינים, התפלגות החלבונים ומבנה השלד התאי. מטרת השיטה היא לשפר את היעילות והדיוק של ניתוח קו הנבט.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- ביולוגיה התפתחותית
רקע
- הבנת מבנה קו הנבט של C. elegans היא קריטית למחקרי התפתחות.
- ניתוח ידני של דגימות קו נבט גוזל זמן רב ונוטה לטעויות.
- שיטות אוטומטיות יכולות לייעל תהליך זה.
- טכניקות קודמות היו חסרות יעילות בניתוח של גדלי דגימה גדולים.
מטרת המחקר
- לאוטומציה של ניתוח קו הנבט של C. elegans.
- לקביעה מדויקת של מספר הגרעינים ומיקומם.
- לניתוח התפלגות חלבונים ומבנה השלד התאי.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הדגימות נצבעות ומונחות על תרחישים לצורך דימוי.
- התרחישים ממוקמים מעל עדשה אובייקטיבית של 63X של מיקרוסקופ קונפוקלי.
- קו הנבט מאתר ומסומן באמצעות תוכנה קונפוקלית.
- עובי קו הנבט מוגדר ונחתוך לפרוסות של 0.5 micrometer.
תוצאות עיקריות
- השיטה מקצרת באופן משמעותי את זמן הניתוח.
- היא מגדילה את גודל המדגם שניתן לנתח.
- טעות אנוש הקשורה לניתוח ידני ממוזערת.
- מושג מיפוי מדויק של הגרעינים והפיזור החלבוני.
מסקנות
- שיטה אוטומטית זו משפרת את חקר קו הנבט של *C. elegans*.
- היא מספקת גישה מהימנה לניתוח מבנים ביולוגיים מורכבים.
- הטכניקה יכולה להקל על מחקרים עתידיים בביולוגיה התפתחותית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ניתוח תלת-ממדי אוטומטי של קו הנבט של *C. elegans* מאפשר סריקת פנוטיפ בבצפיפות גבוהה לצורך תיקוף של מטרות והפחתת סיכונים מכניסטיים בשלבי גילוי מוקדמים. באמצעות כימות של התפלגות הגרעינים, לוקליזציה של חלבונים ומבנה השלד התאי, השיטה תומכת בביטחון חיזוי בהתערבויות גנטיות ופארמקולוגיות. גישה זו מפחיתה שונות ידנית ומגבירה את ההדירות, ובכך מקלה על פיתוח בדיקות ניתנות להרחבה עבור מערכות רלוונטיות למחלות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות מיפוי כמותי של מיקום הגרעין ודפוסי ביטוי של חלבונים.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי אספקת תוצאות הדירות של ארכיטקטורת קו הנבט ברקעים גנטיים שונים.
- ערך חיזוי: משפר את תיקוף המטרה על ידי מתאם בין שינויים בשלד התא לבין פנוטיפים התפתחותיים, ובכך מסייע בזיהוי מועמדים מובילים (lead identification).
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר פלטיים כמותיים וסטנדרטיים עבור ספירת גרעינים, מספר תאי זרע ומבנה השלד התאי כדי לאפשר סריקת תרכובות מהימנה.
- ערך תפעולי: מגדיל את תפוקת הבדיקה והשחזור שלה באמצעות רכישה וניתוח אוטומטיים של תמונות, ובכך מפחית הטיות ידניות.
- סקילביליות (יכולת הרחבה): מקלה על הכנת מודלים מאומתים של קו נבט עבור תהליכי עבודה המשכיים במסעי סריקה פנוטיפיים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מאפשרת מידול של מערכות רלוונטיות למחלה על ידי קישור שינויים מבניים בקו הנבט לתוצאות תפקודיות בפיתוח תאי גזע ובאפופטוזיס.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מספקת תובנות לגבי דרישות התפתחותיות מרחביות באמצעות ניתוח של ארכיטקטורת השלד התאי, ובכך תומכת בדיוק של מודלים פרה-קליניים.
- קידום מותאם סיכון: תומכת בהחלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) על ידי אספקת תוצאות פנוטיפיות עקביות המבוססות על סף קבוע תחת תנאים ניסיוניים שונים.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף מטרות מוקדם, דרך זיהוי מובילים ועד להערכה פרה-קלינית, באמצעות אספקת פנוטיפים של תאי נבט סטנדרטיים וכמותיים.
- ביולוגיה של גילוי (Discovery Biology): תומכת בבדיקת השערות ובבירור מסלולים על ידי מתן אפשרות לוויזואליזציה בתלת-ממד של התפלגות הגרעין והחלבונים באזורים מובחנים של קו הנבט.
- סריקה (Screening): מספקת מוכנות לבדיקה באמצעות כימות אוטומטי וניתן לשחזור של גרעינים וזרע, מה שמאפשר הערכה מהימנה של תרכובות.
- אנליטיקה: מייצרת פלטים סטטיסטיים, כגון מדדי צפיפות גרעינית ומבנה שלד התא, המאפשרים השוואה בין תנאים ובחירת פגיעות (hits).
- מחקר תרגומי (Translational Research): מקשרת between ממצאי גילוי לרציפות פרה-קלינית על ידי קישור פנוטיפים מבניים של קו הנבט לדינמיקה של תאי גזע ולהתקדמות המיוטית.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר של דימוי ואנליזה, הישמيمه ליישום על פני רקעים גנטיים ופראדיגמות ניסוייות מרובות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי באמצעות כימות אובייקטיבי בתלת-ממד של ארכיטקטורת הנבט, ובכך מפחית עמימות מכניסטית.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה והיכולת להרחבה (scalability) על ידי מזעור שגיאות אנוש ואפשרות לניתוח מהיר (10 דקות לנבט).
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי הגדלת גודל המדגם והאצת החלטות go/no-go בתהליכי תיקוף מטרות (target validation pipelines).
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכון על ידי אספקת נתונים פנוטיפיים ניתנים לשחזור להערכת תרכובות מובילות (lead compounds).
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות במיקרוסקופיה קונפוקלית ובתוכנות לניתוח תמונות בתלת-ממד לצורך סגמנטציה מדויקת של קו הנבט וקביעת ספי רגישות (threshold).
- תלוי בגישה למיקרוסקופ קונפוקלית עם עדשת אובייקטיב 63X ויכולות צביעה פלואורסצנטית עבור DAPI, פאלואידין ומטרות חלבוניות.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרמטרי רכישת תמונה (עובי פרוסה, מיצוע, חיסור רקע) כדי להבטיח שחזוריות.
- נדרשת התאמה של הגדרות אזורי העניין (ROI) ופרמטרים של פונקציית נקודות (spot function) כאשר השיטה מיושמת על רקעים גנטיים או פרוטוקולי צביעה שונים.
- מגבלות מעשיות כוללות את הצורך בפרוטוקולי צביעה והטמעה (mounting) אופטימליים כדי לשמר את מבנה קו הנבט לצורך שחזור תלת-ממדי מדויק.
