ניתוח חישובית של Germline Caenorhabditis elegans ללמוד הפצה של גרעינים, חלבונים ו את שלד התא
19 באפריל 2018
אנו מציגים שיטה אוטומטית עבור שחזור תלת מימדי של Caenorhabditis elegans germline. השיטה שלנו קובעת את המספר והמיקום של כל גרעין בתוך germline ו ניתוחים germline חלבון הפצה, מבנה cytoskeletal.
המטרה הכוללת של שיטה זו היא להפוך את הניתוח של קו הנבט Caenorhabditis elegans לאוטומטי כדי לחקור את התפלגות הגרעין, החלבון והשלד הציטולוגי שלו. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות המפתח בתחום C.Elegans לגבי מספר הגרעינים והזרע, התפלגות גרעינית ומבנה השלד התא של קו הנבט. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שהיא מפחיתה את זמן הניתוח, מגדילה את גודל המדגם ומבטלת את טעות האנוש הקשורה לניתוח הידני.
כדי לצלם את הדגימות, הנח שקופיות עם קווי נבט מוכתמים לתוך מחזיק השקופיות מעל האובייקט 63X של מיקרוסקופ קונפוקלי, ואתר קו נבט. התמקדו בחלק העליון של קו הנבט, וסמנו אותו בתוכנת המיקרוסקופ הקונפוקלי. לאחר שנקבע עובי קו הנבט הכולל, הגדירו את העובי של כל פרוסה עד 0.5 מיקרומטר, וסמנו את קו הנבט השלם.
לאחר מכן, התחל את הרכישה, סרוק כל פרוסה שמונה פעמים וחשב את ממוצע הערכים כדי לשפר את איכות התמונה. לאחר שכל התמונות התקבלו, ייבא את התמונות לתוכנת ניתוח תמונה מתאימה, והשתמש בכלי פונקציית פני השטח כדי לבחור את האזור המיטוטי. תופיע תמונה של הקצה הדיסטלי של קו הנבט.
בטל את אשף יצירת המשטחים האוטומטית, וצייר ידנית אזור עניין סביב האזור המיטוטי בפרוסה הראשונה והאחרונה של התמונה מהערימה התלת-ממדית. לחצו על 'צור משטח' ולאחר מכן על 'ערוץ מסיכה', כדי להוסיף מסיכה לכל הערוצים פרט לערוץ DAPI. בעזרת כלי פונקציית הספוט, הגדר את פרמטרי הגודל של האזור המיטוטי בקוטר XY של שני מיקרומטר ובקוטר Z לא מוגדר.
לחץ על הפחת רקע כדי להחסיר את הרקע. להגדרת הסף המינימלי, הגדילו את סף הרינדור התלת-ממדי המינימלי בקו נבט מסוג פרא מוכתם ב-DAPI עד שהנקודה הראשונה תופיע מחוץ לקו הנבט, וצרו מודל תלת-ממד לכל אזור. לאחר שמירת התמונות, לחץ על הטבלה כדי להציג את מספר הגרעינים כפי שנוצר אוטומטית על ידי התוכנה, ולייצא את התמונות כקבצי TIFF.
עבור אזור המעבר, צור משטח כפי שהוסבר קודם. לאחר מכן, לחצו על 'ערוץ מסיכה' כדי להוסיף מסיכה לכל הערוצים פרט לערוץ DAPI. באמצעות פונקציית נקודה, הגדר קוטר XY של שני מיקרומטר וקוטר Z של 1.5 מיקרומטר, ולחץ על חיסור רקע כדי להחסיר את הרקע.
להגדרת הסף המינימלי, הגדילו את סף הרינדור התלת-ממדי המינימלי בקו נבט מסוג פרא מוכתם ב-DAPI עד שהנקודה הראשונה תופיע מחוץ לקו הנבט, וצרו מודל תלת-ממד לכל אזור. לאחר שמירת התמונות, לחץ על הטבלה כדי להציג את מספר הגרעינים כפי שנוצר אוטומטית על ידי התוכנה, ולייצא את התמונות כקבצי TIFF. לניקוד מספר הזרע, בחר את הזרע כאזור העניין, כפי שמודגם עבור אזורי הגרעין, והשתמש בכלי פונקציית הנקודה כדי להגדיר את קוטר ה-XY בין 0.75 למיקרומטר אחד עם קוטר Z לא מוגדר כדי לזהות כל זרע.
בחר בתיבה Background Subtract והשתמש בערכי תיקון הרקע שחושבו על-ידי התוכנה כדי להחסיר את הרקע. לאחר מכן, התאם את סף העיבוד התלת-ממדי כדי לזהות את כל הזרע המוכתם ב-DAPI בזרעונים. לספירת כרומוזומים בביציות, בחר את הביציות והגדר את קוטר ה-XY כפחות מ-0.75 מיקרומטר, והגדר את הסף לפני פיתוח המודלים התלת מימדיים.
לאחר מכן, שמור את התמונות לייצוא כקובצי TIFF. לשחזור קו הנבט הציטו-שלד, זהה את האזור המיטוטי המעניין בקו הנבט וצור מסכת משטח כפי שהודגם בעבר. לחצו על 'ערוצי מסיכה' כדי להסוות את כל הערוצים פרט לתעלת הפאלוידין, והשתמשו בכלי פונקציית פני השטח להגדרת פרט פני שטח של 0.25 מיקרומטר.
לאחר הפחתת הרקע, התאימו את סף הרינדור בתלת-ממד כדי לשמור את התמונה התלת-ממדית שפותחה לייצוא כקובץ TIFF. התפלגות הגרעינים תלויה בשלב ההתמיינות. לדוגמא, באזור המיטוטי, האקטין הפנימי מופיע כמסה מוצקה שעליה מאורגנים הגרעינים.
בקו נבט מסוג בר, האזור המיטוטי מכיל כ-250 גרעינים והוא ארוז היטב בגרעינים בהשוואה לשאר קו הנבט. עם זאת, ככל שהגרעינים מתרחקים מהקצה הדיסטלי, הם נראים קרובים יותר להיקף קו הנבט, כאשר השינוי בהתפלגות מתחיל באזור המעבר ומסתיים כאשר הגרעינים נכנסים לשלב השלישי של הפרופאזה במיוזה. באזור המעבר, האקטין הפנימי של קו הנבט מקבל מבנה גלילי יותר, והופך לגליל חלול כשהוא מגיע לפאצ'יטן.
שכבת האקטין השנייה מכסה את השכבה הפנימית, ומעניקה צורה לקו הנבט. גליל זה בתוך מבנה אקטין גלילי נעלם לכיוון אזור הביציות, ובשלב זה האקטין מופיע כסיבים עבים המכסים את הביציות. בזרעונים, האקטין נוצר גם לצרורות עבים של סיבים, אם כי נראה כי סיבים אלה ארוזים קרוב יותר זה לזה מאשר באזור הביציות.
עיבוד תלת מימדי של הקצה הפרוקסימלי של קו הנבט, כפי שהודגם, חושף בממוצע 151 זרע בכל זרע. לאחר השליטה, ניתן להשלים ניתוח זה תוך 10 דקות לכל קו נבט. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להגדיר את פרמטרי הניתוח בהתאם להגדלת המטרה המשמשת להמחשת קו הנבט בניסוי שלך.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע ניתוח אוטומטי של קו נבט ולחקור את מבנה השלד הציטולוגי ולצבור את מספר הגרעינים בתוך קו הנבט.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה אוטומטית לשחזור תלת-ממדי של קו הנבט של Caenorhabditis elegans, תוך התמקדות בניתוח הגרעינים, התפלגות חלבונים ומבנה השלד התאי. השיטה נועדה לשפר את היעילות והדיוק של ניתוח קו הנבט.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- ביולוגיה התפתחותית
רקע
- הבנת מבנה קו הנבט של C. elegans חיונית למחקרי התפתחות.
- ניתוח ידני של דגימות קו נבט גוזל זמן רב ונוטה לטעויות.
- שיטות אוטומטיות יכולות לייעל תהליך זה.
- טכניקות קודמות היו חסרות יעילות בניתוח גדלי דגימה גדולים.
מטרת המחקר
- לאוטומציה של ניתוח קו הנבט של *C. elegans*.
- לקביעה מדויקת של מספר הגרעינים ומיקומם.
- לניתוח פיזור חלבונים ומבנה השלד התאי.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הדגימות נצבעות ומונחות על תויות לצורך דימות.
- התויות ממוקמות מעל עדשה אובייקטיבית של 63X במיקרוסקופ קונפוקאלי.
- קו הנבט מאתר ומסומן באמצעות תוכנת מיקרוסקופיה קונפוקאלית.
- עובי קו הנבט מוגדר ונחתוך לפרוסות בעובי 0.5 µm.
תוצאים עיקריים
- השיטה מקטינה באופן משמעותי את זמן האנליזה.
- היא מגדילה את גודל המדגם שניתן לנתח.
- השגיאה האנושית הקשורה לאנליזה ידנית ממוזערת.
- הושגה מיפוי מדויק של הגרעינים ושל התפלגות החלבונים.
מסקנות
- שיטה אוטומטית זו משפרת את חקר קו הנבט של C. elegans.
- היא מספקת גישה מהימנה לניתוח מבנים ביולוגיים מורכבים.
- הטכניקה יכולה לסייע למחקרים עתידיים בביולוגיה התפתחותית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ניתוח תלת-ממדי אוטומטי של קו הנבטה ב-C. elegans מאפשר סריקה פנוטיפית בעלת תפוקה גבוהה לצורך תיקוף של מטרות והורדת סיכונים מכניסטיים בשלבי הגילוי המוקדמים. באמצעות כימות התפלגות הגרעינים, לוקליזציה של חלבונים ומבנה השלד התאי, השיטה תומכת בביטחון ניבוי בהתערבויות גנטיות ופרמקולוגיות. גישה זו מפחיתה שונות ידנית ומגבירה את השחזוריות, ובכך מקלה על פיתוח בדיקות ניתנות להרחבה עבור מערכות הרלוונטיות למחלות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטיים
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של השערות טיפוליות באמצעות מיפוי כמותי של מיקום הגרעין ודפוסי ביטוי של חלבונים.
- ערך תפעולי: מסייע בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי אספקת תוצאות הניתנות לשחזור של ארכיטקטורת הגרמליין ברקעים גנטיים שונים.
- ערך ניבוי: משפר את תיקוף המטרה על ידי קורלציה בין שינויים בשלד התא לפנוטיפים התפתחותיים, ובכך מסייע בזיהוי מולקולות מובילות (leads).
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- ערך מדעי: מייצר פלטים כמותיים וסטנדרטיים לספירת גרעינים, מספר תאי זרע ומבנה השלד התאי, כדי לאפשר סריקת תרכובות אמינה.
- ערך תפעולי: מגדיל את תפוקת הבדיקה ואת השחזוריות שלה באמצעות רכישה וניתוח אוטומטיים של תמונות, ובכך מפחית הטיות ידניות.
- יכולת התרחבות: מקל על הכנת מודלים מאושרים של קווי נבט עבור זרימות עבודה המשך במערכות סריקה פנוטיפיות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מאפשרת מידול של מערכות רלוונטיות למחלה על ידי קישור שינויים מבניים בקו הנבט לתוצאות תפקודיות בהתפתחות תאי גזע ובאפופטוזה.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מספקת תובנה לגבי דרישות התפתחותיות מרחביות באמצעות ניתוח ארכיטקטורת השלד התאי, ובכך תומכת בדיוק של מודלים פרה-קליניים.
- קידום מותאם סיכונים: תומכת בהחלטות go/no-go באמצעות אספקת קריאות פנוטיפיות עקביות ומבוססות סף לאורך תנאים ניסויים שונים.
שילוב תהליכים וזרימת עבודה
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף מטרות מוקדם, דרך זיהוי מובילים ועד להערכה פרה-קלינית, באמצעות אספקת פנוטיפים של קו נבט סטנדרטיים וכמותיים.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות ובבירור מסלולים ביולוגיים על ידי מתן אפשרות לוויזואליזציה בתלת-ממד של התפלגות גרעינים וחלבונים באזורים שונים של קו הנבט.
- סריקה: מספקת מוכנות לבדיקה באמצעות כימות אוטומטי וניתן לשחזור של גרעינים וזרעים, מה שמאפשר הערכה מהימנה של תרכובות.
- אנליטיקה: מייצרת פלטי סטטיסטיים, כגון מדדי צפיפות גרעינית ומבנה שלד התא, המאפשרים השוואה בין תנאים שונים ובחירת פגיעות (hits).
- מחקר תרגומי: מקשרת בין ממצאי הגילוי לרצף פרה-קליני על ידי קישור פנוטיפים מבניים של קו הנבט לדינמיקה של תאי גזע ולהתקדמות המיוטית.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר של דימוי ואנליזה, הישימה על רקעים גנטיים ופראדיגמות ניסיוניות מרובות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי באמצעות כימות אובייקטיבי בתלת-ממד של ארכיטקטורת קו הנבט, ובכך מפחית עמימות מכניסטית.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה והיכולת להרחבה (scalability) על ידי מזעור שגיאות אנוש ואפשרות לניתוח מהיר (10 דקות לכל קו נבט).
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי הגדלת גודל המדגם והאצת החלטות go/no-go בתהליכי תיקוף מטרות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכון על ידי אספקת נתונים פנוטיפיים הניתנים לשחזור לצורך הערכה של תרכובות מובילות.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות במיקרוסקופיה קונפוקלית ובתוכנה לניתוח תמונות בתלת-ממד לצורך סגמנטציה מדויקת של השבט (germline) וקביעת סף (threshold).
- תלוי בגישה למיקרוסקופ קונפוקלי עם עדשה של 63X ויכולות צביעה פלורסצנטית עבור DAPI, פאלואידין ומטרות חלבון.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים של פרמטרי רכישת תמונות (עובי פרוסה, מיצע, הסרת רקע) כדי להבטיח הדירות.
- נדרשת התאמה של הגדרות אזורי עניין (region-of-interest) ופרמטרים של פונקציית נקודות (spot function) כאשר הם מיושמים על רקעים גנטיים או פרוטוקולי צביעה שונים.
- מגבלות מעשיות כוללות את הצורך בפרוטוקולי צביעה והרכבה (mounting) אופטימליים כדי לשמר את מבנה השבט לצורך שחזור תלת-ממדי מדויק.
