גישה Microfluidic המבוססות על Droplet ו ננו-ספירה-PCR הגברה עבור חד גדילי DNA Amplicons

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בטכניקה הקומבינטורית של המערכת המיקרופלואידית ובתחום הביוטכנולוגיה המולקולרית, כגון מכשירים מיקרופלואידיים ושיטת PCR אטימטרית. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם ייצור יעיל של מיקרוספרות הומוגניות מאוד וייצור דנ"א חד-גדילי ללא כל צעדי הפרדה נוספים. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על אבחון או טיפול במחלות שונות.

מכיוון שדור של דנ"א חד-גדילי הוא המפתח לבדיקות AP-ta-mo-sis, ניתן להשתמש בו לגילוי וטיפול. למרות שיטה זו יכולה לספק תובנה לתוך מערכת microfluidic תלת מימדי ב MEMS, זה יכול להיות מיושם גם על מערכות אחרות המשמשות לגילוי וטיפול במחלה. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו לשלוט כראוי בנוזלים מזרימה בכיוון ההפוך.

הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית כדי לבחון את היווצרות המיקרוספרה בגיאומטריה התמקדות זרימה והתמצקות של מיקרוספרות שנוצרו. ראשית, להכין 20 מיליליטר של נוזל PDMS טרום פולימר על ידי ערבוב פולימר בסיס זרז ביחס של 10 ל-1. יוצקים 10 מיליליטר של PDMS נוזלי על תבנית SU-8 מוכן על רקיק סיליקון עבור החלק העליון של הרשת microfluidic.

עבור החלק השטוח התחתון, יוצקים את אותו נפח של PDMS נוזלי על רקיק הסיליקון ללא מבנה עובש. מניחים שני ופלים סיליקון מצופה PDMS נוזלי טרום פולימר על hotplate שחומם מראש לרפא ב 75 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. לאחר מכן, לקלף באופן ידני את שכבת PDMS נרפא מן התבנית SU-8.

יישר כלי ניקוב חורים עגול בקוטר 1.5 מילימטר ליציאת השמן ברשת המיקרופלואידית המשוכפלת לצורך התממשקות בין ערוצי זרימה בקנה מידה מיקרון עם דגימות נוזלי המאקרו. ואז באופן ידני אגרוף החוצה את החור. לאחר חזרה על תהליך החבטות שלוש פעמים, בצעו טיפול משטח הידרופילי בשכבות PDMS העליונות והתחתונות באמצעות מטפל קורונה כף יד למשך מספר שניות לכל דגימה.

ערמו שתי שכבות PDMS שטופלו בפלזמה וחום ב-90 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות על לוחית חמה לתהליך ההתחברות בין PDMS ל-PDMS. וורטקס וצנטריפוגה לזמן קצר גשוש סטנדרטי עם תווית אקרימיט DNA חד-גדילי ופתרון מניית אקרילאמיד 19 ל-1. הכן פתרון אחד על ידי ערבוב 25 מיקרוליטרים של 40%acrylamide ביס פתרון, 10 microliters של DNA חד גדילי, 10 microliters של חיץ TBE 5X, וחמישה microliters של מים.

הכינו פתרון שני עם 50 מיקרוליטרים של 20% אמוניום משכנע. הכינו שני מזרקים בנפרד מלאים בתתכונה אחת ופתרון 2 והרמו אותם על משאבת המזרק כדי להכניס תזרימי פתרון לפלטפורמה המיקרופלואידית. הכינו שמן מינרלי מעורבב עם 0.4% TEMED ליצקות פני השטח של המיקרוספרה.

לאחר מילוי בקבוק זכוכית בשמן המינרלי, הכנס שני צינורות ליציאות הפנאומטיות והנוזליות בכובע בקבוק הזכוכית כמאגר מיקרופלואידי. חבר צינורות בין בקבוק הזכוכית ליציאת השמן במכשיר המיקרופלואידי. חבר את הצינורות לשתי יציאות הפתרון בהתקן המיקרופלואידי כדי לספק את שני הפתרונות ממשאבות המזרק.

לאחר מכן הכנס את הצינורות ליציאת השקע כדי להעביר את המיקרוספרה שנוצרה לתוך הקוסם. לאחר מכן, הגדר את קצב הזרימה של משאבת המזרק ל-0.4 עד 0.7 מיליליטר לשעה. התאם את לחץ האוויר הדחוס של המדחס באמצעות ווסת.

מניחים זכוכית עם פס ערבוב מגנטי על לוחית חמה ולהגדיר את מהירות הסיבוב. להפעיל את משאבת המזרק ולספק את האוויר הדחוס שנוצר על ידי מדחס חיצוני לתוך בקבוק הזכוכית באמצעות שליטה on-off של שסתום אלקטרומגנטי. באמצעות מיקרוסקופ דיגיטלי, להתבונן היווצרות של מיקרוספרות בגיאומטריה התמקדות זרימה והתמצקות של מיקרוספרות שנוצר ב זכוכית.

התבוננות בהיווצרות מיקרוספרות היא אחד הצעדים הקריטיים ביותר מכיוון שזהו תהליך מרכזי במחקר זה לייצור מיקרוספרות ומיקרופלואידיות. לאחר מכן, להעביר 100 microliters של מיקרוספרות לצינור מיקרו צנטריפוגה 1.5 מיליליטר. לאחר מכן הסר את העל-טבעי באמצעות צנטריפוגות עדינות וצנרת.

השתמשו מחדש בציאנין-3 המשלים שעבר שינוי בדיקה באמצעות 100 מיקרוליטרים של מאגר TE 1X כדי להשיג ריכוז סופי של 100 מיקרומולרים. לאחר מכן, הוסיפו 100 מיקרומולרים של ציאנין-3 משלים שעבר שינוי בדיקה לצינור מיקרו-צנטריפוגה סטרילי של 1.5 מיליליטר המכיל מיקרוספרות קופולימרים AP. הקש על הצינור כמה פעמים כדי לערבב ותדרגר בטמפרטורת החדר בחושך במשך שעה אחת.

לאחר הדגירה, השלך את העל-טבעי והסר את המאגר השיורי באמצעות צינורות. לאחר מכן שטפו שלוש פעמים עם 500 מיקרוליטרים של מאגר TE. מניחים את המיקרוספרות על מגלשת זכוכית של 75 על 50 מילימטר ומכסים בנייר אלומיניום לפני ההדמיה.

השג כ-25 מיקרוספרות באמצעות ספירה מיקרוסקופית באמצעות מיקרוסקופ אור עם הגדלה של פי 40. לאחר מכן, שלב את כל הריג'ים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. מקם את הדגימות לתוך תרמוסיקלר והתחל את ה- PCR האסימטרי בתנאים המתאימים.

האוסף של PCR על-טבעי לאחר אסימטרי הוא אחד הצעדים הקריטיים ביותר מכיוון שהוא תהליך מרכזי ליצירת דנ"א חד-גדילי עם מיקרוספרה. לאחר ההגברה, הוסיפו שמונה מיקרוליטרים של מאגר טעינה פי 6 לכל דגימה. טוענים 15 מיקרוליטרים של כל דגימה לתוך 2% ג'ל אגרוז.

לאחר מכן לבצע אלקטרופורזה ב 100 וולט במשך 35 דקות במאגר 1X TAE. מניחים את המיקרוספרות ההיברידיות במחזיק ומצמידים את המחזיק לשלב של מיקרוסקופ קונפוקל. בחר את הלייזר והדליק אותו בבקרת הלייזר.

בחרו בעדשת המטרה בבקרת המיקרוסקופ. לאחר מכן בחר את המסנן הרצוי עבור cyanine-3 וערוץ בפקד התצורה. לבסוף, להתחיל את הניסוי ולצפות המדגם.

הפלטפורמה המיקרופלואידית הפולימרית המפוברקת מבוססת טיפות מורכבת משתי שכבות PDMS. שלושה סוגים של רשתות ערוצים מיקרופלואידיות משמשים ליצירת מיקרוספרות, המתמקדות בזרימה בגיאומטריה, ערוץ סרפנטין לערבוב פתרונות 1 ו-2, וערוץ פולימריזציה ליצר מיקרוספרה. מערכת בקרה פנאומטית מבוססת מעבדה לזרימה רציפה של השמן המינרלי ושתי משאבות מזרק לזרימת התמרון שימשו ליצירת מיקרוספרות בפלטפורמה המיקרופלואידית.

אם המיקרוספרות מתפקדות כראוי עם בדיקת הדנ"א האקרימיטית בת חמשת הפריים, הן אמורות לגרום לכיסוי פעילות פלואורסצנטית על פני השטח במהלך ניסוי ההכלאה כפי שמוצג בתמונות פלואורסצנטיות אלה. אם הפולימריזציה לא תתרחש כראוי, תמונת המיקרוספרה האופטית תפגין זיהום פנימי בתוך המיקרוספרות. מניפולציה של פני השטח 3D של מיקרוספרות עם DNA אוליגו-בדיקה הוא תהליך הרבה יותר מהר פלטפורמת סינתזה מיקרוספרה בזרימה יכול לספק כלי להגברה וטיהור DNA חד גדילי.

AP קופולימרט בתחילה חמישה ראשים מספק קצה הידרוקסיל שלושה ראשים עבור פילמור DNA לאחר חישול לתבנית המשלימה שלה. מזהמי דנ"א דו-גדילים נצפו בניסוי PCR אסימטרי. הדנ"א החד-גדילי שנוצר ממיקרוספרה PCR הודגם בהשוואה לסמני הגודל הסינתטיים באמצעות ניתוח אלקטרופורזה של ג'ל.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור כי ידע מוקדם של פרוטוקולים והתאמות הדרושים בדרך כלל לאופטימיזציה של ניסויי PCR נדרשים להשגת מחזור ההגברה, טמפרטורת חישול ורצף בדיקה בשיטה זו. לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום האבחון והטיפול לחיבור שני אזורים בביוטכנולוגיה מולקולרית וביו-רפואית. אל תשכח כי עבודה עם פתרון אקרילאמיד יכול להיות מסוכן אמצעי זהירות כגון לבישת כפפות חלוקי מעבדה תמיד יש לנקוט בעת ביצוע הליך זה.