ביצוע הנוצרות על-ידי ההטיה של חלקיקים דמויי וירוס PEGylated פלורסנט מאת כימיה Dibromomaleimide-דיסולפידי

המטרה הכללית של שיטת הביו-קונג'וגציה (bio-conjugation) זו היא פונקציונליזציה פלואורסצנטית של חלקיקים דמויי נגיף (virus-like particles) המכילים גשרי דיסולפיד. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתגובת הביו-קונג'וגציה עבור חלקיקים דמויי נגיף בעלי מספר מוגבל של שאריות חומצות אמינו שניתן לבצע להן פונקציונליזציה. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שבאמצעות תגובה אחת ניתן להחדיר קבוצות פונקציונליות חדשות וליצור בו-זמנית פלואורופורים המושרים על ידי קונג'וגציה. מעבר ל-Q-Beta, אנו מאמינים שניתן להחיל תגובה זו על כל חלקיק דמוי נגיף בעל קשרי דיסולפיד.

לפני תחילת הפרוצדורה לביטוי הבקטריופאג Q-Beta, נקה את משטח העבודה באמצעות תמיסה של bleach: ethanol ביחס של 1:1. בסביבה אספטית, הכן שתי תרביות התנעה של 3 mL על ידי הוספת מושבות בודדות של E.coli BL21 למצע SOB. גדל את התרביות בחדר בטמפרטורה של 37 °C ובלחות יחסית של 0% עם ניעור במהירות של 250 rpm למשך הלילה. למחרת, הוצא את שתי תרביות ההתנעה של 3 mL מהניעור ובסביבה אספטית העבר כל תרבית התנעה לבקבוק ארלנמייר עם מחיצות (baffled) בנפח של 2 L המכיל ליטר אחד של מצע SOB טרי. הנח את שני הבקבוקים עם המצע המוחדר על ניעור במהירות של 250 rpm בחדר בטמפרטורה של 37 °C ובלחות יחסית של 0%. גדל את החיידקים עד שיגיעו לצפיפות אופטית ב-600 ננומטר, או OD 600, של 0.9 עד 1.0. תהליך זה אורך בדרך כלל כחמש שעות. כאשר התרביות מגיעות ל-OD 600 הרצוי, השתמש בפיפט P1000 כדי להוסיף 1 mL של IPTG בריכוז 1 M לכל בקבוק כדי להשרות את ביטוי החלבון. השאר את הבקבוקים על הניעור בחדר החם למשך הלילה.

בבוקר למחרת, הוציאו את הבקבוקים מהמנער, העבירו את תכולת כל בקבוק לבקבוק בנפח של ליטר אחד, וסבבבבו בצנטריפוגה במהירות של 20,621 ×g בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך שעה אחת כדי לאסוף את התאים. עם סיום הסבב בצנטריפוגה, השליכו את הנוזל העליון על ידי שפיכתו לבקבוק המכיל כ-5 מיליליטר של תמיסת הלבנה כדי להמית את החיידקים.

כדי לאסוף את משקע התאים, השתמשו בשפכד (spatula) כדי לגרד את משקע התאים מתחתית בקבוק הצנטריפוגה והעבירו את המשקע לפרועת צנטריפוגה בנפח 50-milliliter.

כדי להתחיל את הליך טיהור ה-Q-Beta, השביו כל משקע תאים ב-20 עד 30 מיליליטר של בופר פוטסיום פוספט 0.1-molar, pH 7. ודאו שהסספנסיה אינה מכילה גושים. קרעו את התאים באמצעות מעבד microfluidizer לפי פרוטוקול היצרן. קרעו את התאים לפחות פעמיים כדי להגדיל את תפוקת החלקיקים. העבירו את הליזאטים לבקבוקי צנטריפוגה של 250 מיליליטר וסובבו ב-20,621 ×g בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך שעה אחת. מדדו את נפח העילוי במיליליטרים. הכפילו ערך זה ב-0.265 והוסיפו לעילוי כמות זו בגרמים של אמון סולפט. הוסיפו מגנט ערבוב וערבבו על פלטת ערבוב ב-200 rpm בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך שעה אחת לפחות כדי להשקיע את החלבון. סובבו בבקבוקים של 250 מיליליטר ב-20,621 ×g בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך שעה. השליכו את העילוי והשביו את המשקע עם כ-40 מיליליטר של בופר פוטסיום פוספט 0.1-molar, pH 7. הוסיפו לדגימה הגולמית נפחים שווים של כלורפורם: n-Butanol ביחס של 1:1 וערבבו בוורטקס למשך מספר שניות. העבירו את התערובת לשפרו של 38 מיליליטר. סובבו ב-20,621 ×g בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. השתמשו בפיפטה כדי לאסוף את השכבה המימיה העליונה. היזהרו לא לשאוב דבר מהשכבה הג'לטינית שנוצרה בין השכבה המימית לשכבה האורגנית.

בשלב הבא, הפשיתו 65% עד 40% ממעגלי סוכרוז שהוכנו מראש. טענו כ-two milliliters של התמצית לתוך כל מעגל.

ביצוע סבב באולטרה-צנטריפוגה ב-99,582g בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך 16 שעות עם האטה חופשית. עם סיום האולטרה-צנטריפוגה, האסירה אור מדיודה (LED) מתחת לכל מבחנה כדי לוודא שנראה פס כחול. השתמשי במזרק עם מחט ארוכה כדי לאסוף חלקיקים אלו. ביצוע אולטרה-סבב לחלקיקים ב-370,541g בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך 2.5 שעות. המשקע שהתקבל של החלקיקים המנוקים צריך להיות שקוף. השליכי את הנוזל העליון (supernatant) ותוסי את המשקע בבופר פוטסיום פוספט 0.1-molar, pH 7.

סכימה זו מציגה את הצמידה (conjugation) שתוצג. 10 מולות שקולות של Tris(2-carboxyethyl)phosphine או TCEP ביחס לדיסולפידים במיליגרם אחד של Q-Beta משמשות להרדוקציה של כל הדיסולפידים כדי ליצור קפסידי Q-Beta מחוזרים בטמפרטורת החדר בתוך שעה אחת. רגע לפני ביצוע ההרדוקציה של הדיסולפידים ב-Q-Beta, הכין תמיסת TCEP טרייה.

המס 0.002 גרם של TCEP במיליליטר אחד של מים אולטרה-טהורים כדי להכין תמיסתו סטוק בריכוז 100X. הוסף 200 µL של Q-Beta בריכוז 5 mg/mL לפרועטת מיקרוצנטריפוגה. לאחר מכן, הוסף 20 µL מתמיסת הסטוק 100X של TCEP לפרועטת המיקרוצנטריפוגה. הדגר בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת.

בינתיים, הכינו את תמיסת ה-dibromo-maleimide polyethylene glycol או DB-PEG עבור תגובת הגישור מחדש של דיסולפידים שסוכו שתתבצע בהמשך. המיסו 0.0017 גרם של DB-PEG ב-100 µL של dimethylformamide. הוסיפו 680 µL של תמיסת sodium phosphate בריכוז 10 mM, pH 5. לאחר מכן, הוסיפו את ה-Q-Beta השסוע לתמיסת ה-DB-PEG ועקבו אחר תהליך הערבוב תחת מנורת UV ידנית של 365 nm. עם הערבוב, אמורה להופיע באופן מיידי פלואורסצנציה צהובה בהירה. הניחו לתגובה להתרחש בטמפרטורת החדר על מערבל סיבובי (rotisserie) למשך הלילה.

בבוקר למחרת, טהרו את תערובת התגובה באמצעות מסנן צנטריפוגי תוך שימוש ב-1X PBS ב-3,283 ×g בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. לבסוף, נטרו את הצימוד באמצעות אלקטרופורזה בג'ל פוליאקרילאמיד SDS ללא חומר מחזר ואלקטרופורזה בג'ל אגרוז נטיב.

הסמיכה (conjugation) של DB-PEG על Q-Beta אומתה באמצעות כדיחרולוזה של SDS polyacrylamide gel electrophoresis בתנאים לא מחזרים תחת קרינת UV וצביעת Coomassie blue. כל הפסים הפלואורסצנטיים נמצאו במיקום זהה לצביעת ה-Coomassie blue, מה שמעיד על סמיכה מוצלחת. השלמות של תסמיכות Q-Beta-PEG אומתה באמצעות native agarose gel electrophoresis ומיקרוסקופיה אלקטרונית חודרת (transmission electron microscopy).

המיקרוגרף העליון מראה Q-Beta-maleimide או Q-Beta-M והמיקרוגרף התחתון מראה Q-Beta-PEG. ספקטרוסקופיית פלואורסצנציה של Q-Beta-M ו-Q-Beta-PEG בבופר פוספט פוטסיום בריכוז 0.1 molar הראתה מקסימום עירור סביב 400 nanometers ומקסימום פליטה סביב 540 עד 550 nanometers. כאשר Q-Beta-PEG דגרו עם תאי מקרופאג של עכבר במצע DMEM ללא סרום, ולאחריו צביעה גרעינית, תמונות קו-לוקליזציה מראות כי חלקיקים פלואורסצנטיים צהובים נקלטו על ידי התאים וניתן לעקוב אחריהם לאחר ארבע שעות של דגירה.

לעומת זאת, חלקיקים דמויי נגיף Q-Beta שאינם פונקציונליים מראים פלואורסצנציה זניחה.

פרוטוקול זה יכול לסייע לחוקרים לטהר Q-Beta תוך ארבעה ימים ולבצע את תגובת הצמידה (conjugation) של הריברידג' (re-bridging) במהלך הלילה. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור שתגובת הצמידה עובדת בצורה מיטבית בתנאים חומציים, כגון pH 5.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן טיהור Q-Beta VLP ויצירה מחודשת של קשרי דיסולפיד באמצעות תרכובות dibromo-maleimide כדי ליצור VLP מסומן פלואורסצנטית. לאחר פיתוחה, סיפקה טכניקה זו לחוקרים ידית פונקציונלית נוספת שניתן להשתמש בה לצורך פונקציונליזציה כפולה של פני השטח החיצוניים של הבקטריופאג Q-Beta.