Name: הקלטה במרחב מוגבל תנודות בהיפוקמפוס מתנהגים באופן עכברים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-01T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: למדו הקלטת פוטנציאלי שדה מקומיים בהיפוקמפוס של עכברים תוך שימוש במשטחי סיליקון רב-להביים. ניתוח צפיפות מקור הזרם מאפשר זיהוי תנודות מקומיות שאינן ניתנות לגילוי בשיטות רגילות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנחנו אסירי תודה קארין וינטרהאלטר, קרסטין Semmler לקבלת סיוע טכני עבודה זו נתמכה על ידי האשכול של מצוינות BrainLinks - BrainTools (סיפורה ה 1086) של קרן המחקר הגרמני.

כל השיטות המערבות בעלי חיים החיים אושרו על-ידי פרייבורג Regierungspräsidium לפי חוק רווחת בעלי חיים גרמנית.
1. תכשירים
<ol><li>לתכנן ולבנות כלי הכניסה המתאים transiently נושאת את החללית הסיליקון ואת המחבר אלקטרודה במהלך תהליך ההשתלה. לקבלת כלי מותאם אישית הכניסה בנוי דוגמה, ראה איור 1 .</li>
	<li>בזהירות לשחרר את הסיליקון החללית ואת אלקטרודה מחבר מאריזתו באמצעות מלקחיים שקצהו קרמיקה.</li>
	<li>הרם את לוח מחבר, בצורה מאובטחת לתקן אותו עם מלחציים תנין המצורפת עמדה.</li>
	<li>שימוש של סטריאוסקופ, יישר את המכשיר בעזרת הכלי הכניסה עם מלקחיים שקצהו קרמיקה. למרוח שכבה ~ 2 מ מ של פרפין שעווה מומסת עם cauterizer להדביק את החללית ההכנסה לכלי. הקפידו לא נוגעים של שנקס בדיקה במהלך הליך זה.</li>
	<li>לתקן את מחבר אלקטרודה מוט של הכלי ההכנסה באמצעות דבק רגיל. שימו לב כי בהתאם ליצרן, חוטים הקרקע שאולי צריך להיות מולחמים את לוח מחבר אלקטרודה לפני ההשתלה. הסר את הבידוד של שני קטעים קצרים של חוטי נחושת בידודי לכה באמצעות פח-הלחמה להחיל עם מלחם (400 מעלות צלזיוס). הלחמה החוטים הקרקע כדי החריצים המתאימים בלוח מחבר אלקטרודה.</li>
	<li>הסר את הבידוד של שני חלקים נוספים של חוטי נחושת. לעטוף כל חוט נחושת חשוף שלוש פעמים סביב בורג פלדה אל חלד (בקוטר 1 מ"מ, 2 מ מ אורך). החל שטף מתאים הלחמה פלדה, הלחמה חוט הנחושת לחלק התחתון של הכיפה בורג. לוודא כי בתחתית חצי מהשרידים חריטה ללא פח-הלחמה.</li>
	<li>השתמש multimeter רגיל כדי לבדוק קשר חשמלי בין חוט בורג.</li>
	<li>לחטא את שאנקס של החללית סיליקון, את הברגים הקרקע על ידי טבילה 70% אתנול (10 s).</li>
	<li>להכין כיסוי מגן השתל בדיקה על ידי חיתוך ראש פלסטיק פסטר פיפטה לשניים.</li>
</ol>2. ניתוח ההשתלה
<ol><li>לחטא כלי כירורגי (מספריים, מלקחיים שקצהו פיין, מלחציים כירורגי) עם מעקר חרוז חם. למחוק את כל המשטחים עם 70% אתנול.</li>
	<li>לגרום הרדמה עם איזופלוריין 3% חמצן וכשאשר L ~ 1/min.<ol>
<li>לשימוש תחזוקה, 1-1.5% איזופלוריין. שימו לב כי ריכוז איזופלוריין הדרוש להשגת עמידות כירורגי יכול להשתנות חיה חיה.</li>
		<li>סובלנות כירורגי יציב מושגת כאשר החיה מצליח להגיב צובט את הבוהן. את קצב הנשימה של העכבר ולהתאים את ריכוז איזופלוריין במידת הצורך.</li>
		<li>להחיל משחה לעיניים של החיה כדי למנוע ייבוש.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לטעון את העכבר בתוך מסגרת stereotaxic בהוספת סורגים האוזן בעדינות לתוך תעלת האוזן. לאחר בראש של העכבר מתייצב בסורגים האוזן, הצב חתיכה הפה מעל החוטם למסירה איזופלוריין מתמשך. הצב את העכבר על מגבת או כרית מעל כרית החימום ולהזריק. הבופרנורפין subcutaneously (0.05 - 0.1 מ"ג/ק"ג משקל גוף) כדי להבטיח נגד כאבים לאחר הניתוח.</li>
	<li>לגלח את הראש מכונת הגילוח סטנדרטי, לחטא את העור עם 70% אתנול. באמצעות מספריים כירורגיים, בחתך לתוך העור לאורך הקו האמצעי של הגולגולת ופתח את העור בעזרת תופסנים כירורגי.</li>
	<li>יישור ראש החיה בעזרת כלי היישור stereotaxic כדי bregma ברמה של למדא. צריך להיות פחות מ- 50 מיקרומטר בהיסט גובה בין bregma למדא. יתר על כן, רמת הראש לאורך הציר mediolateral על ידי מדידת העומק של bregma-הגולגולת על פני השטח-מוגדרים מרחקים ימינה ושמאלה (למשל, 1 מ מ שמאל ואת הזכות של bregma). כיוון ההטיה של הראש במידת הצורך.</li>
	<li>לנקות את הראש עם 3% חמצן, לנגב היבש עם מגבונים סטריליים כותנה.</li>
	<li>לקבוע את המיקום של הניתוח ביחס bregma שימוש הולם אטלס stereotaxic12.</li>
	<li>באמצעות ראש המקדחה 0.9 מ מ, תרגיל שני חורי הברגים העצם על המוח הקטן למיקום הברגים הקרקע והפניה. בנוסף, 1-3 חורים עגינת הברגים הם רצוי לייצב את השתל. המיקום של ברגי עיגון יהיה תלוי המיקום של הניתוח. עבור ההשתלה בהיפוקמפוס אל הצב בורגי עיגון מעל קליפת חזיתית הקודקוד ואת חולשת contralateral. הכנס את הברגים העצם באמצעות מברג מתאים. הקפידו לא לחדור לתוך המוח.</li>
	<li>לבצע את הניתוח על ידי דילול לאט את הגולגולת עם התרגיל באזור מלבני מהצד השרשה. לעתים קרובות להרטיב את העצם עם מאגר פוספט סטיריליים (PB). הגולגולת ורקמת הנותרים יכולים להיות בעדינות פירסינג והוציאו בעזרת מחט ההזרקה (27 גרם) בסדר גמור וזוג פינצטה.</li>
	<li>בזהירות פירס קרום הדורה עם מחט דקה של הזרקה (27 גרם). טופס קרס קטנה על-ידי כיפוף קצה המחט עם זוג מספריים ומשוך את דורא להסרת. החל PB כדי למנוע את פני השטח של המוח ממנו להתייבש.</li>
	<li>הר הכלי ההכנסה אלקטרודה על בעל stereotaxic, אפס את המכשיר על bregma, וזוזי החללית לקואורדינטות stereotaxic הניתוח אט-אט לחדור את פני השטח של המוח. ודא שהמוטות בדיקה לא מתכופף. הימנע להשתיל דרך כלי הדם.</li>
	<li>הורידו לאט את המכשיר עד מיקרומטר ~ 200 מעל העומק הרצוי. מכסים את הגולגולת ואת שאנקס של המכשיר סיליקון עם וזלין סטיריליים להגנה. החל מלט שיניים כדי לתקן את הבסיס של המכשיר כדי הבורג עגינת בגולגולת.</li>
	<li>מיד לאחר יישום מלט, לאט הניעו את החללית אל העומק היעד. קידום של מיקרומטר אחרונה 200 ~ לאחר היישום של הצמנט מפחית לרוחב תנועת החללית ומבטיחה נזק מינימלי לרקמות באזור המטרה. שימו לב כי הזמן ריפוי של הבטון המשמש יכול להשפיע על שלב זה של הפרוטוקול. עם במהירות ריפוי מלט, להשמיט את שלב זה, ישירות שתל החללית לעומק היעד כדי למנוע נזק החללית סיליקון.</li>
	<li>לאחר ריפאה הבטון, שחרר את החללית של הכלי הכניסה על ידי המסת השעווה עם cauterizer.</li>
	<li>לשחרר את לוח מחבר מהמכשיר ההכנסה והצב אותו למקום מתאים על הגולגולת באמצעות מלחציים תנין מחוברת ידית ההכנסה. במקרה של בדיקה ההשתלה בהיפוקמפוס אל המקום את לוח מחבר על בדופן העצם contralateral. לתקן את לוח מחבר לגולגולת באמצעות מלט שיניים.</li>
	<li>הלחמה את החוטים הקרקע והפניה של הלוח מחבר לרדיו המצורפת את שני הברגים על המוח הקטן.</li>
	<li>לקצץ את מכסה מגן בגובה הנכון ומניחים אותו מעל החללית סיליקון. לתקן את מכסה לוח מחבר ואת הגולגולת באמצעות מלט שיניים, הימנעות העור סביב הגולגולת חשוף. תפירת העור סביב אתר ההשתלה בדרך כלל לא נדרש.</li>
</ol>3. ההחלמה לאחר הניתוח
<ol><li>החל הטיפול המתאים להרגעה לפחות 2 ימים (למשל זריקות תת עורית של הבופרנורפין כל 6 שעות במהלך היום, במי השתייה בן לילה בשילוב עם carprofen (4-5 מ"ג/ק"ג משקל גוף) subcutaneously כל 24 שעות). יחיד-דיור מומלץ כדי למנוע נזק השתל.</li>
	<li>אפשר לפחות שבוע להתאוששות. התייעץ עם הנחיות רווחת בעלי חיים מקומיים.</li>
</ol>4. קירור והקפאה
<ol><li>LFPs שיא לנוע בחופשיות עכברים באמצעות מערכת רכישת נתונים מתאימים מחוברים דרך קומוטטור. לרכוש LFPs, השתמש תדר דגימה של 1-5 קילו-הרץ. שיעור דגימה גבוה יותר (20-30 kHz) נדרשים אם יחידה אחת הפרשות שיירשמו יחד עם LFP.</li>
	<li>לאחסן קבצי raw הקלטה של והערוצים לניתוח במצב לא מקוון.</li>
</ol>5. היסטולוגיה
<ol><li>לאחר השלמת ההקלטה, עמוק עזים ומתנגד החיה (למשל 2 g/kg הגוף משקל urethane מוזרק intraperitoneally). לאשר המדינה הרדמה על ידי חוסר תגובה שאורך צובט.</li>
	<li>Perfuse transcardially את העכבר עם קרח באגירה פוספט תמיסת מלח (~ 1 דקות) ואחריו 4% paraformaldehyde (~ 10 דקות) באמצעות שיטות זלוף intracardial תקן13. לפני זלוף, lesioning electrolytic האתרים הקלטה אולי על ידי שבוצעה (למשל על-ידי החלת 10-20 V של מתח מתמיד עד 1 s). לחלופין, צבעי פלורסנט חלה על העצות shank לפני ההשתלה יכול לשמש כדי לעקוב אחר זיהוי. בדיקות בשיטות שונות לצורך זיהוי עמדות אלקטרודה כדי להשיג תוצאות אופטימליות עם סוגים שונים של סיליקון הגששים מומלץ.</li>
	<li>לחתוך חלקים במוח (~ 100 מיקרומטר) ו מכתים את הפרוסות עם 4'-6-diamidino-2-phenylindole (דאפי, µg 1/mL) ואחריו שלושה צעדים כביסה ב PB (כל 10 דקות בטמפרטורת החדר).</li>
	<li>במקום הסעיפים על שקופית מיקרוסקופ, להחיל טיפה של הטמעת בינונית ולכסות המקטע עם מכסה. תן את ההטבעה לילה יבש בינוני בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>באמצעות epifluorescence או מיקרוסקופ קונפוקלי סריקה בלייזר, לזהות את המיקום של האתרים הקלטה.</li>
	<li>ניסיון שחזור של המכשיר סיליקון להמשך השימוש, להחזיק את המכשיר עם מלחציים תנין ולשחרר את המכשיר מ לחתור בהתכה בקפידה את הבטון שיניים במלחם (400 מעלות צלזיוס). הקפידו לא נוגעים של שנקס בדיקה במהלך הליך זה!</li>
	<li>לשטוף את המכשיר במים מזוקקים חם (~ 80 מעלות, 15 דקות) ואחריו פתרון אנזימטי (1% Tergazyme במים מזוקקים, 30 דקות בטמפרטורת החדר) וצעד נוסף כביסה במים מזוקקים (15 דקות). שימו לב כי שיעור ההצלחה של בדיקה התאוששות נמוך.</li>
</ol>6. CSD ניתוח
<ol><li>באמצעות סביבת ניתוח מתאים (למשל פיתון), המרת הנתונים LFP של shank בודדים כדי CSD על ידי קירוב הנגזרת המרחבית השנייה לאורך הדוקרן כמו <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/57714/57714eq1.jpg"> איפה LFPn, t הוא האות LFP על האלקטרודהth nבזמן t וδz המרווח בין אלקטרודה. שים לב כי עקב n-1 פעולות n+1, CSD של האלקטרודות הראשון והאחרון של הדוקרן ניתן לאמוד, אשר צריכה להילקח תחת שיקול במהלך בדיקה השמה. ליישם את הנוסחה קירוב באמצעות קטע קצר של קוד מחשב את האות CSD עבור כל אלקטרודה תוך איטראציה לאורך זמן (ראה קובץ קוד משלים).</li>
	<li>השתמש את האות CSD שהושג עבור ניתוח נוסף (למשל, לומדת תדר מסוים להקות של תנודות המוח על-ידי החלת הלהקה לעבור מסננים).</li>
</ol>

<ol><li>Buzsáki, G., Draguhn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+oscillations+in+cortical+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neuronal oscillations in cortical networks.</a> Science. 304 (5679), 1926-1929 (2004).</li>
<li>Keefe, J., Recce, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+relationship+between+hippocampal+place+units+and+the+EEG+theta+rhythm%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Phase relationship between hippocampal place units and the EEG theta rhythm.</a> Hippocampus. 3 (3), 317-330 (1993).</li>
<li>Benchenane, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coherent+theta+oscillations+and+reorganization+of+spike+timing+in+the+hippocampal-prefrontal+network+upon+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Coherent theta oscillations and reorganization of spike timing in the hippocampal-prefrontal network upon learning.</a> Neuron. 66 (6), 921-936 (2010).</li>
<li>Jadhav, S. P., Kemere, C., German, P. W., Frank, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Awake+hippocampal+sharp-wave+ripples+support+spatial+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Awake hippocampal sharp-wave ripples support spatial memory.</a> Science. 336 (6087), 1454-1458 (2012).</li>
<li>Yamamoto, J., Suh, J., Takeuchi, D., Tonegawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+execution+of+working+memory+linked+to+synchronized+high-frequency+gamma+oscillations%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Successful execution of working memory linked to synchronized high-frequency gamma oscillations.</a> Cell. 157 (4), 845-857 (2014).</li>
<li>Karalis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4-Hz+oscillations+synchronize+prefrontal-amygdala+circuits+during+fear+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">4-Hz oscillations synchronize prefrontal-amygdala circuits during fear behavior.</a> Nature Neuroscience. 19 (4), 605-612 (2016).</li>
<li>Khodagholy, D., Gelinas, J. N., Buzsáki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning-enhanced+coupling+between+ripple+oscillations+in+association+cortices+and+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Learning-enhanced coupling between ripple oscillations in association cortices and hippocampus.</a> Science. 358 (6361), 369-372 (2017).</li>
<li>Buzsáki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+extracellular+fields+and+currents--EEG%2C+ECoG%2C+LFP+and+spikes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The origin of extracellular fields and currents--EEG, ECoG, LFP and spikes.</a> Nature Reviews Neuroscience. 13 (6), 407-420 (2012).</li>
<li>Mitzdorf, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+source-density+method+and+application+in+cat+cerebral+cortex%3A+investigation+of+evoked+potentials+and+EEG+phenomena%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Current source-density method and application in cat cerebral cortex: investigation of evoked potentials and EEG phenomena.</a> Physiological Reviews. 65 (1), 37-100 (1985).</li>
<li>Lasztóczi, B., Klausberger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Layer-specific+GABAergic+control+of+distinct+gamma+oscillations+in+the+CA1+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Layer-specific GABAergic control of distinct gamma oscillations in the CA1 hippocampus.</a> Neuron. 81 (5), 1126-1139 (2014).</li>
<li>Strüber, M., Sauer, J. -F., Jonas, P., Bartos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distance-dependent+inhibition+facilitates+focality+of+gamma+oscillations+in+the+dentate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Distance-dependent inhibition facilitates focality of gamma oscillations in the dentate gyrus.</a> Nature Communications. 8 (1), 758(2017).</li>
<li>Franklin, K. B. J., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFranklin%2C+KBJ+%22The+mouse+brain+in+stereotaxic+coordinates%22">The mouse brain in stereotaxic coordinates</a>. , Academic Press, Elsevier. (2007).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).</li>
<li>Kajikawa, Y., Schroeder, C. E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22153379">How local is the local field potential?</a> Neuron. 72 (5), 847-858 (2011).</li>
<li>Berens, P., Keliris, G. A., Ecker, A. S., Logothetis, N. K., Tolias, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feature+selectivity+of+the+gamma-band+of+the+local+field+potential+in+primate+primary+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Feature selectivity of the gamma-band of the local field potential in primate primary visual cortex.</a> Frontiers in Neuroscience. 2 (2), 199-207 (2008).</li>
<li>Lastóczi, B., Klausberger, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28391402">Distinct gamma oscillations in the distal dendritic field of the dentate gyrus and the CA1 area of mouse hippocampus.</a> Brain Structure and Function. 222 (7), 3355-3365 (2017).</li>
<li>Nguyen Chi, V., Müller, C., Wolfenstetter, T., Yanovsky, Y., Draguhn, A., Tort, A. B. L., Brankačk, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+respiration-driven+rhythm+distinct+from+theta+oscillations+in+awake+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Hippocampal respiration-driven rhythm distinct from theta oscillations in awake mice.</a> Journal of Neuroscience. 36 (1), 162-177 (2016).</li>
<li>Chung, J., Sharif, F., Jung, D., Kim, S., Royer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-drive+and+headgear+for+chronic+implant+and+recovery+of+optoelectronic+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Micro-drive and headgear for chronic implant and recovery of optoelectronic probes.</a> Scientific Reports. 7 (1), 2773(2017).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

הגדלת עדויות מציינים כי תנודות המוח במעגלים עצביים בהיפוקמפוס להתרחש דיסקרטית תחומים מרחבי10,11,16. CSD ניתוח מפחיתה באופן דרסטי את השפעת אמצעי הולכה, תנאי חיוני לצורך המחקר של אירועים מקומיים תנודה. עם וידאו זה, אנו מספקים מדריך כדי להשתיל סיליקון הגששים בהיפוקמפוס העכבר לניתוח של נתונים CSD. אנו מראים דוגמאות מייצגות של אותות CSD שארפ-גל האדוות CA1, התנודות גמא המותאמות לשפות אחרות של הכישור משוננת. עם זאת, פרוטוקול זה יכול לש...

תנודות ב- LFP מעורבים באופן ביקורתי מידע עיבוד על ידי מעגלים עצביים. הם מכסים מגוון רחב של תדרים, ועד גלים איטיים (~ 1 Hz) ריפל במהירות תנודות (~ 200 Hz)1. תדירות ברורים להקות הקשורים עם תפקודים קוגניטיביים, כולל זיכרון, עיבוד רגשי של ניווט2,3,4,5,6,7. הזרימה הנוכחית מעבר ממברנות עצביים מהווה את החלק הגדול ביותר של האות LFP8. קטיונים הזנת התא (למשל באמצעות הפעלה של הסינפסות סינאפסות glutamatergic) מייצגים כיור הנוכחי פעיל (כמו תשלום משאיר המדיום חוץ-תאית). לעומת זאת, זרימה נטו של מטען חיובי למדיום חוץ-תאית, למשל על-ידי הפעלה של GABAergic הסינפסות מעכבות, מתארת מקור הנוכחי פעיל במיקום זה. ב הדיפולים עצביים, כיורים הנוכחי ניתן לזווג עם מקורות סביל ולהפך עקב קיזוז הזרמים המשפיעים על קרום תשלום באתרים מרוחקים.
השדה החשמלי שנוצר על-ידי תהליכים עצביים מרחוק יכול גם לגרום מתח ניכר deflections על אלקטרודה הקלטה, עשויות ובכך באופן כוזב להיחשב כאירוע מקומי. הולכה נפח זה מהווה אתגר רציני הפרשנות של אותות LFP. ניתוח CSD מספק מידע אודות כיורים הנוכחי מקומיים ומקורות שבבסיס LFP אותות ולכן כוללת אמצעים כדי להפחית את ההשפעה של אמצעי האחסון הולכה8. במבנים למינציה כמו ההיפוקמפוס, ניתן לקבל אותות CSD חד-ממדי הנגזרת המרחבית השנייה של LFP להקליט מ קו מקביל אלקטרודות המסודרים בניצב מטוסים למינריות9. כניסתו של הגששים סיליקון ליניארי זמינים מסחרית אפשרה לחוקרים לנצל את השיטה CSD לצורך המחקר של תנודה המקומי פעילות ההיפוקמפוס. לדוגמה, זה הוכח כי תנודות גמא ברורים להגיח באופן ספציפי שכבה באזור CA110. יתר על כן, ניתוח CSD זיהה עצמאית נקודות חמות של פעילות גמא בשכבה התא העיקרי של הפיתול משוננת11. חשוב לציין, ממצאים אלה היו רק לכאורה CSD המקומי, אבל לא LFP אותות. ניתוח CSD ובכך מספק כלי רב עוצמה כדי לקבל תובנה בפעולות microcircuit של ההיפוקמפוס.
ב פרוטוקול זה, אנו מספקים מדריך מקיף כדי לקבל אותות CSD חד-ממדי עם סיליקון הגששים. שיטות אלה יאפשר למשתמשים לחקור אירועים תנודה מקומי בהיפוקמפוס של עכברים להתנהג.

<table><tbody><tr><td>מהדק תנין עם מעמד</td><td>Reichelt Elektronik</td><td>HALTER ZD-10D</td><td></td></tr><tr><td>בדיקת סיליקון</td><td>קיימברידג' נוירוטק</td><td>P-series 32</td><td></td></tr><tr><td>סטריאוסקופ</td><td>אולימפוס</td><td>SZ51</td><td></td></tr><tr><td>חוט נחושת מבודד</td><td>לכה B&uuml; rklin Elektronik</td><td>89 F 232</td><td></td></tr><tr><td>ברגי הארקה</td><td>ברגים & More GmbH (screwsandmore.de)</td><td>DIN 84 A2 M1x2</td><td></td></tr><tr><td>שטף</td><td>סטנול</td><td>114018</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים עם קצה קרמי</td><td>Fine Science Tools</td><td>11210-60</td><td></td></tr><tr><td>Paraffine Wax</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>327204</td><td></td></tr><tr><td>Cauterizer</td><td>Fine Science</td><td>Tools 18010-00</td><td></td></tr><tr><td>ברזל הלחמה</td><td>Kurtz Ersa</td><td>OIC1300</td><td></td></tr><tr><td>מולטימטר</td><td>Uni-T</td><td>UT61C</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>קארל רוט</td><td>9065.1</td><td></td></tr><tr><td>פיפטות פסטר</td><td>קארל רוט</td><td>EA65.1</td><td></td></tr><tr><td>מעקר חום</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-45</td><td></td></tr><tr><td>מסגרת סטריאוטקסית</td><td>דיוויד קופף</td><td>דגם 1900</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק אלקטרודות סטריאוטקסי</td><td>דיוויד קופף</td><td>דגם 1900</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Abbvie</td><td>B506</td><td></td></tr><tr><td>רכז חמצן</td><td>Respironix</td><td>1020007</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphine</td><td>Indivior UK Limited</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מכונת גילוח חשמלית</td><td>Tondeo</td><td>Eco-XS</td><td></td></tr><tr><td>כרית חימום</td><td>Thermolux</td><td>463265/-67</td><td></td></tr><tr><td>מהדקים כירורגיים</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>18050-28</td><td></td></tr><tr><td>מי חמצן</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009</td><td></td></tr><tr><td>מגבוני כותנה סטריליים</td><td>Carl Roth</td><td>EH12.1</td><td></td></tr><tr><td>Drill</td><td>Proxxon</td><td>Micromot 230/E</td><td></td></tr><tr><td>21G מחט הזרקה</td><td>B. Braun</td><td>4657527</td><td></td></tr><tr><td>מאגר פוספט/פוספט</td><td></td><td></td><td></td>חוצץ מלח</tr><tr><td>אטלס Elsevier</td><td></td><td>9.78012E+12</td><td></td></tr><tr><td>מספריים כירורגיים</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>14094-11</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים כירורגיים</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>11272-40</td><td></td></tr><tr><td>מחטי הזרקה 27G</td><td>B. Braun</td><td>4657705</td><td></td></tr><tr><td>וזלין</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מלט שיניים</td><td>Sun Medical</td><td>SuperBond T& M</td><td></td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>Zoetis</td><td>Rimadyl 50mg/ml</td><td></td></tr><tr><td>מגבר הקלטה</td><td>Intan Technologies</td><td>C3323</td><td></td></tr><tr><td>לוח רכישה USB</td><td>Intan Technologies</td><td>C3004</td><td></td></tr><tr><td>כבלי הקלטה</td><td>Intan Technologies</td><td>C3216</td><td></td></tr><tr><td>קומוטטור חשמלי</td><td>עדשות דוריות</td><td>HRJ-OE_FC_12_HARW</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת רכישה</td><td>OpenEphys (www.open-ephys.org)</td><td>GUI</td><td>מאפשרת רכישת נתונים בלתי תלויה בפלטפורמה</td></tr><tr><td>מחשב לרכישת</td><td></td><td></td><td></td>נתונים</tr><tr><td>סביבת ניתוח</td><td>Python (www.python.org)</td><td></td> <td>מאפשרת ניתוח נתונים בלתי תלוי בפלטפורמה</td></tr><tr><td>Urethane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1000</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ</td><td>Carl Roth</td><td>H868.1</td><td></td></tr><tr><td>תלושי כיסוי</td><td>Carl Roth</td><td>H878.2</td><td></td></tr><tr><td>הטמעת בינוני</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81381-50G</td><td></td></tr><tr><td>מים מזוקקים</td><td>Millipore</td><td>Milli Q</td><td>מכונה שולחנית לייצור מים מזוקקים</td></tr><tr><td>Tergazyme</td><td>Alconox</td><td>Tergazyme</td><td></td></tr></tbody></table>

הקלטה במרחב מוגבל תנודות בהיפוקמפוס מתנהגים באופן עכברים

Recording Spatially Restricted Oscillations in the Hippocampus of Behaving Mice

הפוטנציאל שדה מקומי (LFP) מתגלה מתנועות יון מעבר ממברנות עצביות. מאז המתח שהוקלט על ידי אלקטרודות LFP משקף את השדה החשמלי מסוכם של כמויות גדולות של רקמת המוח, חילוץ מידע אודות פעילות מקומית הוא מאתגר. עם זאת, למדתי מתוכנת עצביים, דורש הבחנה אמין בין אירועים מקומיים באמת כמנצח נפח אותות שמקורם באזורים מרוחקים המוח. הניתוח הנוכחי של צפיפות (CSD) מקור מציע פתרון בעיה זו על-ידי מתן מידע על כיורים הנוכחי ועל מקורות באזור האלקטרודות. באזורים במוח עם למינריות cytoarchitecture כגון ההיפוקמפוס, CSD חד-ממדי ניתן להשיג על ידי הערכת המרחבי הנגזרת השנייה של LFP. כאן, אנו מתארים שיטה LFPs multilaminar הרשומה באמצעות סיליקון ליניארי הגששים מושתל לתוך ההיפוקמפוס הגבי. עקבות CSD מחושבים לאורך שאנקס בודדים של המכשיר. פרוטוקול זה ובכך מתאר הליך כדי לפתור תנודות מוגבל ברשת עצביים בהיפוקמפוס לנוע בחופשיות עכברים.

איור 1 מדגימה את הכלי ההכנסה שימוש עבור ההשתלה של הגששים סיליקון. הקלטות סיליקון כרוני מושתל רגשים פילוח האזור CA1, השכבה תא גרגר של הכישור משוננת מוצגים באיור2. הקלטנו LFPs מ שאנקס בדיקה במהלך תנועה חופשית ב homecage. כדי למזער את ההשפעה של אמצעי האחסון הולכה, האותות שהושג היו המרה CSD לאורך כל shank של המכשיר (איור 2Bיח). בדוגמה הראשונה המוצגת באיור 2B...

פרוטוקול זה מתאר את ההקלטה של פוטנציאל שדה מקומי עם רב shank סיליקון ליניארי רגשים. המרה של האותות באמצעות ניתוח צפיפות המקור הנוכחי מאפשר השחזור של הפעילות החשמלית המקומית בהיפוקמפוס העכבר. בטכניקה זו, תנודות המוח מוגבל יכול להילמד במעבר בחופשיות עכברים.

The local field potential (LFP) emerges from ion movements across neural membranes. Since the voltage recorded by LFP electrodes reflects the summed ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום מדעי המוח כגון כיצד פעילויות רשת עצבית מאורגנות בקנה מידה זמני ומרחבי עדין. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא ששימוש בבדיקות סיליקון ליניאריות ניתוח נתוני זרם מאפשר שחזור של תנודות מקומיות שלא ניתן לזהות בקלות בהקלטות פוטנציאליות שדה קונבנציונליות. כדי להתחיל בהליך זה, יש לעקר את מכשירי הניתוח בעזרת מעקר חרוזים חם, ולאחר מכן לנגב את כל משטחי העבודה באתנול של 70%.לאחר מכן, הרכיבו את החיה המורדמת במסגרת סטריאוטקסית על ידי החדרת מוטות אוזניים בעדינות לתעלת האוזן. לאחר שראש העכבר מיוצב על ידי מוטות האוזניים, הניחו פיה מעל החוטם לאספקה רציפה של איזופלורן, ולאחר מכן מרחו משחה על העיניים כדי למנוע התייבשות. לאחר מכן, הניחו כרית חימום מתחת לעכבר והזריקו בופרנורפין תת עורי כדי להבטיח שיכוך כאבים לאחר הניתוח.לאחר מכן, יש לגלח את ראשו ולחטא את העור באתנול 70%. בעזרת מספריים כירורגיים, בצע חתך בעור לאורך קו האמצע של הגולגולת ופתח את העור באמצעות מלחציים כירורגיים. יישר את ראש החיה בעזרת כלי יישור סטריאוטקסי כדי ליישר ברגמה ולמבדה.צריך להיות פחות מ-50 מיקרומטר של קיזוז גובה בין ברגמה ללמבדה. יתר על כן, יישר את הראש לאורך הציר המדיאלי-צדדי על ידי מדידת העומק במרחק מוגדר מברגמה בצד שמאל וימין כאחד. כוונן את הראש אם הוא מוטה.נקו את הראש עם מי חמצן 3% וייבשו אותו עם מגבוני כותנה סטריליים. קבע את מיקום הגולגולת ביחס לברגמה באמצעות אטלס סטריאוטקסי מתאים. בעזרת ראש מקדחה של 0.9 מילימטר, קדחו שני חורי ברגים בעצם מעל המוח הקטן כדי למקם את הקרקע וברגי הייחוס.בנוסף, קדחו חור אחד עד שלושה חורים לעיגון ברגים לייצוב השתל. מיקום ברגי העיגון יהיה תלוי במיקום הגולגולת. הכנס את הברגים לעצם באמצעות מברג מתאים.היזהר לא לחדור למוח. כעת, בצע את הגולגולת על ידי דילול איטי של הגולגולת עם המקדחה באזור מלבני סביב צד ההשתלה. הרטיבו את העצם לעתים קרובות עם מאגר פוספט מעוקר.חודרים בעדינות את הגולגולת הדקה שנותרה בעזרת מחט הזרקה בגודל 27 ומסירים אותה בעזרת פינצטה. לאחר מכן, חודרים בזהירות את הדורה מאטר בעזרת מחט הזרקה בגודל 27. בעזרת זוג פינצטה, צרו וו קטן על ידי כיפוף קצה המחט והשתמשו בוו זה כדי להסיר את הדורה.לאחר מכן, מרחו מאגר פוספט כדי למנוע ממשטח המוח להתייבש. לאחר מכן, התקן את כלי החדרת האלקטרודה על מחזיק סטריאוטקסי ואפס את הגשושית על ברגמה. העבר את הגשושית לקואורדינטות הסטריאוטקסיות מעל הגולגולת ולחדור לאט לאט לפני השטח של המוח.ודא שפירי הבדיקה אינם מתכופפים והימנע מהשתלה דרך כלי הדם. לאחר מכן, הורד לאט את הגשושית עד כ-200 מיקרומטר מעל העומק הרצוי. לאחר מכן, כסו את הגולגולת והשוקיים של בדיקת הסיליקון בווזלין מעוקר להגנה.לאחר מכן, יש למרוח מלט דנטלי כדי לקבע את בסיס הגשושית לבורג העיגון בגולגולת. מיד לאחר מריחת המלט, העבר לאט את הגשושית לעומק היעד. קדם את 200 המיקרומטרים האחרונים לאחר מריחת המלט כדי להפחית את התנועה הרוחבית של הגשושית ולהבטיח נזק מינימלי לרקמות באזור המטרה.לאחר שהמלט נרפא, שחרר את הגשושית מכלי ההחדרה על ידי המסת השעווה בעזרת צריבה לאחר מכן, שחררו את לוח המחברים מהתקן ההחדרה ומקמו אותו במקום מתאים על הגולגולת באמצעות מהדק תנין. קבע את לוח המחבר לגולגולת באמצעות מלט דנטלי.במקרה של השתלת בדיקה בהיפוקמפוס, הנח את לוח המחבר על העצם הקודקודית הנגדית. לאחר מכן, הלחמו את חוטי ההארקה והייחוס של לוח המחברים לחוטים המחוברים לשני הברגים מעל המוח הקטן. חתוך את כיסוי המגן לגובה הנכון והנח אותו מעל בדיקת הסיליקון.לאחר מכן, תקן את המכסה של לוח המחבר והגולגולת באמצעות מלט דנטלי, תוך הימנעות מהעור סביב הגולגולת החשופה. לאחר הניתוח, יש למרוח טיפול משכך כאבים מתאים על העכבר למשך יומיים לפחות. בית יחיד לעכבר כדי למנוע נזק לשתל.הקלטות מבדיקות סיליקון מושתלות כרוניות המכוונות לאזור CA1 מוצגות כאן. ניתוח צפיפות המקור הנוכחי מיושם לאורך השוקיים הבודדות של הגשושית. בדוגמה זו, אירוע אדוות גל חד יחיד מוביל לשקיעת זרם בולטת בשכבה רדיאטום של CA1 ובדוגמה השנייה, נרשמו שני אתרים נפרדים בשכבת תאי הגרגיר של הבליטה המשוננת.פס הגמא הגבוה בודד על ידי הפעלת מסנן מעבר פס של 60 עד 80 הרץ, וחשף התפרצויות גמא מקומיות באחד משני אתרי ההקלטה הממוקמים בשכבת תאי הגרגיר. שים לב שניתן לזהות את פעילות תנודת הגמא המקומית רק לאחר המרה של האותות המוקלטים ל-CSD. CSD, אך לא אותות LFP, מזהים את תקופות האסינכרוניות של הפאזה והמשרעת בין שני אתרי ההקלטה.קטע זה מציג תקופה קצרה של פעילות גמא מסונכרנת. העקבות כאן ממחישות את הפרש הפאזה ואת מדד הפרש המשרעת עבור עקבות LFP ו-CSD. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתיל בדיקות סיליקון בהיפוקמפוס.

recording-spatially-restricted-oscillations-hippocampus-behaving

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

סרטון זה מתאר פרוטוקול להשתלת גשושית סיליקון ליניארית מרובת שוקיים במוח העכבר כדי למדוד פוטנציאלי שדה מקומיים. ההליך כולל אבטחת הגשושית ליחידה סטריאוטקסית, מיקומה המדויק מעל אזור המטרה במוח, החדרתה למוח ואבטחתה באמצעות מלט דנטלי. לאחר ההשתלה, הרכבה מוגנת עם מעטפת. לאחר ההתאוששות, המערך מאפשר רישום פוטנציאלי שדה מקומיים, ומספק תובנות לגבי הפעילות העצבית.

רישום פעילות חשמלית מוחית בעכברים מתנהגים באמצעות גשושיות סיליקון ליניאריות מרובות שוקיים

הסרטון מדגים הליך לרישום פוטנציאל השדה המקומי (LFP) בפרוסות קליפת המוח של ההיפוקמפוס-אנטורינלי של עכבר. גירוי חשמלי מסופק ברדיאטום שכבה CA3 של ההיפוקמפוס, אשר גורם לשינויים בפוטנציאל הפוסט-סינפטי בפירמידלה של שכבת CA1. השינוי המשולב בפוטנציאל הממברנה של נוירוני CA1, המכונה פוטנציאל השדה המקומי, נרשם.

רישום פוטנציאל שדה מקומי בפרוסות קליפת המוח של ההיפוקמפוס-אנטורינלי של עכבר

סרטון זה מדגים פרוטוקול לוויסות תנודות תטא במודל עכבר מהונדס גנטית עם תעלות יונים רגישות לאור בנוירוני המחיצה המדיאלית GABAergic שלו. על ידי העברת פולסי אור להיפוקמפוס, הפרוטוקול נועד לסנכרן את הפעילות העצבית וליצור תנודות תטא, אשר נרשמות כפוטנציאלי שדה מקומיים.

מניפולציה סלקטיבית של תנודות תטא במודל עכבר

סרטון זה מדגים את ההשתלה הסטריאוטקטית של מערך אלקטרודות תיל וסיב אופטי בהיפוקמפוס של מודל עכבר.

השתלת מערך אלקטרודות וסיבים אופטיים בהיפוקמפוס של העכבר

סרטון זה מדגים הקלטה של פעילות רשת עצבית קצבית, הידועה גם בשם תנודות תטא, בהיפוקמפוס מבודד. אלקטרודות מוכנסות לשכבות שונות ולמיקומים מרחביים שונים כדי לזהות ולנתח תנודות תטא. זה מראה את ההרכבים העצביים הייחודיים ואת הקישוריות של הרשת העצבית על פני שכבות שונות של ההיפוקמפוס.

הקלטה חוץ גופית של תנודות תטא בהיפוקמפוס העכבר

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להקלטת קצבית רשת עצבית theta ו תנודות גמא מ הכנה בהיפוקמפוס שלם מבודד. אנו מתארים את השלבים ניסיוני מן החילוץ של ההיפוקמפוס לפרטים של שדה, יחידית תא שלם קליפת הקלטות מהדק, כמו גם צעדה optogenetic של קצב theta.

כוונון להקת הטטה בהיפוקמפוס<em&gt; במבחנה</em&gt; מתודולוגיות להקלטת מכרסמת מבודדת מעגל ספוטוהיפוקמפוס

אנו מתארים את השימוש optogenetics והקלטות אלקטרופיזיולוגיות עבור מניפולציות סלקטיבי התנודות תטא בהיפוקמפוס (5-10 Hz) בעכברים להתנהג. היעילות של entrainment הקצב נעשה באמצעות שדה מקומי פוטנציאל. שילוב של באופטו - וניגוד pharmacogenetic מטפל מדידה efferent הסינכרון בהיפוקמפוס.

Optogenetic Entrainment התנודות תטא בהיפוקמפוס ב מתנהג עכברים

פרוטוקול זה מתאר את הכנת פרוסות קליפת המוח ההיפוקמפוס-סנטורינאלית האופקית (HEC) מעכברים המציגים פעילות אדווה ספונטנית של גל חד. פרוסות מודגרות בתא החזקת ממשק פשוט והקלטות מבוצעות בתנאים שקועים עם נוזל שדרתי מלאכותי זורם במהירות כדי לקדם חמצון רקמות ואת הופעתה הספונטנית של פעילות ברמת הרשת.

חריף המוח עכבר חותכת לחקור פעילות רשת היפוקמפוס ספונטנית

מאמר זה מדגים את הכנת חלון הדמיה בהתאמה אישית בתוספת קנולה עירוי והשתלתו על אזור CA1 של ההיפוקמפוס בעכברים.

הליך גולגולתי להדמיית פעילויות עצביות בהיפוקמפוס של עכברים מתנהגים

פרוטוקול זה מתאר את השימוש במכשיר הקלטה מותאם אישית ובאלקטרודות כדי להקליט פוטנציאלים של שדות מקומיים ולחקור את זרימת המידע בהיפוקמפוס העכבר ובקליפת המוח הקדם-מצחית.

הקלטות חוץ-תאיות כפולות בהיפוקמפוס העכבר ובקליפת המוח הקדם-מצחית

פרוטוקול זה חוקר את הקשר בין המוח להתנהגות בהיפוקמפוס CA1 בעכברים המנווטים בפלומת ריח. אנו מספקים פרוטוקול שלב אחר שלב, כולל ניתוח לגישה להדמיה של ההיפוקמפוס, אימון התנהגותי, הקלטה ועיבוד של המוח במיניסקופ GCaMP6f, ונתונים התנהגותיים לפענוח מיקום העכבר מפעילות עצבית ROI.

מיניסקופ מקליט אותות סידן בהיפוקמפוס של עכברים המנווטים בפלומת ריח

למדו הקלטת פוטנציאלי שדה מקומיים בהיפוקמפוס של עכברים תוך שימוש במשטחי סיליקון רב-להביים. ניתוח צפיפות מקור הזרם מאפשר זיהוי תנודות מקומיות שאינן ניתנות לגילוי בשיטות רגילות.

הקלטה במרחב מוגבל תנודות בהיפוקמפוס מתנהגים באופן עכברים

גלה סרטונים נוספים