2 ב 1: בשלב אחד טיהור זיקה לניתוח מקבילים של חלבון, מתחמי חלבון-מטבוליט

ניתן להשתמש בשיטה זו לא רק כדי לענות על שאלות מפתח במחקר בסיסי, אלא גם לתרום לתחומי הרפואה, התרופות והביוטכנולוגיה, על ידי תיחום ליגנדים מולקולריים קטנים חדשים של חלבונים חיוניים. היתרון העיקרי של טכניקה זו, הוא שהיא מאפשרת ניתוח מקביל של חלבון ושותפים מטבוליים של החלבון הנבחר בתנאים קרובים לגוף. שיטה זו עוזרת לדוג מולקולות אינטראקטיביות מבלי להיות מוגבלת לליגנדים שנבחרו מראש.

למרות ששיטה זו פותחה עבור צמחים, ניתן ליישם אותה גם עבור מערכות אחרות, כגון תאי HeLa, E.coli ו-S.Cerevisiae. כדי להתחיל, הכינו מדיום MSMO והתאימו את ה-pH ל-5.7 עם אשלגן הידרוקסיד מולארי אחד. לאחר מכן, חיטוי התמיסה למשך 15 דקות בחום של 121 מעלות צלזיוס.

הוסף את התוספים למדיום ממש לפני תחילת הניסוי. כעת, גדל תרבית תאים טרנסגנית PSBL Arabidopsis thaliana ב-50 מיליליטר של מדיום MSMO בבקבוק של 100 מיליליטר. לאחר מכן, הנח את הבקבוק על שייקר פלטפורמה מסלולית וערבב בעדינות את התאים ב-130 סל"ד ב-20 מעלות צלזיוס באור.

כל שבעה ימים, תת-תרבית את התאים במדיום טרי בתמיסה של 1 עד 10. לאחר מכן, השתמש במשפך זכוכית עם רשת ניילון המותקנת על בקבוק חרוטי, המחובר למשאבת ואקום כדי לקצור את התאים בשלב הגידול הלוגריתמי. לאחר מכן, עטפו את התאים המיובשים בנייר אלומיניום, והקפיאו בחנקן נוזלי.

בעזרת טחנת מיקסר מקוררת מראש, מכוונת לתדר רטט של 20 הרץ. הומוגניזציה של חומר תאי הצמח שנקטף והקפוא לאבקה דקה למשך שתי דקות. לאחר מכן, יש להקצות שלושה גרם של אבקת הקרקע לדגימה באמצעות חנקן נוזלי, ציוד מקורר מראש כדי למנוע את הפשרתו.

לאחר מכן, בעזרת טיט מקורר מראש של חנקן נוזלי, יש לשלש את האבקה הטחונה בשלושה מיליליטר של מאגר ליזיס קר כקרח עד שהיא מפשירה. חלקו את הדגימה המופשרת מיד לשני צינורות מיקרו-צנטריפוגה של מיליליטר. צנטריפוגה של הדגימות ב-20,817 גרם למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי להסיר את הפסולת התאית.

בזמן שהדגימה עוברת צנטריפוגה, יש לצרוך 100 מיקרוליטר של חרוזי ספרוז IgG לכל דגימה. הוסף מיליליטר אחד של מאגר ליזה, והשהה מחדש את החרוזים על ידי מערבולת. סיבוב הבזק למשך שלוש שניות ב-2,000 גרם, והשליך את מאגר הליזה.

לבסוף, השעו מחדש את החרוזים ב-400 מיקרוליטר של מאגר ליזה. לאחר הצנטריפוגה, העבירו שלושה מיליליטר של ליזאט הצמח השקוף לצינור צנטריפוגה חרוטי של 15 מיליליטר. מוסיפים את החרוזים המאוזנים מראש לליזט הצמח, ודוגרים את התערובת על גלגל מסתובב למשך שעה בארבע מעלות צלזיוס.

העבירו את התערובת למזרק המחובר למכסה נעול פיתוי על עמוד סיבוב עם פילטר בגודל נקבוביות של 35 מיקרומטר הממוקם על גבי סעפת הוואקום. העבירו את הליזאט דרך היחידה על ידי הפעלת משאבת הוואקום בלחץ עדין כדי למנוע פגיעה בחרוזים. הליזט הלא קשור מתנקז לתחנת הפסולת הממוקמת בבסיס בסעפת ומתחמי החלבון, הקשורים לחרוזים, נשארים על המסנן.

לאחר שהמזרק מתרוקן מליזאט התא, הוסף 10 מיליליטר של מאגר כביסה כדי לשטוף את החרוזים. לאחר מכן, הוסף מיליליטר של מאגר פליטה כדי לבצע את שלב הכביסה השני. כעת, הסר את המזרק ואת מכסה נעילת הפיתוי.

סגור את המכסה התחתון בעמודה, והוסף לחרוזים 400 מיקרוליטר של מאגר הפליטה המכיל 50 יחידות של הצורה המשופרת של וירוס תחריט הטבק, פרוטאז. הניחו את העמוד על שייקר שולחן, מכוון ל -1, 000 סל"ד למשך 30 דקות בחום של 16 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הוסיפו לעמודה 50 יחידות נוספות של הפרוטאז, ודגרו את התערובת על השייקר כמו בשלב הקודם.

לאחר מכן, הסר את המכסה התחתון והחלף את העמודה בצינור מיקרו-צנטריפוגה של שני מיליליטר. צנטריפוגה ב-20, 817 גרם למשך דקה אחת כדי לאסוף את הפליטה ולהמשיך במיצוי חלבון ומטבוליטים. כדי להתחיל במיצוי, הוסף מיליליטר אחד של שלושה לאחד לאחד ממיס מי מתנול MTBE לאלואט.

הפוך את הצינור כדי לערבב לדגימה. לאחר מכן, הוסף לתערובת 0.4 מיליליטר של תמיסת מי מתנול אחת עד שלוש, והפוך את הצינור כדי לערבב את הדגימה. לאחר מכן, צנטריפוגה את הדגימה ב-20, 817 גרם למשך שתי דקות בטמפרטורת החדר כדי לאפשר הפרדת פאזה.

בעזרת פיפטה ידנית לטיפול בנוזלים של מיליליטר, הסר את השלב העליון המכיל שומנים. לאחר מכן, הוסף 0.2 מיליליטר מתנול, והפוך את הצינור כדי לערבב את הדגימה. צנטריפוגה ב-20, 817 גרם למשך שתי דקות בטמפרטורת החדר, ולאסוף את השלב הקוטבי בצינור חדש למדידות מטבוליטים.

השאירו כ-50 מיקרוליטר מהפאזה הקוטבית בתחתית הצינור כדי למנוע עקירת כדור החלבון. לאחר מכן, יבש את הצינור המכיל את השלב הקוטבי במאייד צנטריפוגלי במהלך הלילה. יבש את צינורות גלולת החלבון למשך 30 עד 60 דקות כדי למנוע ייבוש יתר.

באמצעות טיהור זיקה חד-שלבי, יחד עם אינטראקציות חלבון-חלבון וחלבון-מטבוליט בספקטרומטריית מסה בתרביות תאי ארבידופסיס תליאנה טרנסגניות. תרביות תאים המבטאות NDPK1, מראות העשרה משמעותית בדגימות ואלין-לאוצין, איזולאוצין גלוטמט, לאוצין איזולאוצין ואיזולאוצין פנילאלנין בהשוואה לדגימות וקטור ריק, NDPK2 ו-NDPK3. כדי לחפש אינטראקציות ידועות של חלבון-חלבון וחלבון-מטבוליט, 13 חלבונים וארבעה דיפפטידים המשתלבים עם NDPK1, מורכבים כנגד מסד הנתונים של התפרים.

הקשרים העיקריים נראים בין אורתולוג APX1 למשפחת אלדהיד דהידרוגנאז, וגורם התחלת התרגום, FBR12, עם גורם התחלת תרגום שתי תת-יחידה אלפא הומולוג. הדיפפטידים שזוהו לא מראים שותפים חלבונים מדווחים. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך ארבע שעות, אם היא מבוצעת כראוי.

בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לשמור על דגימות, ציוד וריאגנטים קרים לאורך כל הניסוי. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כמו תרמופורזיס מיקרוסקופ או בדיקת פעילות על מנת לקבוע אינטראקציה ישירה בין מולקולות או הסקת הליגנד שלהן על פעילות החלבון. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לטפל בדגימה במהלך כל ההליך כדי להשיג תוצאות אמינות ולזהות ליגנדים של החלבון שבחרת.

אל תשכח שעבודה עם מתנול ותמיסת MTBE יכולה להיות מסוכנת ביותר. יש ללבוש ציוד מגן אישי מתאים, ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות, כגון עבודה מתחת למכסה האדים, בעת ביצוע הליך זה.