Name: השתלת Homochronic של סימנים מקדימים Interneuron לתוך מוח העכבר כמחנכת מוקדם (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-08T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: למדו שיטת השתלה הומוכרונית של קדמי תאי עצב ביניים ממוח עכברים נאונטליים לנבדקים בני גילם. טכניקה זו מאפשרת לחקור כיצד שינויים סביבתיים משפיעים על גורל התאים והבשלתם במוח.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי מכוני הבריאות הלאומיים (K99MH104595), את תוכנית המחקר מגזר NICHD כדי T.J.P. אנו מודים Fishell גורד, במעבדה של מי גישה זו הוקמה במקור.

<ol><li>Bozzi, Y., Casarosa, S., Caleo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epilepsy+as+a+neurodevelopmental+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Epilepsy as a neurodevelopmental disorder.</a> Front Psychiatry. 3 (19), (2012).</li>
<li>Takano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interneuron+Dysfunction+in+Syndromic+Autism%3A+Recent+Advances%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Interneuron Dysfunction in Syndromic Autism: Recent Advances.</a> Dev Neurosci. , (2015).</li>
<li>Inan, M., Petros, T. J., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Losing+your+inhibition%3A+linking+cortical+GABAergic+interneurons+to+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Losing your inhibition: linking cortical GABAergic interneurons to schizophrenia.</a> Neurobiol Dis. 53, 36-48 (2013).</li>
<li>Batista-Brito, R., Machold, R., Klein, C., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+in+cortical+interneuron+precursors+is+prescient+of+their+mature+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">Gene expression in cortical interneuron precursors is prescient of their mature function.</a> Cereb Cortex. 18 (10), 2306-2317 (2008).</li>
<li>Flames, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delineation+of+multiple+subpallial+progenitor+domains+by+the+combinatorial+expression+of+transcriptional+codes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Delineation of multiple subpallial progenitor domains by the combinatorial expression of transcriptional codes.</a> J Neurosci. 27 (36), 9682-9695 (2007).</li>
<li>Wonders, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+spatial+bias+for+the+origins+of+interneuron+subgroups+within+the+medial+ganglionic+eminence%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">A spatial bias for the origins of interneuron subgroups within the medial ganglionic eminence.</a> Dev Biol. 314 (1), 127-136 (2008).</li>
<li>Inan, M., Welagen, J., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+bias+in+the+mitotic+origins+of+somatostatin-+and+parvalbumin-expressing+interneuron+subgroups+and+the+chandelier+subtype+in+the+medial+ganglionic+eminence%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal bias in the mitotic origins of somatostatin- and parvalbumin-expressing interneuron subgroups and the chandelier subtype in the medial ganglionic eminence.</a> Cereb Cortex. 22 (4), 820-827 (2012).</li>
<li>Petros, T. J., Bultje, R. S., Ross, M. E., Fishell, G., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apical+versus+Basal+Neurogenesis+Directs+Cortical+Interneuron+Subclass+Fate%5BTitle%5D)+AND+%22+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Apical versus Basal Neurogenesis Directs Cortical Interneuron Subclass Fate.</a> Cell Rep. 13 (6), 1090-1095 (2015).</li>
<li>Taniguchi, H., Lu, J., Huang, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spatial+and+temporal+origin+of+chandelier+cells+in+mouse+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The spatial and temporal origin of chandelier cells in mouse neocortex.</a> Science. 339 (6115), 70-74 (2013).</li>
<li>Bandler, R. C., Mayer, C., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+interneuron+specification%3A+the+juncture+of+genes%2C+time+and+geometry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Cortical interneuron specification: the juncture of genes, time and geometry.</a> Curr Opin Neurobiol. 42, 17-24 (2017).</li>
<li>Kepecs, A., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interneuron+cell+types+are+fit+to+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interneuron cell types are fit to function.</a> Nature. 505 (7483), 318-326 (2014).</li>
<li>Mayer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+diversification+of+cortical+inhibitory+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Developmental diversification of cortical inhibitory interneurons.</a> Nature. 555 (7697), 457-462 (2018).</li>
<li>Mi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+emergence+of+cortical+interneuron+diversity+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Early emergence of cortical interneuron diversity in the mouse embryo.</a> Science. 360 (6384), 81-85 (2018).</li>
<li>Alvarez-Dolado, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+inhibition+modified+by+embryonic+neural+precursors+grafted+into+the+postnatal+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cortical inhibition modified by embryonic neural precursors grafted into the postnatal brain.</a> J Neurosci. 26 (28), 7380-7389 (2006).</li>
<li>Baraban, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+seizures+by+transplantation+of+cortical+GABAergic+interneuron+precursors+into+Kv1.1+mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Reduction of seizures by transplantation of cortical GABAergic interneuron precursors into Kv1.1 mutant mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (36), 15472-15477 (2009).</li>
<li>De la Cruz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interneuron+progenitors+attenuate+the+power+of+acute+focal+ictal+discharges%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Interneuron progenitors attenuate the power of acute focal ictal discharges.</a> Neurotherapeutics. 8 (4), 763-773 (2011).</li>
<li>Gilani, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interneuron+precursor+transplants+in+adult+hippocampus+reverse+psychosis-relevant+features+in+a+mouse+model+of+hippocampal+disinhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Interneuron precursor transplants in adult hippocampus reverse psychosis-relevant features in a mouse model of hippocampal disinhibition.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (20), 7450-7455 (2014).</li>
<li>Larimer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caudal+Ganglionic+Eminence+Precursor+Transplants+Disperse+and+Integrate+as+Lineage-Specific+Interneurons+but+Do+Not+Induce+Cortical+Plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Caudal Ganglionic Eminence Precursor Transplants Disperse and Integrate as Lineage-Specific Interneurons but Do Not Induce Cortical Plasticity.</a> Cell Rep. 16 (5), 1391-1404 (2016).</li>
<li>Martinez-Cerdeno, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+MGE+precursor+cells+grafted+into+adult+rat+striatum+integrate+and+ameliorate+motor+symptoms+in+6-OHDA-lesioned+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Embryonic MGE precursor cells grafted into adult rat striatum integrate and ameliorate motor symptoms in 6-OHDA-lesioned rats.</a> Cell Stem Cell. 6 (3), 238-250 (2010).</li>
<li>Quattrocolo, G., Fishell, G., Petros, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterotopic+Transplantations+Reveal+Environmental+Influences+on+Interneuron+Diversity+and+Maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Heterotopic Transplantations Reveal Environmental Influences on Interneuron Diversity and Maturation.</a> Cell Rep. 21 (3), 721-731 (2017).</li>
<li>Xu, Q., Tam, M., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+mapping+Nkx2.1-lineage+cells+in+the+mouse+telencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Fate mapping Nkx2.1-lineage cells in the mouse telencephalon.</a> J Comp Neurol. 506 (1), 16-29 (2008).</li>
<li>Thompson, L., Bjorklund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival%2C+differentiation%2C+and+connectivity+of+ventral+mesencephalic+dopamine+neurons+following+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Survival, differentiation, and connectivity of ventral mesencephalic dopamine neurons following transplantation.</a> Prog Brain Res. 200, 61-95 (2012).</li>
<li>Liang, Y., Agren, L., Lyczek, A., Walczak, P., Bulte, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+progenitor+cell+survival+in+mouse+brain+can+be+improved+by+co-transplantation+of+helper+cells+expressing+bFGF+under+doxycycline+control%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neural progenitor cell survival in mouse brain can be improved by co-transplantation of helper cells expressing bFGF under doxycycline control.</a> Exp Neurol. 247, 73-79 (2013).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

היבט קריטי אחד של פרוטוקול זה הוא למקסם את השרידות של התאים. להבטיח כי רקמות ותאים נמצאים תמיד קר כקרח carboxygenated sACSF יש צורך לקדם את הישרדות cell. זה דורש ניתוח יעיל ואסטרטגיה דיסוציאציה כדי לצמצם את משך הזמן התאים מבלים פתרון שונים והן מחוצה הסביבה המוח. תלוי במספר אזורים במוח להיות גזור, מושתלים, זה יכול להיות מועיל שיש לו שותף סיוע בשלבי ניתוח ו/או השתלת כדי להקטין את משך הניסוי. כדי להבטיח את בריאות והישרדות של הכלבלב, חשוב גם כדי למזער את הזמן הרדמה קרח (< 4 דקות) ולשמור הכלבלב מחוממת עם אור במהלך ההליך השתלת...

בקליפת המוח לתפקוד תקין דורש איזון בין הנוירונים הקרנה סינאפסות מעכבות GABAergic interneurons, אוכלוסיה הטרוגנית מאוד ברורים מורפולוגיות, מאפייני אלקטרופיזיולוגיות, קישוריות, עצבית סמנים. התפתחות לא תקינה ותפקוד של interneurons (וגם interneuron ספציפיים תת-קבוצות) נקשר את pathobiology של הפרעות פסיכיאטריות כגון סכיזופרניה, אוטיזם, אפילפסיה1,2,3. יתר על כן, גנים רבים מעורבים אלה הפרעות מוח חזק מועשר interneurons צעירים4. לפיכך, הבנה טובה יותר של המנגנונים המווסתים interneuron הגורל נחישות ועם בגרות יש צורך להבין להתפתחות התקינה של פוטנציאל אטיולוגיה של מחלות מוח רבים.
Interneurons הקדמי נולדים בעיקר מן שני מבנים עובריים ארעי, הרוחביים ganglionic המדיאלי, סימטרית (MGE ו- CGE, בהתאמה). אלו תאים postmitotic (interneuron סימנים מקדימים) ואז לעבור שלב ההעברה וצורניים ממושך כדי לפזר ברחבי telencephalon שבו הם לשלב מגוון רחב של מעגלים. Interneurons MGE-derived מורכב שלוש תת-קבוצות במידה רבה שאינם חופפים, neurochemically הגדרה: עולה מהר parvalbumin (PV+) interneurons, במהירות שאינה עולה somatostatin (SST+) interneurons, ולא מאוחר עולה עצביים חנקתית תחמוצת interneurons סינתאז (nNOS+) המהווים תאים neurogliaform ואייבי בהיפוקמפוס. מעבדות רבות זיהו מספר מנגנונים בתוך MGE המסדירים גורל הראשונית החלטות PV+ או SST + interneurons, כולל מעברי צבע המרחבי של אורגניזם, תאריך לידה של סימנים מקדימים interneuron המצב של חטיבת neurogenic 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. זה הוצע כי interneurons להבדיל בתחילה למחלקות' מונה', ואז בהדרגה בוגר למחלקות' סופי' כפי שהם אינטראקציה עם הסביבה שלהם11. הראיות זה התבצעה מציין כי כמה סוגי interneuron בוגר עלול להיות גנטית קשיחה כמו תאים אלה הופכים postmitotic, ganglionic הרוחביים, המציין כי מוקדם שהוגדרו מהותי גנטי תוכניות עשוי לשחק תפקיד גדול יותר מאשר בעבר בברכה12,13. שאלת המפתח של מה תוכניות גנטי מהותי אינטראקציה עם רמזים סביבתיים ליצור בידול לתוך תת interneuron ברורים, אולם נותרה נחקרו במידה רבה.
מחקרים רבים יש להשתיל תאים עובריים MGE ישירות לתוך מגוון של אזורים במוח, עם התוצאות קונצנזוס זה הושתל תאים בוגרים ולשחרר גאבא לעכב את המעגלים אנדוגני המקומי14,15, בדרך כלל 16,17,18,19. אלה המבטיח תצפיות יצרו עניין משמעותי באמצעות תאי גזע pluripotent המושרה אנושי (hIPSC)-נגזר interneurons לטיפול במגוון מחלות המוח. עם זאת, מעטים המחקרים הללו להעריך אם תאים אלה המושתל בוגר של סוגי הצפוי interneurons בוגר, מרכיב קריטי כאשר אחד חושב על גישות translational.
כדי לטפל כיצד הסביבה משפיע על התמיינות interneuron ועם בגרות, אסטרטגיה הומצאה השתלת interneuron ילדותי מבשרי לתוך סביבות המוח החדש על מנת לבחון interneurons המושתל לאמץ תכונות של המארח הסביבה או לשמור על תכונות הסביבה תורם20. השתלות MGE אינם מתאימים להתייחס לשאלה זו, כי MGE מכיל אוכלוסייה מעורבת של interneuron ו- GABAergic הקרנה התאים לפזר ברחבי המוח רבים אזורים21. מבלי לדעת היכן היגרו תאים אלה MGE, אחד יכול לא לגמרי להעריך כמה השתלות אלה מושפעות על ידי הסביבה המוח. בבציר מבשרי interneuron ב timepoints לאחר הלידה המוקדמת, בעיה זו הוא מצויין על ידי קבלת תאים לא בשלה יש להשלים את ההעברה שלהם, במטרתם המוח באזור אבל יש אינטראקציה מינימלית עם הסביבה. על-ידי התמקדות בתכונות ספציפיות של interneurons באים לידי ביטוי באופן שונה בין אזורים שונים במוח, אז ניתן לקבוע כיצד הסביבה מארח משתנה interneuron מאפיינים. הגישה הכללית המתוארות ב פרוטוקול זה צריך להיות החלים על כל חוקר רוצה לבחון כמה צעיר נוירונים מתנהגים כאשר אתגר בסביבה חדשה.

<table><tbody><tr><td>נתרן כלורי</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט</td><td>Sigma</td><td>S6297</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פוספט מונו-בסיסי</td><td>Sigma</td><td>S0751</td><td></td></tr><tr><td>סידן כלורי</td><td>Sigma</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד</td><td>Sigma</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td>Sigma</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>Sigma</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>מטריצות מוח</td><td>Roboz</td><td>SA-2165</td><td>נחוץ רק אם קצירת סטריאטום</td></tr><tr><td>נקודה עדינה Dumont מלקחיים</td><td>Roboz</td><td>RS-4978</td><td></td></tr><tr><td>מספריים מיקרו-חיתוך</td><td>Roboz</td><td>RS-5940</td><td></td></tr><tr><td>סכיני גילוח</td><td>ThermoFisher</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>פיפטות פסטר</td><td>ThermoFisher</td><td>1367820C</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject III</td><td>Drummond</td><td>3-000-207</td><td></td></tr><tr><td>מניפולטור ידני עם מעמד</td><td>World Precision Instruments&nbsp;</td><td>M3301R/M10</td><td></td></tr><tr><td>5 מ"ל צינורות פלסטיק תחתונים עגולים</td><td>ThermoFisher</td><td>149591A</td><td></td></tr><tr><td>60 מ"מ צלחות פטרי</td><td>ThermoFisher</td><td>12556001</td><td></td></tr><tr><td>100 מ"מ צלחות פטרי</td><td>ThermoFisher</td><td>12565100</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Sigma</td><td>10165921001</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>16140063</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>4716728001</td><td></td></tr><tr><td>Celltrics 50um פילטרים</td><td>Sysmex</td><td>04-0042327</td><td></td></tr><tr><td>טריפן כחול</td><td>ThermoFisher</td><td>15-250-061</td><td></td></tr><tr><td>המוציטומטר</td><td>ThermoFisher</td><td>02-671-6</td><td></td></tr></tbody></table>

השתלת homochronic של סימנים מקדימים interneuron לתוך מוח העכבר כמחנכת מוקדם

Homochronic Transplantation of Interneuron Precursors into Early Postnatal Mouse Brains

גורל עצביים נחישות ועם בגרות דורשת מורכבות הגומלין בין הסביבה אותות ותוכניות גנטי. אולם, disentangling את התפקידים של מהותי לעומת חיצוני מנגנונים המסדירים את תהליך בידול זה היא בעיה עבור כל neurobiologists התפתחותית. בעיה זו מוגדל עבור GABAergic interneurons, אוכלוסיה הטרוגנית מאוד תא נולד מתוך מבנים עובריים ארעי, עוברים שלב הנדידה ממושך כדי לפזר ברחבי telencephalon. על מנת לחקור כמה שונה המוח סביבות משפיעים על interneuron הגורל ועם בגרות, פיתחנו פרוטוקול עבור קציר שכותרתו fluorescently interneuron לא בוגר מבשרי מאזורים ספציפיים במוח בעכברים היילוד (P0-P2). בגיל הזה, interneuron ההעברה כמעט מושלם, תאים אלה מתקיימות בסביבות מנוחתו הסופי שלהם עם יחסית מעט שילוב סינפטית. בעקבות אוסף של פתרונות תא בודד באמצעות cytometry זרימה, אלו סימנים מקדימים interneuron מושתלים לתוך P0-P2 wildtype לאחר הלידה הגורים. על ידי ביצוע שני homotopic (למשל, קליפת-כדי-קליפת) או הטרוטופיות (למשל, קליפת-כדי-היפוקמפוס) השתלות, אחד לא יכול להעריך איך מאתגר interneurons ילדותי בסביבות המוח החדש משפיע שלהם הגורל, ההבשלה ושילוב במעגל. המוח יכול להיות שנקטפו בעכברים בוגרים, לבדיקה עם מגוון רחב של ניתוח posthoc על תאי המושתל, כולל immunohistochemical, אלקטרופיזיולוגיות, תעתיק פרופיל. כללי לגישה זו חוקרים עם אסטרטגיה assay סביבות מובחנות איך המוח יכול להשפיע על היבטים רבים של פיתוח נוירון ולזהות אם תכונותיה עצביים מונעים בעיקר על-ידי תוכניות גנטי קשיחה או רמזים סביבתיים.

פרוטוקול זה מדגים כיצד הקציר אזורים ספציפיים במוח של המוח כמחנכת מוקדם (איור 1-2) לאסוף dissociations תא בודד של סימנים מקדימים interneuron, השתלת תאים אלה לתוך אזורים שונים במוח,-תמימה WT לאחר הלידה הגורים (איור 3). לניתוח posthoc, המוח שקיבלו שתלי קודמן interneuron נקטפו בין P30-35 לאפיין תא מורפולוגיה, סמני עצבית ומאפיינים אלקטרופיזיולוגיות. סוגים אלה של מבחני מתבצעות לעתים קרובות בין P21-P30 בעכברים נורמלי, א...

מאתגר צעיר הנוירונים באזורים במוח חדש יכול לחשוף תובנות חשובות איך הסביבה מפסל גורל עצביים ועם בגרות. פרוטוקול זה מתאר הליך כדי לקצור מבשרי interneuron מאזורים ספציפיים במוח, השתלת אותם גם homotopically או heterotopically לתוך המוח של הגורים כמחנכת.

השתלת Homochronic של סימנים מקדימים Interneuron לתוך מוח העכבר כמחנכת מוקדם

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לקצור מבשרי אינטרנוירונים מאזורי מוח מובהקים בגורי עכברים לאחר לידה, ולהשתיל תאים אלה למושתלים תואמי גיל כדי להעריך כיצד שינויים סביבתיים משפיעים על גורל והתבגרות בין-עצביים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום מדעי המוח ההתפתחותיים לגבי האופן שבו תוכניות גנטיות מהותיות ואותות סביבתיים מתקשרים כדי לפסל את גורלם של תאים עצביים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לנתח שינויים בגורלם ובהתבגרותם של מבשרי אינטרנוירונים לאחר העברתם לאימוץ לסביבה מוחית חדשה.הדגמה חזותית של שלבי קצירת התאים והשתלת התאים היא קריטית מכיוון ששגיאות קטנות בטכניקה עלולות להוביל לניסויי השתלה לא יעילים ולא מוצלחים. כדי להתחיל, הנח סכין גילוח אחד דרך האונה הקדמית הקדמית של מוח גור אחד לאחר הלידה, וסכיני גילוח נוספים לתוך החריצים האחוריים לסכין הגילוח הראשון כדי ליצור שתי פרוסות של 0.5 מילימטר. העבירו את פרוסות הסטריאטליות לצלחת פטרי עם סוכרוז מבעבע, נוזל מוחי מלאכותי או sACSF והניחו את רקמת המוח הנותרת בצלחת פטרי עם sACSF על קרח.הניחו את הפרוסות מתחת למיקרוסקופ מנתח והשתמשו במלקחיים כדי לצבוט את הסטריאטום משתי ההמיספרות, והניחו את הגושים הסטריאטליים בצינור של 50 מיליליטר של sACSF על קרח בזמן שהם נקצרים. אם המוח נקצר מעכבר מדווח פלואורסצנטי, השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי להבחין בין אות העגבנייה הסטריאטלי לבין האות הפלואורסצנטי החזק יותר של הגלובוס פלידוס. כדי להסיר את ההיפוקמפוס, השתמשו במלקחיים כדי לחתוך את המוח לאורך קו האמצע, והניחו המיספרה אחת מתחת למשטח מדיאלי של מיקרוסקופ מנתח כלפי מעלה.השתמש במלקחיים כדי להסיר את רקמת המוח הגחונית ולזהות את ההיפוקמפוס בצורת נקניק המשתרע על הגישה הקדמית-אחורית לאורך הצד הגבי והחדר של קליפת המוח. הכניסו את קצות המלקחיים לפני ההיפוקמפוס הקדמי, וקדמו את המלקחיים לאחור תוך צביטה לאורך גבול קליפת המוח של ההיפוקמפוס כדי להפריד בעדינות את ההיפוקמפוס מקליפת המוח. הנח את הרקמה המבודדת בצינור של 50 מיליליטר של sACSF על קרח וחזור על קציר ההיפוקמפוס עבור חצי הכדור הנגדי.לאחר מכן הניחו את הצד המדיאלי של קליפת המוח החצויה כלפי מטה והשתמשו במלקחיים כדי להסיר את החלקים הגביים, הגחוניים, הקדמיים והאחוריים ביותר של קליפת המוח. העבירו את הריבוע הנותר של קליפת המוח המדיאלית לתוך צינור של 50 מיליליטר של sACSF על קרח. לאחר הסרת המוח, הצמד את הצד הגחוני של המוח כלפי מטה דרך המוח הקטן וקליפת המוח הקדמית או נורות הריח.בעזרת מלקחיים מעוקלים, הפרד בעדינות את קליפת המוח האחורית מההיפוקמפוס הבסיסי ורקמות אחרות בכל חצי כדור. ולקלף את קליפת המוח הגבית קדימה כדי לחשוף את המבנים הבסיסיים. השתמשו במלקחיים כדי לצבוט את ההיפוקמפוס בהמיספרה אחת בקו האמצע, והסירו את ההיפוקמפוס על ידי קילופו לרוחב הרחק מהמוח.הניחו את ההיפוקמפוס בצינור של 50 מיליליטר של sACSF על קרח וקצרו את ההיפוקמפוס הנגדי באותו אופן. לאחר מכן מגרדים בעדינות סביב שולי הסטריאטום כדי לשחרר אותו מהרקמה שמסביב. צבטו בעדינות מתחת לסטריאטום כדי לקצור את רקמת הסטריאטום.לאחר קצירת קליפת המוח משתי ההמיספרות, כפי שהודגם קודם לכן, העבירו את הסטריאטום תחת טווח ניתוח פלואורסצנטי. השתמש במלקחיים כדי להסיר כל רקמת גלובוס פלידוס חיובית אדומה בהירה מכל סטריאטום. לאחר שכל הרקמות נקצרו, העבירו רקמה לצינור תחתון עגול של חמישה מילימטר והחליפו את ה-sACSF בכל צינור איסוף בשני מיליליטר של תמיסת פרונאז-sACSF שהוכנה טרי לדגירה של 20 דקות בטמפרטורת החדר עם תנועות מדי פעם.בתום הדגירה, החלף בזהירות את הפרונאז-sACSF במיליליטר אחד עד שניים של תמיסת בנייה מחדש, ונתק מכנית את הרקמות עם צינורות פסטר מלוטשים באש. כאשר הרקמה עכורה ולא נראים גושי רקמה, מסננים את תמיסת התאים דרך מסנן של 50 מיקרון לצינורות תחתונים עגולים חדשים של חמישה מיליליטר כדי להסיר גושי תאים לפני מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות. לאחר קבלת התאים מציטומטריית זרימה, העבירו את מתלי התאים לצינורות חרוטיים של 1.5 מיליליטר לצנטריפוגה.לאחר הצנטריפוגה, שאפו את כל המיקרוליטרים מלבד 20 המיקרוליטרים האחרונים של סופרנטנט מכל צינור, והרכיבו מחדש את הכדורים לספירה. במידת הצורך, יש לדלל את תמיסת התאים עם sACSF לאחד עד שלוש פעמים 10 עד 5 תאים לריכוז מיקרוליטר. טען מיקרופיפטה עדינה בשמן מינרלי.חבר את המיקרופיפטה למזרק ננו-ליטר, ואבטח את מנגנון הזרקת הננו-ליטר למניפולטור המחובר לבסיס מגנטי. בזמן שהגור הראשון מורדם על קרח, פיפטה את תמיסת התא מספר פעמים כדי להבטיח פיזור תאים הומוגני. הוציאו את השמן המינרלי ומלאו לחלוטין את הפיפטה במתלה התא היחיד.לאחר אישור חוסר תגובה לצביטה בבוהן, הניחו את הגור על מכסה צלחת פטרי כשהראש מונח על שפכטל דבק, כך שהחלק העליון של הראש יהיה שטוח יחסית. כסו את הראש בפיסת סרט מעבדה עם חור יהלום, משכו את הסרט הנלמד עד שהעור נמתח כך שהראש מאובטח היטב והלמבדה נראית דרך החור. הזיזו את הגור המאובטח מתחת למזרק הננוליטר והורידו את המיקרופיפטה כך שהקצה יהיה ישירות מעל הלמבדה.התבונן בקואורדינטות X, Y על המניפולטור והתאם את כפתורי המניפולטור עד שהמיקרופיפטה ממוקמת בקואורדינטות המתאימות לאורך הצירים המדיאליים, הרוחביים והקדמיים של הראש. הורידו את המיקרופיפטה עד שהקצה יוצר קיעור קטן על העור, וסובבו את כפתור המניפולטור של ציר ה-z בחוזקה אך בעדינות כדי לדחוף את המיקרופיפטה דרך העור והגולגולת לתוך המוח. משוך מעט את המיקרופיפטה עד שהקצה מוקף בחרוט עור בצורת אוהל.והצג את הקואורדינטות לאורך ציר ה-z. לאחר מכן הורידו את המיקרופיפטה לעומק הניסוי המתאים והזריקו את התאים. המתן 15 שניות לאחר מסירת התאים לפני החזרת המיקרופיפטה וחזור על ההזרקה במיקום שני אם תרצה.הנח את הגור על כרית חימום ופקח עד להשגת התאוששות מלאה לפני העברתו חזרה לכלוב הביתי. תאים מושתלים נודדים בין אזורי המוח הממוקדים עם שיעורי הישרדות תאים משתנים הנעים בין עשרות לכמה אלפים. התאים המושתלים ממוקמים באזורים המתאימים עם תאים רבים המציגים מורפולוגיות בין-עצביות וסמנים נוירוכימיים בין-עצביים מאופיינים היטב.התאים התורמים שורדים ומתבגרים גם כאשר הם מושתלים בסביבות חדשות עם השתלות הטרוטופיות. ניתוח אלקטרופיזיולוגי של התאים המושתלים חושף תכונות פיזיולוגיות דמויות בוגרות ודפוסי ירי מובחנים, המייצגים תת-סוגים של אינטרנוירונים מוגדרים היטב, מה שמרמז על כך שאינטרנוירונים מושתלים מסוגלים להתבגר כראוי בסביבת המארח. תאים מושתלים מציגים גם זרמים פוסט-סינפטיים מעוררים ספונטניים.הקלטה מתאי פירמידה הסמוכים לתאי עצב מושתלים המבטאים channelrhodopsin-2 חושפת זרמי GABAergic פוסט-סינפטיים המתעוררים על ידי אור כחול בתאי פירמידה אנדוגניים אלה. בזמן ניסיון ההליך הזה, חשוב לשמור על התאים על קרח ולשכלל את התאים בעדינות עם פיפטה פסטר כדי למזער את מוות התאים. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון ריצוף תא בודד על התאים המושתלים כדי להגדיר בצורה מלאה יותר כיצד שינויים סביבתיים משפיעים על הטרנסקריפטום של התא.לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות מסוגל לבודד מבשרי אינטרנוירונים מאזורי מוח שונים של גורים יילודים ולהשתיל תאים אלה לאזורי מוח שונים של גורים לאחר לידה תואמי גיל.

homochronic-transplantation-interneuron-precursors-into-early

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

מקור: Weber, R. Z., et al. השתלה תוך מוחית ומעקב ביולומינסנציה in vivo של תאי אב עצביים אנושיים במוח העכבר. J. Vis. Exp. (2022)סרטון זה מדגים את ההשתלה הסטריאוטקסית של תאי אב עצביים אנושיים מהונדסים גנטית (NPCs) לתוך מוח העכבר. חוקרים מזריקים NPCs המבטאים לוציפראז וחלבונים פלואורסצנטיים, המאפשרים הדמיה ביולומינסנציה in vivo ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית לאחר המוות כדי לחקור את הישרדות התאים, נדידה ואינטגרציה במחקר נוירולוגי.

השתלת תאי אב עצביים אנושיים במוח העכבר

סרטון זה מציג שיטה ליצירת מבשרי אינטרנוירונים קורטיקליים מתאי גזע עובריים של עכברים. הפרוטוקול כולל גידול תאי גזע במדיה המכילה מעכבי מולקולות קטנות ספציפיות, המאפשרים התרבות תאי גזע וצבירה לגופי עובר (EBs). לאחר מכן, EBs מנותקים עם אנזימים ומצופים על בארות צלחת תרבית מצופים חלבוני הידבקות כדי לקדם את התמיינותם למבשרי אינטרנוירון קליפת המוח.

יצירת מבשרי אינטרנוירון קורטיקליים מתאי גזע עובריים של עכברים

מקור: Quattrocolo, G., et al. השתלה הומוכרונית של מבשרי אינטרנוירונים במוח עכברים מוקדמים לאחר הלידה. J. Vis. Exp. (2018)סרטון זה מדגים את ההשתלה של תאים מבשרים בין-נוירוניים למוח העכבר היילוד באמצעות גישה הומוטופית או הטרוטופית. ההליך כולל אבטחת גור מושתל מורדם, זיהוי אזור מוח היעד והזרקת תרחיף של תאים קודמים שמקורם בגור תורם באותו שלב התפתחותי. לאחר ההזרקה, הגור מועבר לכרית חימום להתאוששות, מה שמאפשר הערכה לאחר מכן של הישרדות התא התורם והתבגרותו.

השתלת תאי מבשר בין-נוירוניים למוח של גור עכבר

מקור: Gonzalez-Ramos, A., et. al., השתלת נוירונים GABAergic שמקורם בתאי גזע אנושיים בהיפוקמפוס העכבר המוקדם לאחר הלידה כדי להפחית הפרעות נוירו-התפתחותיות. J. Vis. Exp. (2022)סרטון זה מדגים את ההזרקה הסטריאוטקסית של תאי מבשר אינטרנוירונים שמקורם באדם לתוך ההיפוקמפוס של גור עכבר מהונדס גנטית עם אינטרנוירונים מעכבים מופחתים, במטרה להחזיר את האיזון המעורר-מעכב.

השתלת תאי מבשר בין-עצביים שמקורם באדם בהיפוקמפוס גור העכבר

מקור: Denaxa, M., el al., השתלת אבות של אינטרנוירונים קליפתיים מהונדסים כימוגנטית לתוך מוחות עכברים מוקדמים לאחר הלידה. J. Vis. Exp. (2019)סרטון זה מדגים את ההליך להזרקת וקטור פלסמיד הנושא את הגן המעניין לאבות בין-נוירוניים בפרוסת מוח עוברית, ואחריו אלקטרופורציה לכניסת פלסמיד וביטוי גנים. אבות אבות מותאמים אלה יכולים לשמש מאוחר יותר לטיפול בהפרעות מוחיות.

העברת גנים בסיוע אלקטרופורציה משובצת אגרוז באבות אבות בין-עצביים בקליפת המוח של עכברים

פרוטוקול זה מתאר שיטה ליצירת interneuron קורטיקלית אבות ו מבשרי פוסט-mitotic interneuron של תאי גזע עובריים בעכבר בשיטה שונה embryoid גוף-כדי-טפט. אלה אבות/מבשרי יכולים להיות בשימוש במבחנה או fluorescently מיון מושתלים לתוך קליפת neonatal ללמוד קביעת גורל, או שימוש ביישומים טיפולית.

התמיינות של תאי גזע עובריים בעכבר לתוך Interneuron קורטיקלית מבשרי

בהתבסס על הנדסת חוץ גופית ויראלי של מראש עצבי, שיתוף ההשתלה שלהם למוח פראי סוג ולזווג הערכה מורמטרית של "מבחן" ו "שליטה" נגזרים, שיטה זו מאפשרת דוגמנות מדויקת של בקרת vivo gene של הנאוקורטילית עצב מורפולוגיה בדרך פשוטה ובמחיר סביר.

השתלת השתלות מהונדסים של הנדסה עצבית בVivo לימודי נוירוארכיטקטורה

כאן אנו מציגים פרוטוקול, שנועד להשתמש כלים גנטיים כדי לתמרן את הפעילות של הושלתי בקליפת המוח הפנימי מושתלים לתוך הקליפה של עכברים לידתיים מוקדם.

השתלת כימוגנטית מהונדס בקליפת המוח ושלתי לתוך המוחות המוקדמים של העכבר לנטאל

השתלה של נוירונים GABAergic שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים שנוצרו על ידי תכנות עצבי יכולה להיות גישה טיפולית פוטנציאלית להפרעות נוירו-התפתחותיות. פרוטוקול זה מתאר את הדור וההשתלה של מבשרים עצביים GABAergic שמקורם בתאי גזע אנושיים במוחם של עכברים ילודים, מה שמאפשר חקירה ארוכת טווח של נוירונים מושתלים והערכת הפוטנציאל הטיפולי שלהם.

השתלת תאי עצב GABAergic שמקורם בתאי גזע אנושיים בהיפוקמפוס העכברים המוקדם לאחר הלידה כדי למתן הפרעות נוירו-התפתחותיות

פסיפס ניתוח פונקציה ג&#39;ין בפיתוח עכבר אחרי לידה המוח על ידי שימוש וירוס מבוססי רקומבינציה Cre

למדו שיטת השתלה הומוכרונית של קדמי תאי עצב ביניים ממוח עכברים נאונטליים לנבדקים בני גילם. טכניקה זו מאפשרת לחקור כיצד שינויים סביבתיים משפיעים על גורל התאים והבשלתם במוח.

השתלת Homochronic של סימנים מקדימים Interneuron לתוך מוח העכבר כמחנכת מוקדם

גלה סרטונים נוספים