השתלת Homochronic של סימנים מקדימים Interneuron לתוך מוח העכבר כמחנכת מוקדם

המטרה הכוללת של הליך זה היא לקצור מבשרי אינטרנוירונים מאזורי מוח מובהקים בגורי עכברים לאחר לידה, ולהשתיל תאים אלה למושתלים תואמי גיל כדי להעריך כיצד שינויים סביבתיים משפיעים על גורל והתבגרות בין-עצביים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום מדעי המוח ההתפתחותיים לגבי האופן שבו תוכניות גנטיות מהותיות ואותות סביבתיים מתקשרים כדי לפסל את גורלם של תאים עצביים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לנתח שינויים בגורלם ובהתבגרותם של מבשרי אינטרנוירונים לאחר העברתם לאימוץ לסביבה מוחית חדשה.

הדגמה חזותית של שלבי קצירת התאים והשתלת התאים היא קריטית מכיוון ששגיאות קטנות בטכניקה עלולות להוביל לניסויי השתלה לא יעילים ולא מוצלחים. כדי להתחיל, הנח סכין גילוח אחד דרך האונה הקדמית הקדמית של מוח גור אחד לאחר הלידה, וסכיני גילוח נוספים לתוך החריצים האחוריים לסכין הגילוח הראשון כדי ליצור שתי פרוסות של 0.5 מילימטר. העבירו את פרוסות הסטריאטליות לצלחת פטרי עם סוכרוז מבעבע, נוזל מוחי מלאכותי או sACSF והניחו את רקמת המוח הנותרת בצלחת פטרי עם sACSF על קרח.

הניחו את הפרוסות מתחת למיקרוסקופ מנתח והשתמשו במלקחיים כדי לצבוט את הסטריאטום משתי ההמיספרות, והניחו את הגושים הסטריאטליים בצינור של 50 מיליליטר של sACSF על קרח בזמן שהם נקצרים. אם המוח נקצר מעכבר מדווח פלואורסצנטי, השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי להבחין בין אות העגבנייה הסטריאטלי לבין האות הפלואורסצנטי החזק יותר של הגלובוס פלידוס. כדי להסיר את ההיפוקמפוס, השתמשו במלקחיים כדי לחתוך את המוח לאורך קו האמצע, והניחו המיספרה אחת מתחת למשטח מדיאלי של מיקרוסקופ מנתח כלפי מעלה.

השתמש במלקחיים כדי להסיר את רקמת המוח הגחונית ולזהות את ההיפוקמפוס בצורת נקניק המשתרע על הגישה הקדמית-אחורית לאורך הצד הגבי והחדר של קליפת המוח. הכניסו את קצות המלקחיים לפני ההיפוקמפוס הקדמי, וקדמו את המלקחיים לאחור תוך צביטה לאורך גבול קליפת המוח של ההיפוקמפוס כדי להפריד בעדינות את ההיפוקמפוס מקליפת המוח. הנח את הרקמה המבודדת בצינור של 50 מיליליטר של sACSF על קרח וחזור על קציר ההיפוקמפוס עבור חצי הכדור הנגדי.

לאחר מכן הניחו את הצד המדיאלי של קליפת המוח החצויה כלפי מטה והשתמשו במלקחיים כדי להסיר את החלקים הגביים, הגחוניים, הקדמיים והאחוריים ביותר של קליפת המוח. העבירו את הריבוע הנותר של קליפת המוח המדיאלית לתוך צינור של 50 מיליליטר של sACSF על קרח. לאחר הסרת המוח, הצמד את הצד הגחוני של המוח כלפי מטה דרך המוח הקטן וקליפת המוח הקדמית או נורות הריח.

בעזרת מלקחיים מעוקלים, הפרד בעדינות את קליפת המוח האחורית מההיפוקמפוס הבסיסי ורקמות אחרות בכל חצי כדור. ולקלף את קליפת המוח הגבית קדימה כדי לחשוף את המבנים הבסיסיים. השתמשו במלקחיים כדי לצבוט את ההיפוקמפוס בהמיספרה אחת בקו האמצע, והסירו את ההיפוקמפוס על ידי קילופו לרוחב הרחק מהמוח.

הניחו את ההיפוקמפוס בצינור של 50 מיליליטר של sACSF על קרח וקצרו את ההיפוקמפוס הנגדי באותו אופן. לאחר מכן מגרדים בעדינות סביב שולי הסטריאטום כדי לשחרר אותו מהרקמה שמסביב. צבטו בעדינות מתחת לסטריאטום כדי לקצור את רקמת הסטריאטום.

לאחר קצירת קליפת המוח משתי ההמיספרות, כפי שהודגם קודם לכן, העבירו את הסטריאטום תחת טווח ניתוח פלואורסצנטי. השתמש במלקחיים כדי להסיר כל רקמת גלובוס פלידוס חיובית אדומה בהירה מכל סטריאטום. לאחר שכל הרקמות נקצרו, העבירו רקמה לצינור תחתון עגול של חמישה מילימטר והחליפו את ה-sACSF בכל צינור איסוף בשני מיליליטר של תמיסת פרונאז-sACSF שהוכנה טרי לדגירה של 20 דקות בטמפרטורת החדר עם תנועות מדי פעם.

בתום הדגירה, החלף בזהירות את הפרונאז-sACSF במיליליטר אחד עד שניים של תמיסת בנייה מחדש, ונתק מכנית את הרקמות עם צינורות פסטר מלוטשים באש. כאשר הרקמה עכורה ולא נראים גושי רקמה, מסננים את תמיסת התאים דרך מסנן של 50 מיקרון לצינורות תחתונים עגולים חדשים של חמישה מיליליטר כדי להסיר גושי תאים לפני מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות. לאחר קבלת התאים מציטומטריית זרימה, העבירו את מתלי התאים לצינורות חרוטיים של 1.5 מיליליטר לצנטריפוגה.

לאחר הצנטריפוגה, שאפו את כל המיקרוליטרים מלבד 20 המיקרוליטרים האחרונים של סופרנטנט מכל צינור, והרכיבו מחדש את הכדורים לספירה. במידת הצורך, יש לדלל את תמיסת התאים עם sACSF לאחד עד שלוש פעמים 10 עד 5 תאים לריכוז מיקרוליטר. טען מיקרופיפטה עדינה בשמן מינרלי.

חבר את המיקרופיפטה למזרק ננו-ליטר, ואבטח את מנגנון הזרקת הננו-ליטר למניפולטור המחובר לבסיס מגנטי. בזמן שהגור הראשון מורדם על קרח, פיפטה את תמיסת התא מספר פעמים כדי להבטיח פיזור תאים הומוגני. הוציאו את השמן המינרלי ומלאו לחלוטין את הפיפטה במתלה התא היחיד.

לאחר אישור חוסר תגובה לצביטה בבוהן, הניחו את הגור על מכסה צלחת פטרי כשהראש מונח על שפכטל דבק, כך שהחלק העליון של הראש יהיה שטוח יחסית. כסו את הראש בפיסת סרט מעבדה עם חור יהלום, משכו את הסרט הנלמד עד שהעור נמתח כך שהראש מאובטח היטב והלמבדה נראית דרך החור. הזיזו את הגור המאובטח מתחת למזרק הננוליטר והורידו את המיקרופיפטה כך שהקצה יהיה ישירות מעל הלמבדה.

התבונן בקואורדינטות X, Y על המניפולטור והתאם את כפתורי המניפולטור עד שהמיקרופיפטה ממוקמת בקואורדינטות המתאימות לאורך הצירים המדיאליים, הרוחביים והקדמיים של הראש. הורידו את המיקרופיפטה עד שהקצה יוצר קיעור קטן על העור, וסובבו את כפתור המניפולטור של ציר ה-z בחוזקה אך בעדינות כדי לדחוף את המיקרופיפטה דרך העור והגולגולת לתוך המוח. משוך מעט את המיקרופיפטה עד שהקצה מוקף בחרוט עור בצורת אוהל.

והצג את הקואורדינטות לאורך ציר ה-z. לאחר מכן הורידו את המיקרופיפטה לעומק הניסוי המתאים והזריקו את התאים. המתן 15 שניות לאחר מסירת התאים לפני החזרת המיקרופיפטה וחזור על ההזרקה במיקום שני אם תרצה.

הנח את הגור על כרית חימום ופקח עד להשגת התאוששות מלאה לפני העברתו חזרה לכלוב הביתי. תאים מושתלים נודדים בין אזורי המוח הממוקדים עם שיעורי הישרדות תאים משתנים הנעים בין עשרות לכמה אלפים. התאים המושתלים ממוקמים באזורים המתאימים עם תאים רבים המציגים מורפולוגיות בין-עצביות וסמנים נוירוכימיים בין-עצביים מאופיינים היטב.

התאים התורמים שורדים ומתבגרים גם כאשר הם מושתלים בסביבות חדשות עם השתלות הטרוטופיות. ניתוח אלקטרופיזיולוגי של התאים המושתלים חושף תכונות פיזיולוגיות דמויות בוגרות ודפוסי ירי מובחנים, המייצגים תת-סוגים של אינטרנוירונים מוגדרים היטב, מה שמרמז על כך שאינטרנוירונים מושתלים מסוגלים להתבגר כראוי בסביבת המארח. תאים מושתלים מציגים גם זרמים פוסט-סינפטיים מעוררים ספונטניים.

הקלטה מתאי פירמידה הסמוכים לתאי עצב מושתלים המבטאים channelrhodopsin-2 חושפת זרמי GABAergic פוסט-סינפטיים המתעוררים על ידי אור כחול בתאי פירמידה אנדוגניים אלה. בזמן ניסיון ההליך הזה, חשוב לשמור על התאים על קרח ולשכלל את התאים בעדינות עם פיפטה פסטר כדי למזער את מוות התאים. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון ריצוף תא בודד על התאים המושתלים כדי להגדיר בצורה מלאה יותר כיצד שינויים סביבתיים משפיעים על הטרנסקריפטום של התא.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות מסוגל לבודד מבשרי אינטרנוירונים מאזורי מוח שונים של גורים יילודים ולהשתיל תאים אלה לאזורי מוח שונים של גורים לאחר לידה תואמי גיל.