Calorespirometry: גישה חזקה, לא פולשנית כדי לחקור את חילוף החומרים האנרגיה התאית

המטרות הכוללות של הליך זה הן לנתח את הפעילות המטבולית של דגימה ביולוגית ולקבוע עד כמה מסלולים אנאירוביים תורמים לייצור האנרגיה התאית בתוך הדגימה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום התרופות לגבי מידת הרעילות המיטוכונדריאלית במהלך פיתוח תרופה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת מדידה בו זמנית של צריכת חמצן וייצור חום בדגימת תא מעניינת.

כך ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי תכנון הטיפול במהלך פיתוח התרופות. ניתן ליישם אותו גם בתחומים אחרים, כגון קירוביולוגיה שבה ניתן להעריך את ההשפעות של התניה מוקדמת מטבולית על שימור בהקפאה. כדי להכין את מד הנשימה, הוסף תחילה שניים-שני מיליליטר של DMEM לכל תא מד נשימה והכנס את הפקקים במלואם.

כוונן את הפקקים בעזרת כלי פקק-מרווח כדי לאפשר דיפוזיה אופטימלית של חמצן למדיום, והגדר את התאים לערבב ברציפות את הדגימות ב-750 סל"ד ב-37 מעלות צלזיוס עד שריכוז החמצן ושטף החמצן יציבים. ודא שתוכנת מד הנשימה מתוכנתת להסביר את מסיסות החמצן של המדיום המשמש בניסוי. לאחר מכן בחר חלק יציב של עקבות ריכוז החמצן וכיול חלק זה לרוויה של 100% באוויר.

כעת, סגור את הפקקים, וודא שלא יהיו בועות בתאים. לאחר כעשר דקות יש להקפיד על שטף חמצן יציב. כדי להתכונן לקלורימטריה, הוסף תחילה שניים וחמישה מיליליטר מים דה-יונים לאמפולת הייחוס, ולאחר מכן הדק את המכסה.

בעזרת משאבת אוויר, הסר פסולת חיצונית מהאמפולה, ולאחר מכן הורד לאט את האמפולה כדי למקם אחת בתעלת הייחוס של הקלורימטר. האמפולה תישאר במיקום הראשון עד להכנת האמפולה עם דגימת התא. DMEM, המשמש לקלורימטריה, צריך להיות מאוזן בחממה של 37 מעלות צלזיוס עם אטמוספירה לחה ו-5% CO2.

התחל את הניסוי על ידי הוספת שלושה מיליליטר של DMEM לצלחת של 100 מיליליטר עבור כל אמפולה קלורימטרית שתשתמש בה, והנח את הצלחת בחממה עד שהדגימה מוכנה לקלוריות. בזמן שהמדיום מאזן, השתמש במיקרוסקופ הפוך כדי לבחור צלחת עם תאי HepG2 שהם בין 60 ל-80% מתכנסים ומפוזרים בצורה הומוגנית. ראשית, הסר את מדיום תרבית התאים ושטוף את התאים פעמיים עם 10 מיליליטר PBS.

הוסף שלושה מיליליטר טריפסין שחומם מראש ב -37 מעלות צלזיוס ודגר את הצלחת ב -37 מעלות צלזיוס. לאחר שבע עד 10 דקות של דגירה, נטרל את התגובה האנזימטית עם שלושת המיליליטר של 37 מעלות צלזיוס DMEM והשתמש בפיפטה של חמישה מיליליטר כדי לפרק בעדינות את התאים לתרחיף של תא בודד. העבירו את התאים לצינור חרוטי סטרילי של 15 מיליליטר לצנטריפוגה, והשעו מחדש את הפלטה בכחמישה מיליליטר של DMEM טרי.

פיפט את התאים ביסודיות כדי לפרק את כל אשכולות התאים, ולאחר הספירה, לרכז את התאים לכשני מיליון תאים לכל 50 מיקרוליטר של תווך. יכולת השחזור של שיטה זו תלויה בספירת תאים עקבית ומדויקת. זה קריטי לוודא שהדגימה הומוגנית ושהתאים אינם מגובשים בשום שלב במהלך הניתוח.

לאחר מכן, אחסן את התאים על קרח עד שהם מוכנים לבצע מדידות ספירומטריות וקלורימטריות. לפני המדידה הקלורימטרית, ודא כי הקלורימטר מחובר למחשב וכי האות הקלורימטרי יציב ובמיקרו-וואט. לדלל את התאים ל-100,000 תאים למיליליטר בתווך המאוזן שהונח בחממה לפני הכנת הדגימה.

לאחר מכן הוסף שניים וחמישה מיליליטר של תמיסת תאים לכל אמפולה, וודא שנפח אוויר מספיק נשמר בין מכסי האמפולות למדיום כדי לאפשר דיפוזיה של גז. הדק מיד את המכסים ונקה את האמפולות האטומות באוויר כדי להסיר פסולת חיצונית. לאחר מכן הורד לאט את האמפולה האטומה עם דגימת התא כדי למקם את אחת הקלורימטרים.

מערבבים היטב את הדגימה כדי להבטיח תמיסה הומוגנית, ומזריקים שני מיליון תאים לכל תא סגור של מד הנשימה תוך ערבוב מתמשך. לאחר 15 דקות במיקום הראשון בקלורימטר, הורד לאט לאט גם את אמפולה הייחוס וגם את האמפולה עם התאים כדי למקם שתיים ולרשום את זמן ההורדה. 10 עד 15 דקות לאחר הזרקת התאים לנשימה, יש להבחין בייצוב שטף החמצן ובירידה מתמדת בריכוז החמצן.

כדי לקבוע נשימת דליפה, הזריק מיקרוליטר אחד של ארבעה מיליגרם למיליליטר אוליגומיצין לכל תא ואפשר לשטף החמצן להתייצב במשך כ-10 דקות, תוך רישום קצב נשימת הדליפה היציב כפי שהודגם זה עתה. לאחר מכן, כדי לקבוע את השטף המקסימלי, הזרקו שני מיקרוליטרים של FCCP אפס נקודה שתיים מילימולר לתוך החדר, מה שמאפשר לשטף החמצן להתייצב לאחר כל הזרקה, ולהמשיך את הטיטרציות עד להגעה לשטף המקסימלי. רשום את קצב הנשימה היציב במהלך השטף המרבי.

כאשר תא הנשימה פועל לפני מדידת הדגימה, גם ריכוז החמצן וגם עקבות שטף החמצן צריכים להיות יציבים. לאחר הורדת האמפולה למצב שתיים, ניתן לזהות פרק זמן בו תפוקת החום יציבה, וניתן לזהות זמן מתאים בו שטף החמצן יציב, כדי לאפשר חישוב של היחס הקלורספירומטרי. אם תאי HepG2 מתורבתים בהיעדר גלוקוז וגלקטוז מתווסף כדי להגביר את המעורבות המיטוכונדריאלית, התאים אינם מתרבים בתוך הקלורימטר, אלא מפחיתים את פעילותם המטבולית לאחר כ-30 דקות באמפולה, ומגבילים את החישוב הקלורספירומטרי לנקודת הזמן המוקדמת ביותר בה נמדד פיזור החום.

זה קריטי לתעד את זמן הזרמת התאים לאמפולה כך שמדידות ייצור החום וצריכת החמצן נאספות בנקודות זמן זהות, מכיוון שלוקח כ -15 דקות עד ששטף החמצן מתייצב וריכוז החמצן יורד בהתמדה. מכיוון ששטף החמצן המיוצב של התאים משמש כתחליף לצריכת החמצן בעת חישוב היחס הקלורספירומטרי, ניתן לבצע טיטרציות נוספות כדי להעריך את נשימת הדליפה, אשר מסומנת על ידי ירידה בשטף החמצן והנשימה המקסימלית הבלתי מצומדת, אשר מסומנת על ידי כישלון בהגברת הנשימה עם טיטרציות FCCP עוקבות. לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך פחות מארבע שעות אם היא מבוצעת כראוי.

בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שקווי תאים אחרים עשויים להיות בעלי תכונות מטבוליות שונות. לכן, כל קו תא חדש חייב להיות מותאם הן למדידות הקלורימטריות והן למדידות הספירומטריות שלו. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין תאי HepG2 לקלורספירומטריה כדי להבטיח כיול אינסטרומנטלי נכון, ולבצע כראוי ניסוי קלורספירומטרי.