Neurosphere Assay כדי להעריך את הפעלת אנדוגני תאי גזע עצביים במודל של עכברים של פגיעה בחוט השדרה מינימלי
13 בספטמבר 2018
. הנה, נדגים את הביצועים של מודל פגיעה בחוט השדרה מינימלי עכבר למבוגרים זה חוסך הנישה התעלה המרכזית דיור אנדוגני תאי גזע עצביים (NSCs). אנו מראים כיצד ניתן להשתמש וזמינותו neurosphere לכמת הפעלה והעברה של NSCs סופית ופרימיטיבי בעקבות פגיעה.
שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות הקשורות לתפקידם של תאי מבשר עצביים ברפואה רגנרטיבית. באופן ספציפי, אנו יכולים לשאול כיצד פגיעה משפיעה על התנהגותם של תאי קודמן עצביים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מספקת גישה לחקר ההשפעה של פגיעה בחוט השדרה על קינטיקה של תאי מבשר עצבי אנדוגני.
הדגמה חזותית של טכניקות אלה היא קריטית. מכיוון ששלבי הניתוח והדיסקציה דורשים דיוק, ויכולים להיות קשים ללמידה, אם כי ניתן לשכלל אותם עם תרגול. לפני תחילת ההליך, השתמש בקוצץ שיער כדי להסיר את הפרווה מהגב של עכבר מורדם מאמצע הגב לצוואר ולאוזניים.
לאחר אבטחת העכבר במכשיר סטריאוטקטי, הניחו ארבע עד חמש חתיכות גזה מגולגלת מתחת לבטן, תוך משיכה קלה בבסיס הזנב כדי ליישר את הגוף ועמוד השדרה. דחוף את גליל הגזה של בית החזה מבטן העכבר לכיוון בית החזה העליון כדי לתמוך בעמוד השדרה החזי. והשתמש בסרט מעבדה כדי לאבטח את הזנב והגפיים בכיוון דמוי כוכב.
לאחר חיטוי העור החשוף עם ספוגיות יוד אתנול ופובידון עוקבות, השתמש בלהב אזמל מספר 10 כדי לבצע חתך אנכי במקביל לציר האורך של החיה, מנקודת האמצע של שתי השכמות, ועד לעקמומיות עמוד השדרה החזי. משוך את העור כדי לחשוף את הרקמה הרכה ואת קווי המתאר של עמוד השדרה. ולזהות את הגבול התחתון של כרית השומן הסופר שכם.
לאחר מכן, השתמש באזמל כדי לחתוך בזהירות אך בכוח לאורך שני צידי החוליה T5 עד T8 ותשע עצמות, כדי לנתק את גידי השריר האחורי מעמוד השדרה. מקם מחדש את המחזירים כך ששיני המחזירים יוחדרו לאתר החתך משני צידי עמוד השדרה. והרחב כל מפסק כדי להתאים את החשיפה, עד שעמוד השדרה מוגבה מספיק מבלי להפעיל עומס רב מדי על שכבות השרירים הנסוגות.
תחת מיקרוסקופ כירורגי, יש לנקות בזהירות את השריר הנותר ורקמות רכות אחרות הנמצאות מעל עמוד השדרה, כדי לחשוף את עצם החוליות. הצמדת התהליך הקוצני של החוליות עם מלקחיים משוננים, והזזת המלקחיים מעט למעלה ולמטה כדי לזהות את החוליות שיוסרו. לאחר מכן, הכנס קצה אחד של זוג מספריים קהים מעוקלים משני צידי הנקב הבין חולייתי החשוף, הזנב ללמינה החולייתית שיש לכרות.
וחתכו את המפרקים הבין חולייתיים המחברים באופן דו צדדי. לאחר מכן, הרם את הלמינה כלפי מעלה וחתך את החיבור העליון של הלמינה כדי לבודד ולהסיר את העצם. בעת חיתוך והסרה של למינה החוליות, הקפידו תמיד לכוון את המספריים כלפי מעלה כדי לא לפגוע בחוט השדרה הבסיסי.
כאשר ורידי קו האמצע הגבי משמשים כציון דרך, הכנס את הפיר הכפוף של 45 מעלות של קצה מחט 30 מד, הצד המשופע כלפי מעלה, בעומק מילימטר אחד לתוך המשטח הצדדי הגבי של חוט השדרה. וכ -0.5 מילימטרים לרוחב משני צידי קו האמצע. הזיזו את המחט כשני מילימטרים מהכיוון הזנבי לכיוון הרוסטרלי, כך שכל אורך השיפוע יוכנס לחוט.
לאחר מכן, חזור על נתיב הערך כדי להסיר את המחט. כדי לסגור את הפצע, הסר את המחזיר והשתמש בתפר נספג 6-0 כדי לחבר את שרירי הגב משני צידי הפציעה לאורך קו האמצע. ותפר משי 4-0 לסגירת העור שמעליו.
כדי לבודד את הנוירוספרות, בצע חתך בקו האמצע בעור לכל אורך הגב כדי לחשוף את קווי המתאר של השרירים ועצמות החוליות. הרם את ההיבט המדיאלי של כל עצם השכמה והשתמש במספריים כדי לחתוך את הרקמה הרכה בין עצם השכמה לחוליות. כאשר עמוד השדרה הבסיסי נחשף, הכנס את המספריים לצמצם בית החזה העליון, בעקבות עקמומיות עמוד השדרה, וחתוך את הצלעות, השרירים והאיברים הפנימיים המחוברים כדי לבודד את עמוד השדרה
הכנס את המספריים לנקב החוליה הזנבי, וחתוך את המפרקים הבין חולייתיים משני צידי הלמינות, תוך הקפדה לא לפגוע בחוט השלם. כאשר האורך המתאים של החוט נחשף, חתכו בזהירות את כל עצבי עמוד השדרה המשתרעים לרוחב מהחוט, לפני העברת רקמת חוט השדרה לצלחת פטרי של נוזל עמוד שדרה מוחי רגיל ומלאכותי על קרח. תחת מיקרוסקופ דיסקציה, חתכו את רקמת חוט השדרה כך שתכלול כשני מילימטרים של רקמה רוסטרלית וזנבית לאתר הפגיעה, והשתמשו בשני זוגות מלקחיים עדינים כדי להפריד בעדינות את החוט לשני חצאים אורכיים, לאורך הסדקים הגביים והגחוניים.
השתמש במספריים המיקרו כדי לחתוך את החומר הלבן הרוחבי הגבי הפגוע. והנח את הרקמה הפגועה בצינור חרוטי של 15 מיליליטר. החזקת מחצית מחוט השדרה עם המלקחיים, התגרות והסר את החומר הלבן הלא פגוע עם שני זוגות מלקחיים לאורך היקף הזנב הרוסטרלי של חוט השדרה, כדי לבודד את האזור הפרי-חדרי המתאים.
לאחר בידוד החומר הלבן הפגוע והאזורים הפרי-חדריים הקשורים למחצית השנייה של חוט השדרה באותו אופן, הנח את חתיכות הרקמה הפרי-חדרית לצינורות חרוטיים בודדים של 15 מיליליטר. והשתמש במספריים המיקרו כדי לטחון בעדינות את הרקמה כנגד דפנות הצינורות. לאחר השלמת הליך עיכול הרקמות, והשגת תרחיף התא הבודד, הגדר תרבית נוירוספירה על ידי הוספת 10 מיליליטר של המדיום המתאים לבקבוק תרבית רקמה אחד של 25 מיליטר לכל מצב תא.
והוסיפו את תאי הגזע העצביים המבודדים לצפיפות משובטת של 10 תאים למיקרוליטר עבור התרבית שלהם באינקובטור תרבית תאים. לאחר 24 שעות, יש לסובב בעדינות את הצלוחיות ולשפוך את התכולה לצינורות חרוטיים בודדים של 15 מיליליטר לצנטריפוגה. השעו מחדש את הכדורים במיליליטר אחד עד שניים של מדיום בסיסי עצבי טרי לספירה.
וצלחת את התאים בצפיפות שיבוט בצלחת תרבית רקמה אחת של 24 בארות לכל מצב, המכילה 500 מיקרוליטר של המדיום המתאים לתוספת מיטוגן לכל באר. לאחר מכן, גדלו את הנוירוספרות בחממת תרבית התאים למשך שבעה ימים. חמישה ימים לאחר הפגיעה המינימלית בחוט השדרה, המספרים המוחלטים של נוירוספרות שמקורן בתאי גזע עצביים סופיים גדולים ממספר הנוירוספירות הפרימיטיביות שמקורן בתאי גזע עצביים.
נוירוספרות סופיות מציגות קוטר גדול יותר ומרכז כהה גדול. בעוד שנוירוספרות פרימיטיביות קטנות יותר בגודלן ודחוסות יותר. פגיעה מינימלית בחוט השדרה גורמת לעלייה משמעותית בנוירוספרות הצומחות מהתעלה המרכזית ברמת הפגיעה, בהשוואה לעלייה צנועה יחסית בתעלה המרכזית, רוסטרל לרמת הפגיעה.
נוירוספרות סופיות יכולות להיווצר גם מהחומר הלבן הנגוע ברמת הפגיעה. אזור שאינו מכיל תאים היוצרים נוירוספרה בבעלי חיים למינקטומיה בלבד. עלייה דומה בתאי גזע עצביים פרימיטיביים נצפתה לאחר פגיעה, למעט נוירוספרות פרימיטיביות בחומר הלבן ברמת אתר הנגע.
לאחר השליטה, ניתן לבצע את הטכניקה הכירורגית תוך פחות מ-40 דקות. וניתן לבצע את כריתת הרקמות ובידוד הרקמות תוך פחות מ-30 דקות, אם מבוצעים כראוי. לאחר ההליך הכירורגי, בהתאם לזן החיה, ניתן להשתמש במתודולוגיות נוספות כגון אימונוהיסטוכימיה והלם ליניאט, כדי לענות על שאלות נוספות כגון קינטיקה של התפשטות, וגורל עצמי של תאי המבשר העצביים לאחר פציעה.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש בבדיקת הנוירוספירה כדי להעריך את הפעלת תאי הגזע העצביים, לאחר פגיעה בחוט השדרה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג מודל מינימלי של פגיעה בחוט השדרה בעכברים בוגרים, השומר על התעלה המרכזית, שבה שוכנות תאי גזע עצביים (NSCs) אנדוגניים. השפעת הפגיעה בחוט השדרה על התנהגותם של תאי אב עצביים נבחנת באמצעות בדיקת נוירוספירות (neurosphere assay), המאפשרת כימות של הפעלת תאי ה-NSC והגירתם בעקבות הפגיעה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- נוירו-רגנרציה
- ביולוגיה של תאי גזע
רקע
- הבנת האופן שבו פגיעה בחבל השדרה משפיעה על תאי מקור עצביים היא קריטית עבור הרפואה הרגנרטיבית.
- תאי NSC אנדוגניים ממלאים תפקיד חיוני בהחלמה ובהחדש potenciales של חבל השדרה.
- כימות הדינמיקה של תאי NSC לאחר פגיעה עשוי להוביל לתובנות לגבי אסטרטגיות טיפוליות.
- בדיקת הנוירוספירה (neurosphere assay) היא כלי קריטי להערכת האקטיבציה והנדידה של תאי NSC.
מטרת המחקר
- להעריך את ההשפעה של פגיעה בחוט השדרה על התנהגות והפעלה של NSC.
- לספק שיטה שיכולה לסייע בבירור התפקידים המורכבים של NSC בתגובה לפגיעה.
- לשפר את הדיוק של הליכים כירורגיים ושל נתיחות הקשורים למודלים של פגיעה בחוט השדרה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- המחקר השתמש במודל של פגיעה בחבל השדרה בעכברים בוגרים.
- תואר הליך כירורגי מפורט ליצירת פגיעה מינימלית תוך שימור נישות של NSC.
- הוקמו תרביתי נוירוספירה כדי להעריך את פעילות ה-NSC לאחר הפגיעה.
- הודגשו שלבים פרוצדורליים מרכזיים עבור הרדמה, הכנת העור, חתך והרחקה.
- ביצועו של בידוד חבל השדרה ודיסקציה של הרקמה בוצעו כדי להקל על ניתוחים המשכיים.
תוצאות עיקריות
- הממצאים הדגימו שינויים בהתנהגות של NSC בעקבות פגיעה בחוט השדרה.
- כימות הצביע על הפעלה ונדידה מדידות של NSC לאחר הפגיעה.
- הפרוצדורות המתוארות מציעות גישה מהימנה להערכת הפוטנציאל הרגנרטיבי של NSC.
- מהתוצאות הופקו מסקנות חשובות לגבי תפקידם של NSC אנדוגניים ברגנרציה.
מסקנות
- מחקר זה מספק מסגרת לבדיקת תגובות של NSC לפגיעה בחוט השדרה.
- הטכניקות המתוארות רלוונטיות להבנת מנגנונים עצביים וגישות טיפוליות פוטנציאליות.
- בסופו של דבר, התובנות שיירכשו עשויות להוביל לאסטרטגיות עתידיות ברפואה רגנרטיבית המכוונות להחלמה של חוט השדרה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
בדיקת נוירוספירות (neurosphere assay) זו מאפשרת לחוקרי ביו-פארמה לכמת את הפעלתם ונדידתם של תאי גזע עצביים אנדוגניים בעקבות פגיעה מינימלית בחוט השדרה, ובכך מספקת מערכת רלוונטית למחלה לצורך תיקוף מטרות בנורו-רגנרציה. באמצעות שימור הנישה של התעלה המרכזית, המודל תומך בהפחתת סיכונים מכניסטית של מועמדים טיפוליים שמטרתם לווסת את התנהגות ה-NSC. הבדיקה מספקת תוצאות כמותיות ברמה קלונלית, המגבירות את הביטחון החזוי בתהליכי גילוי מוקדמים המתמקדים בשיקום מערכת העצבים המרכזית (CNS).
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות על ידי מדידת שינויים, המושרים על ידי פגיעה, ביצירת נוירוספירות המופקות מתאי גזע עצביים פרימיטיביים ודפיניטיביים.
- ערך תפעולי: מאפשר תיקוף פונקציונלי של אוכלוסיות NSC כמטרות לתרופות באמצעות תרבית נוירוספירות עם בקרה על צפיפות קלונית.
- ערך ניבוי: תומך במיון תיקי פיתוח על ידי כימות הפעלת NSC כסמן ביולוגי למודולציה של מסלולים in vivo.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מכין רקמה מאושרת מהאזור הפריוונטריקולרי (periventricular) ומאתר הפגיעה לצורך סריקת תרכובות בהמשך, תוך שימוש ביצירת נוירוספרים (neurospheres) כמדד תפקודי.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של תנאי בידוד ותרבית של תאי גזע עצביים (NSC) להבטחת הדירות בין תנאי ניסוי ונקודות זמן שונות.
- יכולת הרחבה: מאפשרת השוואה מקבילית של תגובות NSC ממחיצות אנטומיות נפרדות (האזור הפריוונטריקולרי לעומת נגע בחומר לבן).
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מדגים נדידה של NSC מהנישה הפריוונטריקולרית לאתר הפגיעה, ובכך תומך במידול רלוונטי למחלה של מנגנוני תיקון אנדוגניים.
- ערך תפעולי: מספק זרימת עבודה רציפה ממניפולציה in vivo להערכה תפקודית in vitro, המאפשרת מעקב אורך של דינמיקת NSC.
- המשכיות תרגומית: מקשר בין מודלים של פגיעה in vivo לבדיקות תפקודיות ex vivo, ובכך מקל על תיקוף פרה-קליני המותאם לסממנים ביולוגיים.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
הבדיקה משתלבת ברצף הגילוי על ידי מתן אפשרות לבדיקת היפותזות של תרכובים המשפיעים על NSC, כאשר תוצרי נוירוספירות כמותיים מסייעים בזיהוי תרכובים מובילים ובקבלת החלטות לגבי קידום לשלב הפרה-קליני.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בהבהרת מסלולים ביולוגיים על ידי מדידת הפעלת NSC כמדד תפקודי של שסורב פגיעה.
- סינון (Screening): מספקת יצירת נוירוספירות (neurospheres) מדידה כמותית ומוכנה לבדיקה לצורך הערכת תרכובות במחקרי מודולציה של NSC.
- אנליטיקה: מספקת ספירות של נוירוספירות המבוססות על צפיפות קלונית ונתונים מורפומטריים (גודל, כהות) להשוואת תגובות של אוכלוסיות NSC.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין נדידת NSC in vivo לבין יצירת נוירוספירות in vitro מאתרי פגיעה, ובכך תומכת ברציפות פרה-קלינית.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה לשימוש חוזר להערכת הפעלת NSC במודלים מרובים של פגיעה ובהתערבויות טיפוליות.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: ביטחון ניבוי בתיקוף המטרה באמצעות כימות של הפעלה ונדידה של NSC.
- ערך תפעולי: פירוק רקמה סטנדרטי והשתלה קלונלית מבטיחים יצירה שחזירה של נוירוספירות בין מעבדות שונות.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מסוג go/no-go בהתבסס על ספי סף של תגובה של NSC, ובכך מפחית סיכון ביולוגי בתוכניות CNS.
- השפעה על הפורטפוליו: תעדוף מועמדים מותאם סיכון בהתבסס על שינויים תלויי-מינון במספר ובגודל הנוירוספירות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטכניקות מיקרו-כירורגיות של חוט השדרה ובניתוח סטרילי של רקמות תחת מיקרוסקופ.
- תלוי במכשור מדויק, כולל מספריים מיקרוסקופיים, פינצטות וייצוב סטריאוטקטי, לצורך יצירת מודל פגיעה עקבי.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של תנאי תרבית הנוירוספירות (מצע, צפיפות, אינקובציה) לקבלת תוצאות הדירות.
- כולל שיקולי התאמה בעת יישום הבדיקה על זני מכרסמים שונים או על דרגות חומרה שונות של הפגיעה.
- מוגבל על ידי עקומת הלמידה הטכנית הקשורה לחשיפת חוט השדרה ולבידוד רקמה פריוונטריקולרית.
