הכנת סיליקה פונקציונלי באמצעות שיטת Bioinspired

היתרונות העיקריים של שיטה זו הם שהיא מהירה, קלה, ידידותית לסביבה ומאפשרת התאמת חומרים. שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי אופן היווצרות סיליקה בהשראה ביולוגית, הדרכים הזמינות לשילוב ביומולקולות וטיפול בחומרים פוסט-סינתטיים. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שהיווצרות הסיליקה מהירה ויש להוסיף כמות מסוימת של חומצה במהירות על מנת להשיג את התוצאות האופטימליות.

הרעיון של השיטה הזו עלה לנו לראשונה כשהבנו עד כמה היא קלה, כך שהתנאים תואמים לאנזימים. חשבנו להשתמש בשיטה זו כדי לשפר את ביצועי האנזים ויציבותם. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון ששלב נטרול החומצה הוא החשוב ביותר לתכונות החומר הסופיות.

ראשית, שקלו 318.2 מיליגרם של נתרן סיליקט פנטהידרט למיכל פלסטיק של 180 מיליליטר והמיסו ב-20 מיליליטר מים נטולי יונים. במיכל שני, שקלו 58.1 מיליגרם של פנטאתילן הקסין או PEHA והמיסו ב -20 מיליליטר מים נטולי יונים. הפחיתו כמות מים זו מנפח המים נטולי היונים שישמשו לפירוק נתרן סיליקט פנטהידרט.

כדי לבצע אנקפסולציה באתרה במהלך הסינתזה, יש להמיס מסה קבועה מראש של חלבון בחמישה מיליליטר מים דה-יונים ולהניח את התמיסה במקרר לפירוק מוחלט. בדוק מדי פעם את התקדמות הפירוק, רצוי ללא ערבוב. שלב את תמיסות הנתרן סיליקט פנטהידראט ו-PEHA באחד המיכלים והוסף מספיק מים נטולי יונים כדי להפוך את נפח התמיסה הסופי ל-41.5 מיליליטר.

הניחו את התערובת הטרייה שהוכנה על גבי צלחת ערבוב והוסיפו מוט ערבוב כדי לספק ערבוב עקבי. לאחר מכן, השעו בדיקת pH בתמיסת הערבוב ורשמו את ה-pH הראשוני. התחל את הסינתזה על ידי הוספת כמות קבועה מראש של חומצה הידרוכלורית חד טוחנת וצפה בהתפתחות המיידית של העכירות.

השלב הקריטי הראשון הוא הוספה מהירה של חומצה כדי להתחיל היווצרות סיליקה. יש להוריד את ה-pH לשבע מהר ככל האפשר. אם מתרחשת אנקפסולציה, הוסף את תמיסת האנקפסולנט ברגע שתוספת החומצה הושלמה.

לאחר מכן רשום את ה-pH לאחר חמש דקות כדי לקבוע את השלמת התגובה. לאחר שהתגובה הגיעה לסיום, שנה את הרכב הסיליקה המיוצרת על ידי הוספת חומצה הידרוכלורית נוספת לתערובת עד להגעה ל-pH הרצוי בין שתיים לשבע ואפשר לתרחיף להתייצב למשך כדקה אחת. לאחר מכן, שפכו את תרחיף הסיליקה בהשראה ביולוגית לצינורות צנטריפוגה של 50 מיליליטר, ולאחר מכן צנטריפוגה את המתלה ב-5,000 גרם למשך 15 דקות.

לאחר הצנטריפוגה, הסר את הסופרנטנט ואחסן להמשך ניתוח. מלאו מחדש את צינורות הצנטריפוגה במים נטולי יונים והשעו מחדש את הסיליקה באמצעות מערבל מערבולת. במקרה של שילוב ביומולקולות, צעד קריטי הוא לתת את הסופרנטנטים משטיפת סיליקה בהשראה ביולוגית על מנת לעבור ניתוח נוסף.

לאחר חזרה על שלבי הצנטריפוגה וההשעיה פעמיים, הסר את הסופרנטנט וגרד את הסיליקה לכור היתוך קרמי. מייבשים את הסיליקה בתנור למשך הלילה בחום של 85 מעלות צלזיוס. בבקבוקון פלסטיק של חמישה מיליליטר, יש לדלל 300 מיקרוליטר של מגיב כחול מוליבדן שהוכן בעבר בשלושה מיליליטר מים נטולי יונים.

לאחר מכן, הוסיפו 10 מיקרוליטר של תמיסת בדיקת חומצה סליצית ונערו לתערובת. לאחר 15 דקות, הוסף 1.6 מיליליטר של חומר מפחית פרה-אמינופנול סולפט שהוכן בעבר כדי להפחית את קומפלקס הסיליקומוליבדט הצהוב לאיזומר הכחול שלו. לאחר מכן, מדוד את ספיגת הדגימה ב-810 ננומטר בספקטרופוטומטר UV-vis וחשב את ריכוז הסיליקון כנגד עקומת כיול.

בעזרת קצות פיפטה חד פעמיים, הוסף כמות קבועה מראש של מגיב ברדפורד ודגימה בכל קובטה שהוקצתה. מערבבים כל קובטה על ידי היפוך שלוש פעמים ומניחים להתפתח למשך 10 דקות. לאחר מכן, מדדו את הספיגה ב-595 ננומטר באמצעות סופרנטנט טהור כריק.

חשב את הספיגה המקורית של כל קובטה על ידי הפחתת ספיגת דגימת הבקרה מכל מדידה. כעת, צור עקומת כיול עבור כל קבוצת ניסויים על ידי התוויית ספיגה נמדדת מול ריכוז BSA כדי למנוע תנודות אקראיות שעלולות להשפיע על רגישות הבדיקה. לבסוף, קבע את תכולת החלבון עבור כל דגימה במהלך ההשעיה מחדש כדי לעקוב אחר אובדן חלבון אפשרי.

התשואה של התגובה היוצרת סיליקה היא בדרך כלל 58 פלוס מינוס 6.5%השיטה הספקטרוסקופית הכחולה של מוליבדן זיהתה את כמות מיני הסיליקט המונומרי שלא הגיבו, כמו גם את אותם מינים שהגיבו ליצירת פוליסיליקטים או אוליגומרים אך לא הצליחו להגיע לגודל מספיק כדי להיקרש. לאחר השלמת הקרישה, ניתן לשנות בקלות את משטחי החומר באמצעות פליטת חומצה המאפשרת כוונון עדין של תכונות החומר כגון הרכב, נקבוביות ופעילות כימית של תוסף. כ-50% מה-BSA זוהה בסופרנטנט לאחר הצנטריפוגה הראשונה, המתייחסת ליעילות אימוביליזציה של 50%.

מכיוון שלא זוהה BSA בשטיפות הבאות, ניתן היה לעטוף את BSA בצורה מאובטחת במהלך הסינתזה ללא שטיפה. ספקטרום ה-FTIR של הסיליקה הראה רצועות אמיד אופייניות בדגימות עם BSA אך לא בדגימות הבקרה. כאשר BSA נוסף לריאגנטים שלא הגיבו, לא היו הבדלים ניכרים ביעילות הקיבוע או בכמות ה-BSA בקומפוזיט שהתקבל.

כאשר BSA נוסף במהלך היווצרות הסיליקה, יעילות הקיבוע וכמות ה-BSA במוצר היו נמוכות משמעותית. לאחר שליטה בטכניקה זו ניתן לבצע תוך פחות מחמש דקות אם היא מבוצעת כראוי. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להיות מדויק עם משקלים ונפחים של מגיבים ולהוסיף במהירות את החומצה במינון אחד.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו FTIR, SCM, פורוסימטריה ובדיקות אנזימים על מנת לענות על שאלות נוספות לגבי תכונות החומר והמורפולוגיה וכן על פעילות הביו-מולקולות. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום היווצרות סיליקה בהשראה ביולוגית לחקור שיטה מהירה, קלה, ניתנת לשליטה וידידותית לסביבה לסינתזה של סיליקה עם יכולת קפסולציה באתרה של ביומולקולות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לסנתז סיליקה בשיטה בהשראה ביולוגית, לעטוף ביומולקולות באתרן, למדוד את יעילות האנקפסולציה ולבצע פליטה פוסט-סינתטית של התוספים.

אל תשכח שעבודה עם אמינים, חומצות, ביומולקולות עלולה להיות מסוכנת ביותר ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון PPE ומניעת שפיכה בעת ביצוע הליך זה.