Name: הערכת תפקידה של פונקציית מיטוכונדריאלי עייפות הקשורים לסרטן (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: חקור הערכת תפקוד מיטוכונדריאלי בחולי סרטן הסובלים מעייפות באמצעות פליטת דם וניתוח תאי דם לבנים. שיטה זו מאפשרת זיהוי מוקדם של חולים בסיכון לתופעות לוואי מטיפולים אונקולוגיים ומשפרת את הטיפול התומך.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

מחקר זה נתמך באופן מלא על ידי חלוקה של מגזר המחקר של במכון הלאומי סיעוד למחקר של NIH, בת'סדה, מרילנד.

המחקר הנוכחי (NCT00852111) אושרה על-ידי המוסדיים סקירה לוח (IRB) של במכון הלאומי של בריאות (NIH), בת'סדה, מרילנד. המשתתפים שהשתתפו במחקר זה היו גברים euthymic, 18 שנה ומעלה, אשר אובחנו עם סרטן הערמונית-גרורתי עם או בלי prostatectomy מוקדמת, היו אמורים לקבל טיפול קרינתי חיצוני קרן (EBRT). המשתתפים הפוטנציאליים שוחררנו אם היה להם מחלה פרוגרסיבית אשר עלול לגרום עייפות משמעותית, היה מחלה פסיכיאטרית מתוך חמש השנים האחרונות, היו שלא תוקנו בלוטת התריס או אנמיה, או היה גידול ממאיר השני. יחידים אשר השתמשו בכדורי שינה, סטרואידים או סוכנים אנטי דלקתיות לא סטרואידיות היו גם לא נכלל. דגימות דם בקרה בריאים התקבלו לרפואה NIH המחלקה של עירוי דם מתורמים בריאים תחת פרוטוקול שאושרו על-ידי IRB (NCT00001846). כל המשתתפים הם גייסו מגנוסון קלינית במרכז המחקר ב- NIH. ההסכמות מידיעה בכתב חתום התקבלו לפני ההשתתפות במחקר.
1. מיטוכונדריאלי פונקציה מדידה הכנה (יום 1 של הניסוי)
<ol><li>מימה חיישן מחסנית (ראה טבלה של חומרים; משך משוער: 5 דקות).<ol>
<li>הסר את חיישן מחסנית של החבילה. להוסיף 200 μL Calibrant פתרון לבאר כל צלחת השירות ולאחר מכן למלא כל חפיר עם פתרון Calibrant μL 400.</li>
		<li>לחזור חיישן צלחת הצלחת השירות, עכשיו שיש פתרון Calibrant בו. מימה את המחסנית חממה 37 ° C-CO2 בן לילה. הערה: חיישן מחסנית צריך להיות להתייבש מינימום של 4 שעות, לכל היותר 72 h.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. הכנת הדוגמא קלינית (יום 2 של הניסוי)
<ol><li>למדוד עייפות בעזרת 13-פריט פונקציונאלי הערכה של כרונית מחלות הטיפול - עייפות (FACIT-F)2,23,24 -בסיסית (לפני EBRT חניכה), נקודת האמצע והשלמה של EBRT ולאחר שנה אחת פוסט-EBRT.<ol>
<li>להשתמש 0 - מידה 4 עבור כל פריט תגובה, כאשר 0 מייצג "". בכלל לא- ו 4 מציין כי המשיב מתייחס המשפט המתאים "תודה רבה" הציונים הכלליים צריך לנוע בין 16-53, עם ציונים נמוכים המשקף בעוצמה גבוהה עייפות.</li>
		<li>להגדיר עייפות כמו ציון FACIT-F נמוך יותר 43, עם ציון FACIT-F של ≥43 המציין היעדר או עייפות לא-משמעותיים קלינית2. הערה: ציון FACIT-F של 43 הטוב ביותר מחלק ציונים עייפות של חולי סרטן, את האוכלוסייה הכללית2.</li>
		<li>כוללים את הפריטים הבאים 13 בסולם עייפות FACIT: 1) אני מרגיש עייף; 2). אני מרגישה חלשה בכל מקום; 3) אני מרגישה תשושה ("נשטף החוצה"); 4) אני מרגיש עייף; 5) אני מתקשה מתחיל דברים כי אני עייפה; 6) אני מתקשה לסיים דברים כי אני עייפה; 7) יש לי אנרגיה; 8). אני מסוגל לעשות פעילויות הרגיל שלי; 9) אני צריכה לישון במהלך היום; 10). אני עייפה מדי לאכול; 11) אני צריך עזרה עושה פעילויות הרגיל שלי; 12) אני אני מתוסכל בגלל היותו עייף מדי כדי לעשות את הדברים שאני רוצה לעשות; ו 13) אני צריך להגביל את פעילות חברתית כי אני עייפה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לבודד PBMC של דגימות דם טרי שנאספו (משך משוער: 1 h).<ol>
<li>לאסוף 8 מ של דם לתוך צינור הכנה תאי תאי (ראה טבלה של חומרים). הערה: דגימות דם צריך להיות מעובד בתוך שעתיים של אוסף. עלולה לסכן את איכות PBMCs אם דגימות דם מעובדים יותר מ 2 h לאחר איסוף הדגימה.</li>
		<li>צנטריפוגה ב g x 1,750 למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (18-25 ° C). להעביר את השכבה מעונן צינור חרוטי 15 מ"ל. להוסיף עד 15 מ"ל ל- PBS, היפוך 5 פעמים.</li>
		<li>צנטריפוגה ב 300 x g במשך 15 דקות ב 4 º C. בזהירות להסיר ולמחוק את תגובת שיקוע ללא גלולה מטרידה. מחדש להשעות את צניפה על-ידי הוספת עד 10 מ"ל PBS, היפוך 5 פעמים.</li>
		<li>צנטריפוגה-300 גרם x 10 דקות ב 4 º C. למחוק את הנוזל supernatant והשהה מחדש תאים 1 מ"ל PBS. להעביר את PBMCs צינור microfuge 1.5 mL.</li>
		<li>צנטריפוגה ב 610 x g במשך 10 דקות. להסיר את תגובת שיקוע ובזהירות resuspend צנפה ב RPMI מלאה-1640 (RPMI-1640 בתוספת 10% FBS, 10 מ מ פניצילין/סטרפטומיצין).</li>
	</ol>
</li>
	<li>מעיל תא לוחות עבור תאים שאינם מחסידי (משך משוער: 30 דקות).<ol>
<li>להכין פתרון דבק תאים ורקמות (ראה טבלה של חומרים) על ידי דילול הפתרון מניות ב- 0.1 M סודיום ביקרבונט pH 8.0. הפתרון עובד צריך להיות μg/cm 3.52 של פני השטח. הערה: פתרון זה מכיל חלבונים polyphenolic מופק גברת ימיים, Mytilus אדאליס. חלבונים אלה הם רכיבי מפתח של הדבק מופרש על ידי גברת לעגן את עצמה משטחים. אנו מוצאים כי התא-טאק עובד הכי טוב עם PBMCs.</li>
		<li>להוסיף 100 μL של הפתרון מדולל דבק מכל קידוח, תקופת דגירה של פחות 20 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף שלוש פעמים עם די מים ואוויר יבש.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. מיטוכונדריאלי פונקציה מדידה
<ol><li>הכנת Assay מדיה (משך משוער: 10 דקות). הערה: המדיה Assay צריך להיות טרי מוכן ביום של הניסוי.<ol>
<li>הוסף-גלוטמין פירובט, גלוקוז לבסיס המדיה (באותו המרכיבים כמו בינוני (DMEM ששינה הנשר של Dulbecco), אך ללא כל סודיום ביקרבונט, גלוקוז, גלוטמין או נתרן פירובט) כדי להפוך assay מדיה. לחמם מדיה 37 מעלות, ואז להתאים את ה-pH ל 7.4. הערה: ריכוזי-גלוטמין פירובט, גלוקוז בדרך כלל זהה ריכוזים בתקשורת הצמיחה רגילה, אך ניתן להתאים בהתאם וזמינותו.</li>
	</ol>
</li>
	<li>היכונו PBMCs במבחן Mito הלחץ (משך משוער: 2 h).<ol>
<li>צלחת מספיק PBMCs משלב 2 כל טוב להגיע confluency 80-90%. מניסיוננו, 1.5 x 105 תאים/טוב הניבו את התוצאות הכי עקבי. הערה: בארות A ו- H רקע בארות, צריך להכיל רק assay מדיה עם אין תאים. בבארות B ל גרם, אנו ממליצים על ציפוי לפחות 3-6 בארות לאדם החולה מדגם כהתאמה ליניאריים.</li>
		<li>מסובבת צלחות למטה ב g x 200 למשך 2 דקות לאפשר תאים לדבוק בתחתית הבארות. לשטוף את התאים פעם אחת עם התקשורת וזמינותו. שלב זה מסיר סרום, סודיום ביקרבונט מהתקשורת צמיחה. הערה: מניסיוננו, הצעד כביסה בדרך כלל מסירה 20-30% של תאים.</li>
		<li>להוסיף 180 μL Assay מדיה לתוך כל טוב, כולל רקע בארות א' וה' Incubate חממה 37 ° C-CO2 למשך 45-60 דקות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הבדיקה מתח Mito<ol>
<li>לשקם סמים בערכה מתח Mito עם מדיה assay כדלקמן:<ol>
<li>Oligomycin: להוסיף 252 μL assay מדיה לתוך המבחנה כדי ליצור פתרון מניות ב- 50 μM.</li>
			<li>FCCP: להוסיף 288 μL assay מדיה לתוך הבקבוקון כדי ליצור פתרון מניות ב- 50 μM.</li>
			<li>Antimycin A / Rotenone: להוסיף 216 μL של המדיה assay לתוך המבחנה כדי ליצור פתרון מניות ב 25 μM.</li>
		</ol>
</li>
		<li>מערבולת מחדש סמים כדקה בערך. לדלל לתוך העבודה פתרונות. הערה: ריכוזים של פתרונות עבודה צריך להיות טיטרציה וקבעה מראש לפני הניסוי בהתאם לסוג התא. עבור PBMCs, אנו מוצאים את μM 1 של Oligomycin 1 μM FCCP, 0.5 μM antimycin A / Rotenone פועלות באופן הטוב ביותר.</li>
		<li>Pipette הסמים ליציאת כל במחסנית חיישן ברצף:<ol>
<li>ת: יציאה μL 20 פיפטה של 10 μM Oligomycin, עבור ריכוז סופי כל היטב של 1 μM.</li>
			<li>יציאה b: μL 22 פיפטה של 10 μM FCCP, עבור ריכוז סופי כל היטב של 1 μM.</li>
			<li>C: יציאה μL 25 פיפטה של μM 5 antimycin A / rotenone עבור ריכוז סופי כל היטב של 0.5 μM.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>בחר "בדיקת המאמץ Mito" על כלי שטף חוץ-תאית. בצע כלי שורת, הכנס את מיכל הדיו חיישן. הכלי יבצע באופן אוטומטי חיישן כיול. הוסף תאים בצלחת לאחר כיול חיישן, לבין הכלי יסיים את שאר וזמינותו. דינמיקה חמצן נמדד ב- 530 ננומטר (עירור) / 650nm (פליטת), פרוטון הריכוז נמדדת ב- 470 nm (עירור) / 530 ננומטר (פליטה).</li>
</ol>4. נרמול נתונים פונקציה מיטוכונדריאלי
<ol><li>להכין פתרון תא התפשטות Assay (משך משוער: 5 דקות).<ol>
<li>להוסיף 48 μL חומצת גרעין הכתם (500 x) משתיק קול רקע 240 μL מ"ל 11.7 PBS (2x). חומצת גרעין הכתם הוא צבע DNA מחייב תא-permeant, משתיק קול רקע צבע המסיכה אשר חוסם תאים מתים או תאים עם קרום התא פרוץ שלמות של להיות מוכתם. שילוב לצבוע דנ א מחייב עם משתיק קול על רקע מבטיחה כי תאים חיים רק מוכתמים.</li>
		<li>להוסיף נפח שווה 2 x הפתרון עובד (180 μL) ישירות לתוך המדיום היטב כל לאחר השלמת במבחן הלחץ Mito.</li>
	</ol>
</li>
	<li>דגירה התאים בנוכחות תא התפשטות assay פתרון חממה 37 מעלות צלזיוס במשך 45-60 דק Quantify מספר תאים חיים (פלורסנט) על קורא צלחת-508 nm (עירור) / 527 nm (פליטת), באופן שיטתי נתונים OCR (משך משוער: 10 דקות) . הערה: בנוסף תאים חיים, מספר המשתמשים לבחור גם לנרמל את הנתונים שלהם עם המספר הכולל של תאים, כמות חומצת גרעין, ריכוז חלבון, וכו '.</li>
</ol>

<ol><li>Berger, A. M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26285247">Cancer-Related Fatigue, Version 2.2015.</a> Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 13 (8), 1012-1039 (2015).</li>
<li>Feng, L. R., Dickinson, K., Kline, N., Saligan, L. N. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27521284">Different phenotyping approaches lead to dissimilar biologic profiles in men with chronic fatigue following radiation therapy.</a> Journal of Pain and Symptom Management. 52 (6), 832-840 (2016).</li>
<li>Feng, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+Predictors+of+Fatigue+in+Men+With+Non-Metastatic+Prostate+Cancer+Receiving+External+Beam+Radiation+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Journal+of+Oncology+Nursing%22%5BJournal%5D)">Clinical Predictors of Fatigue in Men With Non-Metastatic Prostate Cancer Receiving External Beam Radiation Therapy.</a> Clinical Journal of Oncology Nursing. 19 (6), 744-750 (2015).</li>
<li>Feng, L. R., Wolff, B. S., Lukkahatai, N., Espina, A., Saligan, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploratory+Investigation+of+Early+Biomarkers+for+Chronic+Fatigue+in+Prostate+Cancer+Patients+Following+Radiation+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Nursing%22%5BJournal%5D)">Exploratory Investigation of Early Biomarkers for Chronic Fatigue in Prostate Cancer Patients Following Radiation Therapy.</a> Cancer Nursing. 40 (3), 184-193 (2017).</li>
<li>Myhill, S., Booth, N. E., McLaren-Howard, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19436827">Chronic fatigue syndrome and mitochondrial dysfunction.</a> International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 2 (1), 1-16 (2009).</li>
<li>Pernas, L., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mito-Morphosis%3A+Mitochondrial+Fusion%2C+Fission%2C+and+Cristae+Remodeling+as+Key+Mediators+of+Cellular+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mito-Morphosis: Mitochondrial Fusion, Fission, and Cristae Remodeling as Key Mediators of Cellular Function.</a> Annual Review of Physiology. 78 (1), 505-531 (2016).</li>
<li>Vecchiet, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+characterization+of+somatic+parietal+tissues+in+humans+with+chronic+fatigue+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Sensory characterization of somatic parietal tissues in humans with chronic fatigue syndrome.</a> Neuroscience Letters. 208 (2), 117-120 (1996).</li>
<li>Jones, D. E. J., Hollingsworth, K. G., Taylor, R., Blamire, A. M., Newton, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormalities+in+pH+handling+by+peripheral+muscle+and+potential+regulation+by+the+autonomic+nervous+system+in+chronic+fatigue+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Internal+Medicine%22%5BJournal%5D)">Abnormalities in pH handling by peripheral muscle and potential regulation by the autonomic nervous system in chronic fatigue syndrome.</a> Journal of Internal Medicine. 267 (4), 394-401 (2010).</li>
<li>Feng, L. R., Suy, S., Collins, S. P., Saligan, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+TRAIL+in+fatigue+induced+by+repeated+stress+from+radiotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Psychiatric+Research%22%5BJournal%5D)">The role of TRAIL in fatigue induced by repeated stress from radiotherapy.</a> Journal of Psychiatric Research. 91, 130-138 (2017).</li>
<li>Karamercan, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+peripheral+blood+mononuclear+cells+be+used+as+a+proxy+for+mitochondrial+dysfunction+in+vital+organs+during+hemorrhagic+shock+and+resuscitation%5BTitle%5D)+AND+%22Shock%22%5BJournal%5D)">Can peripheral blood mononuclear cells be used as a proxy for mitochondrial dysfunction in vital organs during hemorrhagic shock and resuscitation.</a> Shock. 40 (6), (2013).</li>
<li>Ijsselmuiden, A. J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+white+blood+cells+and+platelets+amplify+oxidative+stress+in+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Clinical+Practice+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Circulating white blood cells and platelets amplify oxidative stress in heart failure.</a> Nature Clinical Practice Cardiovascular Medicine. 5, 811(2008).</li>
<li>Kong, C. -W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+mitochondrial+alterations+after+cardiac+surgery+involving+cardiopulmonary+bypass%3A+Clinical+correlations%5BTitle%5D)+AND+%22Shock%22%5BJournal%5D)">Leukocyte mitochondrial alterations after cardiac surgery involving cardiopulmonary bypass: Clinical correlations.</a> Shock. 21 (4), 315-319 (2004).</li>
<li>Straub, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+brain+and+immune+system+prompt+energy+shortage+in+chronic+inflammation+and+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">The brain and immune system prompt energy shortage in chronic inflammation and ageing.</a> Nature Reviews Rheumatology. 13, 743(2017).</li>
<li>Kuhnke, A., Burmester, G., Krauss, S., Buttgereit, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetics+of+immune+cells+to+assess+rheumatic+disease+activity+and+efficacy+of+glucocorticoid+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+Rheumatic+Diseases%22%5BJournal%5D)">Bioenergetics of immune cells to assess rheumatic disease activity and efficacy of glucocorticoid treatment.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 62 (2), 133-139 (2003).</li>
<li>Kramer, P. A., Ravi, S., Chacko, B., Johnson, M. S., Darley-Usmar, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+the+mitochondrial+and+glycolytic+metabolism+in+human+platelets+and+leukocytes%3A+Implications+for+their+use+as+bioenergetic+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">A review of the mitochondrial and glycolytic metabolism in human platelets and leukocytes: Implications for their use as bioenergetic biomarkers.</a> Redox Biology. 2, Supplement C 206-210 (2014).</li>
<li>Garrabou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Effects+of+Sepsis+on+Mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">The Effects of Sepsis on Mitochondria.</a> The Journal of Infectious Diseases. 205 (3), 392-400 (2012).</li>
<li>Mittal, M., Siddiqui, M. R., Tran, K., Reddy, S. P., Malik, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+in+inflammation+and+tissue+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species in inflammation and tissue injury.</a> Antioxidants & Redox Signaling. 20 (7), 1126-1167 (2014).</li>
<li>Adrie, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Membrane+Potential+and+Apoptosis+Peripheral+Blood+Monocytes+in+Severe+Human+Sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Membrane Potential and Apoptosis Peripheral Blood Monocytes in Severe Human Sepsis.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 164 (3), 389-395 (2001).</li>
<li>Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+protocol+to+analyze+glycolysis+and+mitochondrial+respiration+in+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An optimized protocol to analyze glycolysis and mitochondrial respiration in lymphocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54918(2016).</li>
<li>Nicholls, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+profile+experiment+using+C2C12+myoblast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (46), e2511(2010).</li>
<li>Van den Bossche, J., Baardman, J., de Winther, M. P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+characterization+of+polarized+M1+and+M2+bone+marrow-derived+macrophages+using+real-time+extracellular+flux+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Metabolic characterization of polarized M1 and M2 bone marrow-derived macrophages using real-time extracellular flux analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (105), e53424(2015).</li>
<li>Boutagy, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+isolated+mitochondria+from+minimal+quantities+of+mouse+skeletal+muscle+for+high+throughput+microplate+respiratory+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements.</a> Journal of Visualized Experiments. (104), e53216(2015).</li>
<li>Yellen, S. B., Cella, D. F., Webster, K., Blendowski, C., Kaplan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+fatigue+and+other+anemia-related+symptoms+with+the+Functional+Assessment+of+Cancer+Therapy+%28FACT%29+measurement+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pain+and+Symptom+Management%22%5BJournal%5D)">Measuring fatigue and other anemia-related symptoms with the Functional Assessment of Cancer Therapy (FACT) measurement system.</a> Journal of Pain and Symptom Management. 13 (2), 63-74 (1997).</li>
<li>Yost, K. J., Eton, D. T., Garcia, S. F., Cella, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimally+important+differences+were+estimated+for+six+Patient-Reported+Outcomes+Measurement+Information+System-Cancer+scales+in+advanced-stage+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Epidemiology%22%5BJournal%5D)">Minimally important differences were estimated for six Patient-Reported Outcomes Measurement Information System-Cancer scales in advanced-stage cancer patients.</a> Journal of Clinical Epidemiology. 64 (5), 507-516 (2011).</li>
<li>Kang, J. -G., Wang, P. -y, Hwang, P. M. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/journal/00766879/542">Methods in Enzymology</a>. Galluzzi, L., Kroemer, G. 542, Academic Press. 209-221 (2014).</li>
<li>Chacko, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+defining+distinct+bioenergetic+profiles+in+platelets%2C+lymphocytes%2C+monocytes%2C+and+neutrophils%2C+and+the+oxidative+burst+from+human+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Methods for defining distinct bioenergetic profiles in platelets, lymphocytes, monocytes, and neutrophils, and the oxidative burst from human blood.</a> Laboratory Investigation. 93 (6), 690-700 (2013).</li>
<li>Jones, L. J., Gray, M., Yue, S. T., Haugland, R. P., Singer, V. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11406155">Sensitive determination of cell number using the CyQUANT® cell proliferation assay.</a> Journal of Immunological Methods. 254 (1), 85-98 (2001).</li>
<li>Hartman, M. -L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relation+of+mitochondrial+oxygen+consumption+in+peripheral+blood+mononuclear+cells+to+vascular+function+in+type+2+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Vascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Relation of mitochondrial oxygen consumption in peripheral blood mononuclear cells to vascular function in type 2 diabetes mellitus.</a> Vascular Medicine. 19 (1), London, England. 67-74 (2014).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

עייפות אצל חולי סרטן היא מחלה מתישה אינה מוגדרת היטב או מאופיין1. אבחון של עייפות כולו מתבסס על דיווח סובייקטיבי, אין תקן הנוכחי אבחון או טיפול עבור תנאי זה, בעיקר בשל חוסר ההבנה שלו pathobiology2. מנגנוני המוצעת שבבסיס עייפות אצל חולי סרטן, ליקוי בתפקוד מיטוכונדריאלי הוא אחד המסלולים הכי רפואית targetable. לכן, פיתחנו שיטה מעשית ומהירה למדידת תפקוד מיטוכונדריאלי בדגימות קליניות יכול לשמש באופן יזום לזהות חולים בסיכון לפתח סרטן הקשורות לטיפול רעילות כולל עייפות, זה כל-כך מו...

עייפות היא מצב נפוץ ומצערת זה יש השפעה שלילית על איכות החיים של חולי סרטן1. מועד זה, סרטן נשאר גרוע מוגדר ועייפות מסתמך רק על דיווח סובייקטיבי על-ידי חולים2. לכן, יש צורך דחוף לזהות ניסוי מעבדה אבחון להתאמה בקלות לאפיין באופן אובייקטיבי עייפות3,בקביעת קליני4.
מנגנונים כבסיס מרובות, כולל תפקוד המיטוכונדריה, הוצעו כדי לגרום לעייפות5. המיטוכונדריה הם organelles תחנת כוח, מתן 95% צרכי האנרגיה התאית באמצעות זרחון חמצוני, ולשחק תפקיד חשוב סידן איתות אפופטוזיס, המערכת החיסונית איתות, ויסות תאיים אחרים איתות האירועים6 . בהתאם לכך, ביואנרגיה מיטוכונדריאלי לקוי, פגמים בייצור אנרגיה עשויים לתרום עייפות. תמיכה השערה זו, מחקרים קודמים מקיימות מוטציות ב- DNA מיטוכונדריאלי בחולים עם תסמונת התשישות הכרונית7. אמנם עדיין לא ברור אם מקור pathophysiological עייפות טמון בתוך מערכת העצבים המרכזית או רקמות היקפיים, כגון שרירי השלד8,9, יש כיום אין שיטה ישירה להעריך במדויק תפקוד לקוי של מיטוכונדריאלי הקשורים עייפות בתאים חיים, respiring.
באמצעות תאי תאי דם היקפיים (PBMCs) ללמוד פונקציה מיטוכונדריאלי מציע מספר יתרונות. ראשית, PBMCs זמינים בהגדרת קליניים באמצעות דם ורידי רגיל, ניתן לבודד במהירות באמצעות טכניקות מעבדה בסיסית. שנית, איסוף דם הוא פחות פולשניים איסוף לרקמות אחרות כגון ביופסיה של השריר. לפיכך, דגימות דם ניתן לאסוף מן המטופל אותו שוב ושוב לאורך זמן, אשר מקלה על הערכת האורך של השפעות הטיפול. מעניין, פונקציית מיטוכונדריאלי PBMCs הופיע טוב בקורלציה עם כליות מצב מיטוכונדריאלי במודל חיה10. יתר על כן, תא החיסון המיטוכונדריה שימשו כמדד לזיהוי שינויים מערכתית תחת מחלות שונות בתנאים11,12. המיטוכונדריה במחזור תאים חיסוניים הם רגישים לשינויי פונקציות החיסונית במיוחד ואת המערכת החיסונית איתות מולקולות כגון ציטוקינים13,14,15. לדוגמה, זה נצפתה PBMCs של חולים עם מחלות דלקתיות פרקים חריפה התערוכה צריכת חמצן בסיסית גבוהה14. לעומת זאת, צריכת חמצן צומצם ב PBMCs מבודדים מחולים עם התנאים דלקתית מערכתית כולל אלח דם16. תחת תנאים דלקתיים, רדיקלים חופשיים המיוצר על ידי המיטוכונדריה לקוי עשוי נוספת לתרום סטרס חמצוני גבוהות ו דלקת ממושכת17. התפקיד המרכזי של המיטוכונדריה בהפקת אנרגיה, כמו גם כמו סטרס חמצוני מציע השירות פוטנציאל של שימוש ב- function מיטוכונדריאלי כמדד ללמוד עייפות חולי סרטן 13.
מחקרים קודמים בחינת תפקוד מיטוכונדריאלי מנוצל טכניקות הביוכימי, מדידת פוטנציאל ממברנה מיטוכונדריאלי או בידוד של אוכלוסיות תאים מסוים עשוי להיות לא ברצון וישימה בקביעת קליני5, 14,18. בשנים האחרונות, ההתפתחות של מבחני חוץ-תאית השטף איפשר לחוקרים בקלות ולבחון באופן מדויק שינויי קצב צריכת החמצן (OCR) בתגובה זריקות אוטומטיות של מעכבי נשימה19,20 , 21 , 22. עם זאת, רוב המחקרים הללו תוכננו עבור סוגי תאים ספציפיים ולא בפורמט גדול תפוקה גבוהה ניתן החלים בסביבה קלינית. כתב יד זה, אנו מתארים פרוטוקול ממוטבת לבחינת תפקוד מיטוכונדריאלי לשימוש קליני.

<table><tbody><tr><td>צינור הכנת תאים חד-גרעיניים CPT&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>362761</td><td>לבידוד PBMCs לאחר פלבוטומיה</td></tr><tr><td>RPMI-1640&nbsp;</td><td>קורנינג</td><td>10-040</td><td>להכנת אמצעי גידול עבור PBMCs</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>קורנינג</td><td>35-010-CV</td><td>להכנת אמצעי גידול עבור PBMCs</td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>ThermoFisher</td><td>15140122</td><td>להכנת אמצעי גידול עבור PBMCs</td></tr><tr><td>Cell-Tak</td><td>Corning</td><td>354240</td><td>תמיסת דבק תאים ורקמות; מאפשר לתאי השעיה להיצמד למשטח</td></tr><tr><td>Seahorse XF Calibrant Solution</td><td>Agilent</td><td>103059-000</td><td>להוספת לחות מחסניות</td></tr><tr><td>XFp Fluxpak (מיני-פלטות ומחסניות חיישנים)</td> <td>Agilent</td><td>103022-100</td><td>מכיל מיני-פלטות תרבית תאים XFp ומחסניות חיישנים</td>מדיה</tr><tr><td>בסיסית XF</td><td>Agilent</td><td>103335-100</td><td>להכנת מדיית בדיקת XF</td></tr><tr><td>45% תרבית תאים D-(+)-תמיסת גלוקוז</td><td>קורנינג</td><td>25-037-CI</td><td>להכנת XF מדיית בדיקה</td></tr><tr><td>תמיסת נתרן פירובט</td><td>קורנינג&nbsp;</td><td>25-000-CI</td><td>להכנת מדיית בדיקת XF</td></tr><tr><td>תמיסת L-גלוטמין</td><td>ThermoFisher</td><td>25030081</td><td>להכנת מדיה בדיקת XF</td></tr><tr><td>סוסון ים XFp Mito ערכת בדיקת מתח</td><td>Agilent</td><td>103010-100</td><td>מכיל אוליגומיצין, FCCP, אנטימיצין A/רוטנון</td></tr><tr><td>CyQUANT Direct Cell Proliferation Assay</td><td>ThermoFisher</td><td>C35011</td><td>לכימות תאים חיים ונורמליזציה</td></tr> <tr><td>של נתוניםSeahorse XFp</td><td>Analyzer Agilent</td><td>S7802AEA</td><td>למדידת תפקוד המיטוכונדריה בתאים חיים</td></tr><tr><td>Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (או כל מכשיר שיכול לכמת תאים פלואורסצנטיים בצלחת)</td> <td>BioTek</td><td>BTCYT5PV</td><td>לכימות תאים חיים ונורמליזציה של נתונים</td></tr></tbody></table>

הערכת תפקידה של פונקציית מיטוכונדריאלי עייפות הקשורים לסרטן

Evaluating the Role of Mitochondrial Function in Cancer-related Fatigue

עייפות היא משותפת, מתישה מצב זה משפיע על חולי סרטן. עד כה, עייפות נשאר גרוע מאופיין עם אבחון לא מבחן אובייקטיבי מודדים את חומרת המצב הזה. כאן נתאר שיטת אופטימיזציה להערכת תפקוד מיטוכונדריאלי של PBMCs שנאסף חולי סרטן עייף. באמצעות מערכת קומפקטית השטף חוץ-תאית הזרקה רציפים של מעכבי נשימה, נבחנו המצב התפקודי מיטוכונדריאלי PBMC על ידי מדידת נשימה מיטוכונדריאלי הבזליים לקיבולת בדרכי הנשימה, אנרגיה פנוטיפ, המתאר מסלול אנרגיה מועדף להגיב על הלחץ. PBMCs טריים זמינים בהגדרת קליניים באמצעות דם ורידי רגיל. וזמינותו כולו שמתואר פרוטוקול זה יכולה להסתיים תוך פחות מ 4 שעות ללא המעורבות של טכניקות הביוכימי מורכבים. בנוסף, אנו מתארים שיטה לנרמול הדרוש להשגת לשחזור נתונים. השיטות הליך ונורמליזציה פשוטה הציג מאפשרים איסוף הדגימה חוזרות ונשנות מן החולה באותו הדור לשחזור נתונים ניתן להשוואה בין נקודות זמן כדי להעריך את תופעות הטיפול האפשריות.

במבחן הלחץ Mito מסתמך על מדידת קצב צריכת החמצן (OCR) לאחר ההזרקה רציפים של מעכבי נשימה שונים כדי למפות פרופיל מיטוכונדריאלי שלם. מדידות OCR לאחר הזרקת סמים כל יכול לשמש כדי לחשב את הפרמטרים הבאים הקשורים לבריאות מיטוכונדריאלי: OCR הבזליים נמדד לראשונה לפני כל זריקה סמים כדי להעריך את צריכת החמצן. צריך לפגוש נח רמת הביקוש ATP. נשימה הבזליים מחושבת על-ידי חיסור קצב הנשימה הלא-מיטוכונדריאלי מקו OCR לפני הזרקת oligomycin. בשלב הבא, oligomycin מוזרק לעכב ערוץ פרוטון של ATP סינ...

המטרה שלנו הייתה לפתח פרוטוקול מעשית להערכת תפקוד מיטוכונדריאלי המשויך עייפות אצל חולי סרטן. פרוטוקול זה חדשני ממוטב רגיל רק שימוש קליני מעורבים עם דם ורידי ונהלים מעבדה בסיסית.

Fatigue is a common and debilitating condition that affects most cancer patients. To date, fatigue remains poorly characterized with no diagnostic test to ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להעריך תפקוד לקוי של המיטוכונדריה הקשור לעייפות בחולי סרטן. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הטיפול התומך בסרטן, כגון האם תפקוד לקוי של המיטוכונדריה קשור לעייפות בחולי סרטן לאחר קבלת טיפול בקרינה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא פחות פולשנית וניתן להשתמש בה בקלות במרפאה לזיהוי חולים בסיכון לרעילות מטיפול בסרטן.טכניקה זו לא רק מקדמת את ההבנה שלנו לגבי התפקיד של תפקוד לקוי של המיטוכונדריה בעייפות הקשורה לסרטן, היא גם יכולה לשפר את ההערכה ויכולה לייעל את ניהולה. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי המנגנונים הבסיסיים של עייפות הקשורה לסרטן, ניתן ליישם אותה גם על מצבי מחלה מתישים אחרים כגון מצבים מטבוליים ודלקתיים בשתן. באופן כללי, זה יכול להיות מאתגר עבור אנשים חדשים בשיטה זו להזריק מעכבי נשימה לכל יציאה של מחסנית החיישן כראוי ללא הדגמה חזותית מוקדמת.מי שידגים את ההליך הזה יהיה מר קוואנג נגוין, עמית פוסט-דוקטורט מהמעבדה שלנו. כדי להרטיב את מחסנית החיישן, הסר אותה תחילה מהאריזה. לאחר מכן הוסף 200 מיקרוליטר של תמיסת קליברנט לכל באר של לוחית השירות.מלאו גם כל חפיר ב-400 מיקרוליטר של תמיסת קליברנט. לאחר מכן, החזר את לוחית החיישן ללוחית השירות והתחל להרטיב את המחסנית באינקובטור שאינו פחמן דו חמצני בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. מדוד את

evaluating-role-mitochondrial-function-cancer-related

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

עייפות היא סימפטום נפוץ, לא מטופל ולעתים קרובות לא מובן היטב במחלות והפרעות רבות. בדיקות פרה-קליניות חדשות של עייפות עשויות לסייע בשיפור ההבנה הנוכחית והטיפול העתידי בעייפות. לשם כך, הפרוטוקול הנוכחי מספק אמצעי חדשני למדידת התנהגות דמוית עייפות בעכבר.

מבחן עייפות הליכון: A Assay פשוט, תפוקה גבוהה של התנהגות העייפות דמוית עבור העכבר

כאן אנו מציגים פרוטוקול בידודו של תאים לוקמיה במח העצם חולי לוקמיה וניתוח של מדינתם מטבולית. הערכה של פרופיל מטבולי של תאי סרטן ראשוני יכול לעזור כדי לאפיין טוב יותר את הביקוש של ראשי תאים, עלול להוביל רפואה אישית יותר.

הערכה של פרופיל מטבולי של תאי סרטן ראשוני

פיתחנו פרוטוקול מעשי וגישה אנליטית להערכת זרחן חמצוני מיטוכונדריאלי ויכולת העברת אלקטרונים בהומוגנטים של גידול טרי. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם בקלות כדי לסקור פונקציות מיטוכונדריאליות שונות התורמות ייזום סרטן, התקדמות, תגובה לטיפול.

קביעה אנליטית של תפקוד מיטוכונדריאלי של הומוגנטים של גידול מוצק מובחר

נשימה ברזולוציה גבוהה המוצמדת לחיישנים פלואורסצנטיים קובעת את צריכת החמצן המיטוכונדריה ואת ייצור מיני החמצן הריאקטיבי (ROS). הפרוטוקול הנוכחי מתאר טכניקה להערכת שיעורי הנשימה המיטוכונדריאליים וייצור ROS בעצב הסיאטי החודר.

הערכת תפקוד המיטוכונדריה בעצב הסיאטי על ידי נשימה ברזולוציה גבוהה

אנו מתארים פרוטוקולים הדרגתיים המודדים את הנשימה המיטוכונדריאלית של נויטרופילים עכבריים ואנושיים ותאי HL60 באמצעות מנתח שטף חוץ-תאי מטבולי.

מדידה בזמן אמת של הפרופיל הביו-אנרגטי המיטוכונדריאלי של נויטרופילים

פרוטוקול זה מתאר טכניקה ליצירת ציבריד מתאי סרטן הגדלים בתרחיף ככלי לחקר תפקיד המיטוכונדריה בתהליך הגידולי.

יצירת ציבריד טרנסוכונדריאלי באמצעות קווי תאים סרטניים

ניתן לחקור ביו-אנרגטיקה של תאי CD8 T באמצעות מבחן מאמץ מיטו. ניתן להשתמש במתודולוגיה זו כדי לחקור תכנות מטבולי אקוטי וכרוני. פרוטוקול זה מתאר גישות לבחינת הקשרים בין ביולוגיה של קולטני תאי T לניתוח ביו-אנרגטי.

מדידת תפקוד מיטוכונדריאלי של תאי CD8 T נאיביים ואפקטורים

כאן אנו מציגים פרוטוקול רספירומטריה ברזולוציה גבוהה לניתוח ביו-אנרגטיקה בזבובי פירות מוטנטיים מסוג PINK1B9-null. השיטה משתמשת בפרוטוקול Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration (SUIT).

ניתוח תפקוד מיטוכונדריאלי במוטנט Drosophila melanogaster PINK1B9-Null באמצעות רספירומטריה ברזולוציה גבוהה

במאמר זה אנו מתארים שיטה מקיפה למדידת זרחן חמצוני מיטוכונדריאלי בסיבי שריר שלד טריים משריר אדם או עכבר. שיטה זו מאפשרת כימות בזמן אמת של נשימה מיטוכונדריאלית והערכת העדפת דלק וגמישות מטבולית תוך שמירה על רשתות מיטוכונדריאליות קיימות ושלמות הממברנה.

מדידת נשימה מיטוכונדריאלית בסיבי שרירי שלד של בני אדם ועכבר על ידי ספירומטריה ברזולוציה גבוהה

בדיקת אולטרה סאונד זה מנוצל מחקר לאבחון ובדיקות מעקב כדי לאשר את יעילות הטיפול של תרגילי התנגדות הפרוגרסיבית (PRE) ב בצקת לימפתית הקשורה לסרטן השד (BCRL). בדיקת אולטרה סאונד ניתן ליישם יעיל על מנת להבטיח אבחון וטיפול בצקת לימפתית.

הערכת Ultrasonographic של Lymphedema סרטן הקשורים השד

חקור הערכת תפקוד מיטוכונדריאלי בחולי סרטן הסובלים מעייפות באמצעות פליטת דם וניתוח תאי דם לבנים. שיטה זו מאפשרת זיהוי מוקדם של חולים בסיכון לתופעות לוואי מטיפולים אונקולוגיים ומשפרת את הטיפול התומך.

הערכת תפקידה של פונקציית מיטוכונדריאלי עייפות הקשורים לסרטן

גלה סרטונים נוספים