הערכת תפקידה של פונקציית מיטוכונדריאלי עייפות הקשורים לסרטן

המטרה הכוללת של הליך זה היא להעריך תפקוד לקוי של המיטוכונדריה הקשור לעייפות בחולי סרטן. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הטיפול התומך בסרטן, כגון האם תפקוד לקוי של המיטוכונדריה קשור לעייפות בחולי סרטן לאחר קבלת טיפול בקרינה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא פחות פולשנית וניתן להשתמש בה בקלות במרפאה לזיהוי חולים בסיכון לרעילות מטיפול בסרטן.

טכניקה זו לא רק מקדמת את ההבנה שלנו לגבי התפקיד של תפקוד לקוי של המיטוכונדריה בעייפות הקשורה לסרטן, היא גם יכולה לשפר את ההערכה ויכולה לייעל את ניהולה. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי המנגנונים הבסיסיים של עייפות הקשורה לסרטן, ניתן ליישם אותה גם על מצבי מחלה מתישים אחרים כגון מצבים מטבוליים ודלקתיים בשתן. באופן כללי, זה יכול להיות מאתגר עבור אנשים חדשים בשיטה זו להזריק מעכבי נשימה לכל יציאה של מחסנית החיישן כראוי ללא הדגמה חזותית מוקדמת.

מי שידגים את ההליך הזה יהיה מר קוואנג נגוין, עמית פוסט-דוקטורט מהמעבדה שלנו. כדי להרטיב את מחסנית החיישן, הסר אותה תחילה מהאריזה. לאחר מכן הוסף 200 מיקרוליטר של תמיסת קליברנט לכל באר של לוחית השירות.

מלאו גם כל חפיר ב-400 מיקרוליטר של תמיסת קליברנט. לאחר מכן, החזר את לוחית החיישן ללוחית השירות והתחל להרטיב את המחסנית באינקובטור שאינו פחמן דו חמצני בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. מדוד את רמת העייפות על סמך הערכה תפקודית בת 13 פריטים של טיפול במחלות כרוניות.

עייפות בנקודת ההתחלה, באמצע, בסיום ה-EBRT ושנה לאחר ה-EBRT. ראשית הכינו את מדיום הבדיקה למדידת תפקוד המיטוכונדריה. לאחר הכנת המדיום יש לחמם אותו עד 37 מעלות צלזיוס ולהתאים את ה- pH ל -7.4.

חשוב לוודא שמדיית הבדיקה מוכנה ביום הניסוי ומחוממת עד 37 מעלות לפני התאמת ה-PH ל-7.4. לאחר מכן זרעו את ה-PBMCs בכל באר כדי להשיג מפגש של 80 עד 90 אחוזים. ואז סובב את הצלחת 200 פעמים גרם למשך 2 דקות כדי שהתאים יידבקו לתחתית הבארות.

לאחר הסיבוב הסר את המדיה מכל באר ושטוף את הבארות פעם אחת עם מדיית בדיקה. הוסף 180 מיקרוליטר של מדיום בדיקה בכל באר כולל בארות הרקע. לאחר מכן דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור שאינו פחמן דו חמצני למשך 45 עד 60 דקות.

כדי להרכיב מחדש את התרופות, הוסף לתרופה 252 מיקרוליטר של מדיום בדיקה כדי ליצור תמיסת מלאי של 50 מיקרו-מולרית של אוליגומיצין. הוסף 288 מיקרוליטר של מדיום בדיקה לתרופה כדי ליצור תמיסת מלאי של 50 מיקרו-מולרית של FCCP. לבסוף, הוסף 216 מיקרוליטר של מדיום בדיקה כדי ליצור תמיסת מלאי של 25 מיקרו-מולרית של אנטימיצין a/רוטנון.

לאחר הרכבה מחדש של כל שלוש התרופות, מערבל את תרחיף התרופה למשך דקה אחת ולאחר מכן מדלל את תמיסות העבודה. לאחר מכן פיפטה 20 מיקרוליטר של 10 אוליגומיצין מיקרומולרי ביציאה A לריכוז סופי של מיקרוטולר אחד בכל באר. לאחר מכן פיפטה 22 מיקרוליטר של 10 מיקרו-מולרי FCCP ביציאה B לריכוז סופי של מיקרו-מולרית אחת בכל באר.

לבסוף פיפטה 25 מיקרוליטר של 5 מיקרו-מולרי אנטימיצין a/רוטנון ביציאה C לריכוז סופי של 0.5 מיקרומולרית בכל באר. לאחר מכן בחר את מבחן המתח של מיטו במכשיר השטף החוץ-תאי. לאחר מכן הכנס את מחסנית החיישן בהתאם להנחיית המכשיר.

המכשיר יבצע אוטומטית כיול חיישן. לאחר סיום הכיול, הכנס את לוחית התא כדי שהמכשיר יסיים את שאר הבדיקה. כדי להכין את תמיסת בדיקת התפשטות התאים, הוסף 5.76 מיקרוליטר של כתם חומצת גרעין ו-28.8 מיקרוליטר של מדכא רקע ל-1.405 מיליליטר של מי מלח חוצצים פוספט.

לאחר סיום מבחן המאמץ של מיטו הוסף 180 מיקרוליטר של תמיסת עבודה פי 2 ישירות במדיום בכל באר. לאחר מכן דגרו על התאים עם תמיסת בדיקת התפשטות התאים ב-37 מעלות צלזיוס למשך 45 עד 60 דקות. כמת את מספר התאים החיים בקורא צלחות בעירור של 508 ננומטר ופליטה של 527 ננומטר ולאחר מכן נרמל את נתוני ה-OCR.

בביצוע טיטרציה של FCCP מיקרוטולר אחד הוא ריכוז התרופה האופטימלי המשמש להערכת תפקוד המיטוכונדריה של PBMC. חקירה של נשימה מיטוכונדריאלית ו-PBMCs מבודדים טריים מראה כי OCR מתחיל לרדת לאחר שלוש שעות ונמשך עד שמונה שעות. עם זאת, הנשימה המקסימלית הנגרמת על ידי הזרקת FCCP גם אינה עולה על רמת ה-OCR הבסיסית.

כאן מוצגת נורמליזציה של תפקוד המיטוכונדריה שבו התאים מבודדים משני אנשים בריאים. למעשה, ה-OCR המנורמל לתאים חיים המיוצגים על ידי צבע ה-DNA הקרינה הירוק דומה בשני האנשים הבריאים. למעשה לא נצפה הבדל משמעותי ב-OCR הבסיסי בין נבדק בריא לעייף.

עם זאת, הנבדק העייף מראה ירידה בצריכת החמצן המקסימלית ויכולת הנשימה העודפת בהשוואה לביקורת. לא נמצאו הבדלים בצריכת החמצן שאינה קשורה למיטוכונדריה ול-ATP או ביעילות הצימוד בין הנבדקים הבריאים והעייפים. לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך ארבע שעות אם היא מבוצעת כראוי.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לקבוע תחילה את צפיפות התאים האופטימלית ואת ריכוזי ה-FCCP. בעקבות הליך זה ניתן לבצע שיטות אחרות כמו בידוד אוכלוסיות תאים שונות על מנת להנחות חקירות מכניסטיות עתידיות המתמקדות בסוגי תאים ספציפיים. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הטיפול התומך לחקור את תפקיד התפקוד הלקוי של המיטוכונדריה בחולי סרטן עייפים.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד למדוד את תפקוד המיטוכונדריה ודגימות קליניות שניתן להשתמש בהן גם כדי לזהות באופן יזום חולים בסיכון לפתח רעילות הקשורה לטיפול בסרטן, כולל עייפות. אל תשכח שעבודה עם מעכבי נשימה כמו אוליגומיצין ורוטנון עלולה להיות מסוכנת ביותר. יש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון לבישת ציוד מגן אישי בעת ביצוע הליך זה.