Name: Exosomes Bronchoalveolar שטיפה בפציעה ליפופוליסכריד-induced ריאות זיהומית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: חקור את תפקיד האקסוזומים בפציעת ריאות חריפה המושרית על ידי LPS בעכברים. למד כיצד לבודד אקסוזומים משטיפה ברונכואלוולרית ולנתח את השפעתם על תאים אפיתליאליים ומולקולות דלקתיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים הכריזו אין ניגוד אינטרסים.

פרוטוקול הכולל דורש 2 ימים, כולל ביום הראשון של אלח דם אינדוקציה ובידוד של נוזל BAL החיה, ביום השני exosomes בידוד מן העכבר BALF. כל ההליכים נבדקו ואושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה ב אטלנטה VA medical center.
1. עכבר ריאות זיהומית חריפה פציעה מודל
<ol><li>להשתמש 6-8 שבועות - בן זכר פראי-סוג C57BL/6J עכברים (משקל 20-22 גרם) לבעל החיים מודל, ולבצע כל ההליכים באמצעות טכניקות aseptic וכלי נגינה. אוטוקלב כל מכשירי ניתוח, כולל מלקחיים ומספריים במשך 20 דקות-121 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>באופן אקראי להפיץ עכברים לתוך ניסיוני, קבוצת הביקורת. לרסן עכברים על לוח כירורגי. לטפל עכברים עם ליפופוליסכריד Escherichia coli (LPS, 15 מ"ג/ק"ג) על ידי תוואי בקרום הבטן. לפי משקל גוף פרטי, לדלל במינונים המתאימים LPS עד 0.1 מ"ל PBS לכל בעכבר, ואז הזרקת LPS הפתרון באמצעות מזרק 1 מ"ל עם המחט 27 G ולהזריק אמצעי שוות ערך ל- PBS לבעלי שליטה.</li>
	<li>שמור עכברים המתקן BSL2 בבעלי חיים, אשר מורכב של הכלובים נקיים בטמפרטורת החדר המתאים.</li>
	<li>24 שעות לאחר מכן, המתת חסד עכברים עם שאיפת2 CO.</li>
	<li>בחר את האזור הכירורגי במרכז הצוואר העכבר. עושים חתך קטן (כ 5 מ מ), ולהפריד בעדינות שרירים עבור גישה לקנה הנשימה באמצעות מלקחיים בוטה עד קנה הנשימה הוא חשוף.</li>
	<li>תיסוג העכבר נוזל בל עם מזרק סטרילי 10 מ"ל עם מחט 27 גרם. ראשית, בעדינות, את המחט לתוך קנה הנשימה, להזריק 1 מ"ל של PBS סטרילי לאט לתוך קנה הנשימה, לאחר מכן צייר BALF לתוך מזרק חד פעמיות 3 מ עם מחט 27 G. עם סיום ההליך, תשליך מזרקים ומחטים במיכל שרפ חומרים מסוכנים.</li>
	<li>לטיפול כירורגי מכשירים עם כלור דיאוקסיד, כפי שתואר קודם לכן על ידי. Chauret et al. 27, ולחטא ואז כל מכשירי ניתוח על-ידי autoclaving עבור 20 דקות-121 מעלות צלזיוס.</li>
</ol>2. Exosomes בידוד-סדרתי אולטרה-צנטריפוגה ואפיון
<ol><li>לאסוף את העכבר BAL נוזל צינורות חרוט 15 מ"ל. הקציר תאים מכתשי, צנטריפוגה דגימות 10 דקות ב g 1,000, ב 4 º C.</li>
	<li>להעביר את תגובת שיקוע צינורות חרוט 15 mL החדש, ואז צנטריפוגה דגימות למשך 30 דקות ב g x 4,000 ב 4 ° C כדי להסיר שאריות תאים.</li>
	<li>לאסוף את תגובת שיקוע של צינורות ultracentrifuge ודוגמאות צנטריפוגה עבור 60 דקות ב g x 10,000 ב 4 ° C כדי להסיר חלקיקים גדולים יותר הסלולר.</li>
	<li>להעביר את תגובת שיקוע צינורות חרוט החדש ולאחר מכן לסנן את הדגימות דרך 0.2 µm מזרק-מסנן כדי להסיר נותרו חלקיקים גדולים יותר.</li>
	<li>לאסוף דגימות ultracentrifuge צינורות, ולאיזון צינורות. צנטריפוגה הדוגמאות עבור 2 h ב g x 140,000-4° C עד הצניפה את exosomes. הערה: גודל exosomes משתנה 20-200 ננומטר. 0.2 µm הסינון משמש עבור הסרת חלקיקים גדולים יותר כי הם יותר מ-200 nm, בגודלה.</li>
	<li>למחוק את supernatants בעדינות. להמיס את גלולה עם 100 µL PBS או פירוק פתרון, העברת דגימות exosomes 1.5 mL צינורות, לאחסן ב- 80 ° C עד השימוש. הערה: מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים מומלץ לוודא exosomes מבודדים.</li>
	<li>בצע את הדגימה TEM תקן עיבוד פרוטוקול28. לנתח דגימות exosomes באמצעות סרגל במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים, וכן לקחת תמונות, בר 200 ננומטר.</li>
</ol>3. הכנת miRNA, הבמה miRNA-q-RT-PCR
הערה: miRNA-q-RT-PCR מומלץ לנתח את רמת הביטוי miRNAs.
<ol><li>בצע miRNAs רגיל בידוד פרוטוקול, הקפד להשתמש כמות שווה של RNAs מטוהרים שעתוק במהופך יחיד-strand24.</li>
	<li>בצע את הפרוטוקול הסטנדרטי PCR בזמן אמת לגילוי רמת microRNA exosomal בנוזל BAL. שימוש ספציפי בזמן אמת PCR primers נגד מיר-155, מיר-146a ו- U6 SnRNA. להפעיל את תגובת ה-PCR עם מנגנון ה-PCR כמותי, לנרמל את הערכים בביטוי snRNA בקרה פנימית U6. הערה: כל קבוצה מורכבת מדגמים triplicate24.</li>
</ol>4. Exosomes תיוג וטיהור
<ol><li>להשעות exosomes גלולה עם פתרון הבולם µL 100 1.5 mL צינור פוליפרופילן, ולאחר מכן להוסיף µL 0.4 של לצבוע exosomes לתוך הצינור השני עם µL 100 של הפתרון ההשעיה.</li>
	<li>. ובמהירות להוסיף exosomes בפתרון הפתרון לצבוע לערבב ביסודיות על ידי pipetting לשמור דגימות עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר, להגן מפני אור.</li>
	<li>מכניסים עמודה אחת של ספין exosome צינור • תנאי 1.5 mL. להעביר את התערובת פתרון המרכז של העמודה ספין exosome.</li>
	<li>לסובב את העמודה למשך 2 דקות ב g x 800 בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>למחוק את העמודה ולאחסן את הדגימה eluted ב-20 ° C עד השימוש.</li>
</ol>5. אימות של Up Exosomes נלקחה על ידי תאים הנמען
<ol><li>זרע עונה 1 פרק 104 MLE 12 /cell של שקופיות הקאמרית 8-ובכן, ואת התרבות תאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.</li>
	<li>להוסיף 10 µL התווית על-ידי פלורסנט exosomes התאים. תקופת דגירה של h 1-37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>להסיר את תרבות המדיה, לשטוף תאים עם PBS, לאחר מכן לתקן תאים עם 1% paraformaldehyde במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>טעינת השקופית הר בינוני עם דאפי.</li>
	<li>לנתח דגימות דרך מיקרוסקופ פלורסצנטיות, תמונות, 40 X הגדלה.</li>
</ol>6. אימות של האינטראקציה בין Exosomes לבין תאים הנמען
<ol><li>זרע 2 x 105 MLE12/טוב בצלחת 12-ובכן תרבות המכילות בינוני תרבות המתאים, ואת התרבות תאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.</li>
	<li>להוסיף 20 µg exosomes מן העכבר BAL נוזל לתאים MLE12 ולהגדיר משכפל לכל קבוצה ניסיונית.</li>
	<li>24 שעות מאוחר יותר, לשטוף תאים עם PBS ולהוסיף 600 µL פירוק מאגר לבאר. בעדינות לנער את הצלחת ולאסוף דגימות פירוק בצינור 1.5 mL עם פיפטה.</li>
	<li>בצע את פרוטוקול RNA בידוד מוחלט תקני ופרוטוקול שעתוק במהופך cDNA, להשלים שעתוק במהופך יחיד-strand cDNA29.</li>
	<li>בצע את הפרוטוקול הסטנדרטי PCR בזמן אמת כדי לזהות רמת ביטוי mRNA תאי הנמען29. שימוש ספציפי בזמן אמת PCR primers נגד TNF-α, IL-6 וזואי-1. הפעל את תגובות PCR עם מנגנון ה-PCR כמותי, לנרמל את הערכים בביטוי בפקד פנימי GAPDH. הערה: כל קבוצה מורכבת מדגמים triplicate.</li>
</ol>

<ol><li>Rubenfeld, G. D., Herridge, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+and+outcomes+of+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">Epidemiology and outcomes of acute lung injury.</a> Chest. 131, 554-562 (2007).</li>
<li>Baron, R. M., Choi, A. J., Owen, C. A., Choi, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+manipulated+mouse+models+of+lung+disease%3A+potential+and+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Lung+cellular+and+molecular+physiology%22%5BJournal%5D)">Genetically manipulated mouse models of lung disease: potential and pitfalls.</a> American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. , L485-L497 (2012).</li>
<li>Han, S., Mallampalli, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+acute+respiratory+distress+syndrome%3A+from+mechanism+to+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">The acute respiratory distress syndrome: from mechanism to translation.</a> Journal of immunology. , Baltimore, Md. 855-860 (1950).</li>
<li>Aeffner, F., Bolon, B., Davis, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Models+of+Acute+Respiratory+Distress+Syndrome%3A+A+Review+of+Analytical+Approaches%2C+Pathologic+Features%2C+and+Common+Measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologic+pathology%22%5BJournal%5D)">Mouse Models of Acute Respiratory Distress Syndrome: A Review of Analytical Approaches, Pathologic Features, and Common Measurements.</a> Toxicologic pathology. 43, 1074-1092 (2015).</li>
<li>Matute-Bello, G., Frevert, C. W., Martin, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Lung+cellular+and+molecular+physiology%22%5BJournal%5D)">Animal models of acute lung injury.</a> American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. , L379-L399 (2008).</li>
<li>Terrasini, N., Lionetti, V. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28328650">Exosomes in Critical Illness.</a> Critical care medicine. , (2017).</li>
<li>Fujita, Y., Kadota, T., Araya, J., Ochiya, T., Kuwano, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+Vesicles%3A+New+Players+in+Lung+Immunity%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+respiratory+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Extracellular Vesicles: New Players in Lung Immunity.</a> American journal of respiratory cell and molecular biology. , (2017).</li>
<li>Kubo, H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28684288">Extracellular Vesicles in Lung Disease.</a> Chest. 153, 210-216 (2018).</li>
<li>Krol, J., Loedige, I., Filipowicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+widespread+regulation+of+microRNA+biogenesis%2C+function+and+decay%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay.</a> Nature reviews. Genetics. 11, 597-610 (2010).</li>
<li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+target+recognition+and+regulatory+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: target recognition and regulatory functions.</a> Cell. 136, 215-233 (2009).</li>
<li>Fanini, F., Fabbri, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CANCER-DERIVED+EXOSOMIC+microRNAs+SHAPE+THE+IMMUNE+SYSTEM+WITHIN+THE+TUMOR+MICROENVIRONMENT%3A+STATE+OF+THE+ART%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+cell+%26+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">CANCER-DERIVED EXOSOMIC microRNAs SHAPE THE IMMUNE SYSTEM WITHIN THE TUMOR MICROENVIRONMENT: STATE OF THE ART.</a> Seminars in cell & developmental biology. , (2016).</li>
<li>Agarwal, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental%2C+Systems%2C+and+Computational+Approaches+to+Understanding+the+MicroRNA-Mediated+Reparative+Potential+of+Cardiac+Progenitor+Cell-Derived+Exosomes+From+Pediatric+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Experimental, Systems, and Computational Approaches to Understanding the MicroRNA-Mediated Reparative Potential of Cardiac Progenitor Cell-Derived Exosomes From Pediatric Patients.</a> Circulation research. 120, 701-712 (2017).</li>
<li>Prattichizzo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+microRNAs+and+endothelial+hyperglycaemic+memory%3A+a+therapeutic+opportunity%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%2C+obesity+%26+metabolism%22%5BJournal%5D)">Extracellular microRNAs and endothelial hyperglycaemic memory: a therapeutic opportunity?</a> Diabetes, obesity & metabolism. 18, 855-867 (2016).</li>
<li>Huang-Doran, I., Zhang, C. Y., Vidal-Puig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+Vesicles%3A+Novel+Mediators+of+Cell+Communication+In+Metabolic+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+endocrinology+and+metabolism%3A+TEM%22%5BJournal%5D)">Extracellular Vesicles: Novel Mediators of Cell Communication In Metabolic Disease.</a> Trends in endocrinology and metabolism: TEM. 28, 3-18 (2017).</li>
<li>Khalyfa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+Plasma+Extracellular+Microvesicle+MicroRNA+Cargo+and+Endothelial+Dysfunction+in+Children+with+Obstructive+Sleep+Apnea%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+respiratory+and+critical+care+medicine%22%5BJournal%5D)">Circulating Plasma Extracellular Microvesicle MicroRNA Cargo and Endothelial Dysfunction in Children with Obstructive Sleep Apnea.</a> American journal of respiratory and critical care medicine. 194, 1116-1126 (2016).</li>
<li>Thomou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+circulating+miRNAs+regulate+gene+expression+in+other+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived circulating miRNAs regulate gene expression in other tissues.</a> Nature. 542, 450-455 (2017).</li>
<li>Gregson, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+Exosomal+RNA+Profiles+in+Bronchoalveolar+Lavage+from+Lung+Transplants+with+Acute+Rejection%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+respiratory+and+critical+care+medicine%22%5BJournal%5D)">Altered Exosomal RNA Profiles in Bronchoalveolar Lavage from Lung Transplants with Acute Rejection.</a> American journal of respiratory and critical care medicine. 192, 1490-1503 (2015).</li>
<li>Valadi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome-mediated+transfer+of+mRNAs+and+microRNAs+is+a+novel+mechanism+of+genetic+exchange+between+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells.</a> Nature cell biology. 9, 654-659 (2007).</li>
<li>Doxaki, C., Kampranis, S. C., Eliopoulos, A. G., Spilianakis, C., Tsatsanis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+Regulation+of+miR-155+and+miR-146a+Genes+during+Induction+of+Endotoxin+Tolerance+in+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Coordinated Regulation of miR-155 and miR-146a Genes during Induction of Endotoxin Tolerance in Macrophages.</a> Journal of immunology. , Baltimore, Md. 5750-5761 (2015).</li>
<li>Schulte, L. N., Westermann, A. J., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+activation+and+functional+specialization+of+miR-146+and+miR-155+in+innate+immune+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Differential activation and functional specialization of miR-146 and miR-155 in innate immune sensing.</a> Nucleic acids research. 41, 542-553 (2013).</li>
<li>Alexander, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome-delivered+microRNAs+modulate+the+inflammatory+response+to+endotoxin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">Exosome-delivered microRNAs modulate the inflammatory response to endotoxin.</a> Nature communications. 6, 7321(2015).</li>
<li>Yuan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TREM-1+is+induced+in+tumor+associated+macrophages+by+cyclo-oxygenase+pathway+in+human+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">TREM-1 is induced in tumor associated macrophages by cyclo-oxygenase pathway in human non-small cell lung cancer.</a> PloS one. 9, e94241(2014).</li>
<li>Xu, R., Richards, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+In+Vitro+Co-Culture+Model+in+Anti-Cancer+Drug+Development+Cascade%5BTitle%5D)+AND+%22Combinatorial+chemistry+%26+high+throughput+screening%22%5BJournal%5D)">Development of In Vitro Co-Culture Model in Anti-Cancer Drug Development Cascade.</a> Combinatorial chemistry & high throughput screening. 20, 451-457 (2017).</li>
<li>Yuan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TREM-1-accentuated+lung+injury+via+miR-155+is+inhibited+by+LP17+nanomedicine%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Lung+cellular+and+molecular+physiology%22%5BJournal%5D)">TREM-1-accentuated lung injury via miR-155 is inhibited by LP17 nanomedicine.</a> American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. , L426-L438 (2016).</li>
<li>Sadikot, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-dose+dexamethasone+accentuates+nuclear+factor-kappa+b+activation+in+endotoxin-treated+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+respiratory+and+critical+care+medicine%22%5BJournal%5D)">High-dose dexamethasone accentuates nuclear factor-kappa b activation in endotoxin-treated mice.</a> American journal of respiratory and critical care medicine. 164, 873-878 (2001).</li>
<li>Yuan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curcumin+mediated+epigenetic+modulation+inhibits+TREM-1+expression+in+response+to+lipopolysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22The+international+journal+of+biochemistry+%26+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Curcumin mediated epigenetic modulation inhibits TREM-1 expression in response to lipopolysaccharide.</a> The international journal of biochemistry & cell biology. 44, 2032-2043 (2012).</li>
<li>Chauret, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlorine+dioxide+inactivation+of+Cryptosporidium+parvum+oocysts+and+bacterial+spore+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Chlorine dioxide inactivation of Cryptosporidium parvum oocysts and bacterial spore indicators.</a> Applied and environmental microbiology. 67, 2993-3001 (2001).</li>
<li>Cizmar, P., Yuana, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+Characterization+of+Extracellular+Vesicles+by+Transmission+and+Cryo-Transmission+Electron+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Detection and Characterization of Extracellular Vesicles by Transmission and Cryo-Transmission Electron Microscopy.</a> Methods in molecular biology. , Clifton, N.J. 221-232 (2017).</li>
<li>Yuan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-related+proteins+prolong+macrophage+survival+through+induction+of+Triggering+receptor+expressed+on+myeloid+cells-1%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">HIV-related proteins prolong macrophage survival through induction of Triggering receptor expressed on myeloid cells-1.</a> Scientific reports. 7, 42028(2017).</li>
<li>Jackson, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Mitochondrial+Transfer+in+Direct+Co-cultures+of+Human+Monocyte-derived+Macrophages+%28MDM%29+and+Mesenchymal+Stem+Cells+%28MSC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Analysis of Mitochondrial Transfer in Direct Co-cultures of Human Monocyte-derived Macrophages (MDM) and Mesenchymal Stem Cells (MSC).</a> Bio-protocol. 7, (2017).</li>
<li>Fujita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+Vesicles%3A+New+Players+in+Lung+Immunity%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+respiratory+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Extracellular Vesicles: New Players in Lung Immunity.</a> American journal of respiratory cell and molecular biology. 17, 474-484 (2017).</li>
<li>Gunasekaran, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor-Derived+Exosomes+With+Lung+Self-Antigens+in+Human+Lung+Allograft+Rejection%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+transplantation+%3A+official+journal+of+the+American+Society+of+Transplantation+and+the+American+Society+of+Transplant+Surgeons%22%5BJournal%5D)">Donor-Derived Exosomes With Lung Self-Antigens in Human Lung Allograft Rejection.</a> American journal of transplantation : official journal of the American Society of Transplantation and the American Society of Transplant Surgeons. 17, 474-484 (2017).</li>
<li>Kalra, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+proteomics+evaluation+of+plasma+exosome+isolation+techniques+and+assessment+of+the+stability+of+exosomes+in+normal+human+blood+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Comparative proteomics evaluation of plasma exosome isolation techniques and assessment of the stability of exosomes in normal human blood plasma.</a> Proteomics. 13, 3354-3364 (2013).</li>
<li>Baranyai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Exosomes+from+Blood+Plasma%3A+Qualitative+and+Quantitative+Comparison+of+Ultracentrifugation+and+Size+Exclusion+Chromatography+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Isolation of Exosomes from Blood Plasma: Qualitative and Quantitative Comparison of Ultracentrifugation and Size Exclusion Chromatography Methods.</a> PloS one. 10, e0145686(2015).</li>
<li>Nordin, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafiltration+with+size-exclusion+liquid+chromatography+for+high+yield+isolation+of+extracellular+vesicles+preserving+intact+biophysical+and+functional+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine+%3A+nanotechnology%2C+biology%2C+and+medicine%22%5BJournal%5D)">Ultrafiltration with size-exclusion liquid chromatography for high yield isolation of extracellular vesicles preserving intact biophysical and functional properties.</a> Nanomedicine : nanotechnology, biology, and medicine. 11, 879-883 (2015).</li>
</ol>

עבודה זו נתמכה על ידי סקירה ההצטיינות VA 2I01BX001786-06A1 מימון ר'.

העכבר מודלים של מחלות משמשות כדי להעריך את תפקוד פיזיולוגי גנים ספציפיים וכדי להפחית את העלות של ניסויים2. הפגיעה ריאות זיהומית חריפה המתוארים כאן מחקה לתגובה דלקתית אצל בני-אדם עם ARDS. מודל זה רלוונטי לחקור בפתוגנזה מולקולרית, פיתוח של סמנים ביולוגיים, לבחון את פוטנציאל טיפולי חדש5.
תרבות משותפת מערכות הם רלוונטיים ללימודי אין ויוו בהקשר של חוקרים מנגנונים פוטנציאל ההעברה של מולקולות ביולוגיות כגון ה-RNA, DNA, ליפידים חלבון ב<sup class...

עלי ARDS הם הצורות סכנת חיים של כשל נשימתי עם hypoxemia חמורה נגרמת על ידי בצקת ריאות שאינה קרדיוגני אשר משפיע על 1 מיליון אנשים ברחבי העולם מדי שנה1. האטיולוגיה של ARDS כולל פגיעה ישירה אל הריאות מפני זיהומים או שאיפה ועוד מגוון של עלבונות עקיף. בעשור האחרון חלה הבנה מוגברת של מולקולרית בפתוגנזה של ARDS, עם זאת, טיפולים פרטניים יישוב ARDS הם עדיין להיות שפותחה2,3.
מספר מודלים חייתיים של פגיעת ריאות חריפה פותחו המספקות גשר לתרגום טיפולים ניסויים בבני אדם4,5. דגמים נפוצים כוללים התקנה מקומית של חומצה אולאית, חיידקים, LPS bleomycin. גישות אחרות כוללות איסכמיה-פגיעה reperfusion, ניקוב מצדו cecal, פציעה מתיחה הנוצרות על-ידי אוורור מכני, מעידות או ניהול מערכתי חיידקים ו LPS5. מודלים אלה מספקים מערכת ביולוגית שימושי כדי לבדוק השערות קליני לפיתוח של טיפולים פוטנציאליים. כדי לדמות אנושית ARDS, מודלים בעלי חיים צריכים לשחזר דלקת חריפה לפגיעה אפיתל ותאי אנדותל עם פגמים בתפקוד מכשול בריאות.
Exosomes הם קרום שלפוחית עם 20-200 ננומטר בקוטר, שתוכנם מולקולרית מכיל חלבונים, DNA, RNA, ושומנים, וכדי להקל על תקשורת בין-תאית ברקמות microenvironment באמצעות העברה ההרכב המולקולרי. Exosomes המופרשים על ידי סוגים שונים של תאים, כגון תאי אנדותל, תאי אפיתל, תאי שריר חלק, תאים סרטניים, ולא קיים בנוזל הגוף האנושי. מחקרים מצביעים על כך exosomes לווסת צולבות לדבר בין תאים חיסוניים לבין תאי סטרומה במהלך זיהומיות ומחלות דלקתיות סטרילי שחרורם חריג שנראה ולהיות מוסדר על ידי גירויים טבעיים וניסויים שונים במהלך פיזיולוגיים תהליכים פתולוגיים6. רשת תקשורת כזה עשוי לשחק תפקיד חשוב בפתוגנזה של מחלות ריאה, עשוי להשפיע על התקדמות pathophysiological7,8. כמו 18-22 נוקלאוטיד אי קידוד RNAs, miRNAs קיימים רקמות וגם נוזלי הגוף, פלזמה, סרה, לווסת את ביטוי ה-mRNA ברמה post-translational9,10.
MiRNAs ארוזים בשנת exosomes בידול והתפקוד של סוגים שונים של תאים, ולהשפיע על רמות מוגזמות קשורים עם מגוון רחב של מחלות, כולל סרטן, מחלות ריאה, השמנת יתר, סוכרת, מחלות לב וכלי דם11, 12,13,14,15,16. הזנת התאים הנמען ושל הליכה הלוך ושוב של exosomal miRNAs להקל על המערכת תקשורת שינוי את hemostasis17,microenvironment18. ריאות חריפה-פגיעה היא תהליכים מורכבים, הכוללים סוגי תאים מרובים עם התקשורת המערכת נרחב עד exosomes8. miR-155 מיר-146a לשתף מנגנון רגולטורי תעתיק נפוצות, לתרום את התגובה דלקתית ו19,את המערכת החיסונית סובלנות20. מחקרים שנעשו לאחרונה עולה כי שניהם לווסת את התגובה דלקתית ויה exosomal miRNAs ונעים בין תאים חיסוניים21. אולם, המנגנונים המולקולריים שבבסיס ההשפעות modulatory של exosomal miRNAs על מכתשי בתגובה אנדוטוקסין אינן ברורות, ללא ספק פוטנציאל להיות קליני ואת הכשרון במשתמע translational להמשך החקירה.
תרבות שיתוף מודלים להיות מועסקים כדי להגדיר את האינטראקציה של סוגי תאים מסוים בסביבת מורכבים, כגון דלקת וסרטן22,23. פלטפורמות אלה מספקים אסטרטגיית חלופי לחקור צלב דיבורים בין סוגי תאים במיוחד עבור תאים חיסוניים ומבניים.
אינטרה-הנשימה, ניהול שידורה, בקרום הבטן או מערכתית של LPS נמצאים בשימוש נרחב לזירוז ריאות ניסיוני פציעה24,25,26, הראו לזירוז חדירות אפיתל, אנדותל פגמים. כאן אנו משתמשים LPS בקרום הבטן לזירוז מודל ספיגה של פגיעת ריאות חריפה בעכברים. בתוך 24 שעות של הממשל בקרום הבטן של LPS, פגמים חדירות הם המושרה בריאות עם הגיוס של תאים דלקתיים. יתרה מזאת, אנו מראים כי exosomes מ- BAL מכילות miRNA-155 מיר-146a, exosomes מן נוזל BAL זירוז ביטוי ציטוקינים פרו-דלקתיים בתאי אפיתל הנמען, כולל IL-6 ו- TNF-α. נתונים אלה הם הראשון להראות כי miRNAs exosomal המופרשים ב BAL במודל זה הפגיעה ריאות זיהומית חריפה.

<table><tbody><tr><td>lipopolysaccharide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Escherichia coli 055:B5</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH7.2(1X)</td><td>Life technologies</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>mirVana miRNA בידוד</td><td>ערכת תרמו פישר</td><td>449774</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan ביטוי גנים מאסטר מיקס</td><td>תרמו פישר</td><td>4369016</td><td></td></tr><tr><td>mmu-miR-155 (002571) פריימר</td><td>תרמו פישר</td><td>4427975</td><td></td></tr><tr><td>has-miR-146a (000468) פריימר</td><td>תרמו פישר</td><td>4427975</td><td></td></tr><tr><td>פריימר U6snRNA תרמו</td><td>פישר</td><td>4427975</td><td></td></tr><tr><td>TNF-&alpha;( Mm00443258_m1 ) פריימר</td><td>תרמו פישר</td><td>4331182</td><td></td></tr><tr><td>IL-6 (Mm00446190_m1&nbsp; &nbsp; פריימר</td><td>תרמו פישר</td><td>4331182</td><td></td></tr><tr><td>ZO-1 (Mm00493699_m1&nbsp; )פריימר</td><td>תרמו פישר</td><td>4331182</td><td></td></tr><tr><td>מדיום חיוני מינימלי (MEM)</td> תמיסת <td>Thermo Fisher</td><td>11095-072</td><td></td></tr><tr><td>Trysin-EDTA (0.05%)</td><td>Thermo Fisher</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Exosomes סומנו עם PKH67 עד PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Mini Kit&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>MINI67-1KT</td><td></td></tr><tr><td>עמודי ספין אקסוזום (MW3000)</td><td>תרמו פישר</td><td>4484449</td><td></td></tr><tr><td>בקמן קולטר אופטימה L-100XP אולטרה-צנטריפוגה&nbsp;</td><td>בקמן קולטר</td><td>L-100XP</td><td></td></tr><tr><td>צינורות צנטריפוגה ברורים במיוחד</td><td>בקמן קולטר</td><td>344058</td><td></td></tr><tr><td>יישומי ביוסיסטמס 7500 מערכת PCR מהירה בזמן אמת</td><td>תרמו פישר</td><td></td><td></td></tr><tr><td>שידור מיקרוסקופים אלקטרונים (TEM)</td> <td>JEOL Ltd</td><td>120 קילו וולט TEM</td><td></td></tr><tr><td>אולימפוס BX41 מיקרוסקופ</td><td>אולימפוס</td><td>BX41</td><td></td></tr></tbody></table>

exosomes bronchoalveolar שטיפה בפציעה ליפופוליסכריד-induced ריאות זיהומית

Bronchoalveolar Lavage Exosomes in Lipopolysaccharide-induced Septic Lung Injury

פגיעת ריאות חריפה (עלי), תסמונת מצוקה נשימתית חריפה (ARDS) מייצגים קבוצה הטרוגנית של מחלות ריאה, אשר ממשיכה יש תחלואה גבוהה של תמותה. בפתוגנזה מולקולרית של עלי זה להיות טוב יותר מוגדרים; עם זאת, בשל האופי המורכב של המחלה טיפולים מולקולריים טרם להתפתח. כאן אנו משתמשים דגם העכבר המושרה ליפופוליסכריד (LPS) של פגיעת ריאות זיהומית חריפה על התפקיד של exosomes בתגובה דלקתית. באמצעות מודל זה, הצלחנו להראות כי עכברים נחשפים LPS בקרום הבטן מפרישים exosomes בנוזל שטיפה (BAL) Broncho-מכתשי מהריאות הארוזים עם miRNA, ציטוקינים המסדירה תגובה דלקתית. עוד יותר באמצעות מערכת מודל תרבות משותפת, אנו מראים כי exosomes של מקרופאגים לשבש את הביטוי של צומת חזק חלבונים בתאי אפיתל הסמפונות. תוצאות אלו מראים כי הצלב לדבר 1) בין תאי מערכת החיסון ומבניים מולדת דרך exosomal הליכה הלוך ושוב לתרום התגובה דלקתית, שיבוש המכשול מבנית ואת 2) מיקוד miRNAs אלה עשויים לספק פלטפורמה חדשנית לטיפול עלי, ARDS.

כדי לגרום לפציעה ריאות זיהומית, טופלו עכברים LPS בקרום הבטן (15 מ"ג/ק"ג). בתוך 24 שעות של LPS מינהל, זרם neutrophilic נראתה בריאות, כפי שמוצג באיור 1A. העכבר BAL נוזל נמשך, ואחריו בידוד, טיהור של exosomes. המורפולוגיה של BALF exosomes אושר ע י שידור מיקרוסקופ (איור 1B).
ביטוי סלקטיבי miRNAs הפרו דלקתיים miRNA-155 מיר-146a התגלו על ידי q-RT-PCR מ exosomes מטוהרים. רמות ה...

עכברים נחשפים LPS בקרום הבטן מפרישים exosomes בנוזל שטיפה (BAL) Broncho-מכתשי הארוזים עם miRNAs. באמצעות מערכת תרבות משותפת, אנו מראים כי exosomes שוחרר בנוזל BAL לשבש את הביטוי של צומת חזק חלבונים בתאי אפיתל הסמפונות ולהגדיל את הביטוי של ציטוקינים פרו-דלקתיים זה להדגיש פגיעת ריאות.

Exosomes Bronchoalveolar שטיפה בפציעה ליפופוליסכריד-induced ריאות זיהומית

Acute lung injury (ALI) and acute respiratory distress syndrome (ARDS) represent a heterogeneous group of lung diseases which continues to have a high ...

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לתאר את תפקידם של אקסוזומים בתגובות הדלקתיות במודל עכברי פגיעה ריאתית ספטית חריפה המושרה על ידי LPS. אז שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח הקשורות לדיבור צולב בין תאים בפגיעה ריאתית חריפה ותסמונת מצוקה נשימתית חריפה. במיוחד תקשורת בין-תאית בתוך הסביבה המכתשית-מיקרו באמצעות העברת אקסוזומים.היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת בידוד ואפיון של אקסוזומים של שטיפת סימפונות מטוהרים מאוד שמקורם בעכברים ספטיים שטופלו באנדוטוקסין עם פגיעה ריאתית חריפה. מדגימים את ההליך ד"ר ג'יהונג יואן וד"ר צ'טנה בדי. כדי להתחיל, טען מזרק מיליליטר אחד המצויד במחט 27 עם 0.1 מיליליטר LPS ו-PBS לכל עכבר ורסן ידנית את העכבר השחור C57 6J הזכר הראשון בן שישה עד שמונה שבועות.העבירו את ה-LPS תוך הצפק והחזירו את החיה לכלוב שלה. 24 שעות לאחר מכן, בצעו חתך של חמישה מילימטרים במרכז הצוואר של החיה הראשונה והשתמשו במלקחיים קהים כדי להפריד בעדינות את השרירים כדי לחשוף את קנה הנשימה. לאחר מכן, הכנס בעדינות מחט בגודל 27 המחוברת למזרק סטרילי של 10 מיליליטר לקנה הנשימה והזריק מיליליטר אחד של PBS סטרילי.לאחר מכן החלף מיד את מזרק ה-10 מיליליטר במזרק של שלושה מיליליטר המצויד במחט חדשה בגודל 27. שאפו את נוזל שטיפת הסימפונות או BOLF והוסיפו את ה-BOLF לצינור חרוטי של 15 מיליליטר המסומן כראוי על קרח. כדי לבודד את האקסוזומים, צנטריפוגה את דגימות ה-BOLF והעבירו את הסופרנטנטים לצינורות חדשים של 15 מיליליטר.צנטריפוגה שוב את הדגימות והעבירה את הסופרנטנטים לצינורות אולטרה-צנטריפוגות כדי להסיר את החלקיקים התאיים הגדולים יותר. העבירו את הסופרנטנטים לצינורות חרוטיים חדשים וטענו את הדגימות למסנני מזרק של 0.2 מיקרון כדי להסיר את כל החלקיקים הגדולים שנותרו. הוסף את הדגימות המסוננות לצינורות אולטרה-צנטריפוגות חדשים כדי לגלול את האקסוזומים.השליכו בזהירות את הסופרנטנטים ותלו מחדש את הכדורים ב-100 מיקרוליטר PBS לכל צינור. לאחר מכן העבירו את דגימות האקסוזום לצינורות בודדים של 1.5 מיליליטר לאחסון מינוס 80 מעלות צלזיוס. כדי לטהר את האקסוזומים, הוסף 0.4 מיקרוליטר של צבע האקסוזום המתאים לצינור אחד המכיל 100 מיקרוליטר של תמיסת תרחיף לדגימה והוסף במהירות דגימת אקסוזום מופשרת אחת לכל שפופרת צבע.מערבבים היטב את האקסוזומים עם הצבע ודוגרים את הדגימות בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות, מוגנות מפני אור. בתום הדגירה, הנח עמודת ספין אקסוזום אחת לכל דגימה לתוך צינור אשליה של 1.5 מיליליטר והעביר את תמיסות האקסוזום למרכז כל עמוד ספין. לאחר מכן צנטריפוגה של הדגימות, השליכו את העמודות ואחסנו את הדגימות המרומזות במינוס 20 מעלות צלזיוס.כדי למדוד את ספיגת האקסוזומים על ידי תאים מקבלים, זרע ראשון אחד כפול 10 עד אפיתל ריאות העכבר הרביעי 12 תאים ב-0.5 מיליליטר מדיום לכל באר של מגלשת תא שמונה בארות לתרבית של 16 שעות ב-37 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו חמצני. לאחר ההפשרה, הוסיפו 10 מיקרוליטר מהאקסוזומים הפלואורסצנטיים המטוהרים לכל באר והחזירו את תרביות התאים לחממה למשך שעה. בתום הדגירה יש לשטוף את התאים עם PBS ולתקן כל תרבית משותפת עם 1% פרפורמלדהיד למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.הסר את המדיום ולאחר מכן הרכיב את השקופית עם מדיום בתוספת DAPI וצלם את הדגימות במיקרוסקופ פלואורסצנטי בהגדלה של פי 40. כדי לאמת אינטראקציה אקסוזומית עם תאים מקבלים, זרע פעמיים כפול 10 עד אפיתל ריאת העכבר החמישי 12 תאים בשני מיליליטר מדיום לבאר בצלחת תרבית של 12 בארות המכילה את מדיום התרבית המתאים לדגירה של שעתיים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. בתום הדגירה מוסיפים 20 מיקרוגרם אקסוזומים לשלוש בארות של תאי אפיתל לכל קבוצת ניסוי ומחזירים את התאים לחממה.לאחר 24 שעות, הסר את המדיום, שטוף את התאים עם PBS והוסף 600 מיקרוליטר של מאגר ליזה לכל באר בניעור עדין. לאחר מכן העבירו את כל התוכן של כל באר לצינורות בודדים של 1.5 מיליליטר ונתחו את הדגימות על פי פרוטוקולי ה-PCR הסטנדרטיים בזמן אמת. תוך 24 שעות ממתן LPS, נצפה זרם נויטרופילי בריאות של בעלי חיים שטופלו ב-LPS.לאחר בידודם וטיהורם כפי שהודגם זה עתה, ניתן לאשר את נוכחותם של אקסוזומים ב-BOLF מבעלי חיים עם פגיעות ריאה ספטיות על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת. הביטוי של מיקרו RNA פרו-דלקתי נבחר מוגבר באופן משמעותי באקסוזומים של נוזל הסימפונות מבעלי חיים שטופלו ב-LPS בהשוואה לעכברים מבוקרים שטופלו ב-PBS. אקסוזומים שטופלו ב-LPS נקלטים על ידי תאי אפיתל של סימפונות עכברים, כפי שמעיד הלוקליזציה המשותפת של אקסוזומים המסומנים בצבע פלואורסצנטי עם תאים מסומנים ב-DAPI לאחר שעה אחת של תרבית משותפת.ביטוי מתווך פרו-דלקתי מוגבר באופן משמעותי בתאי אפיתל בתרבית משותפת עם אקסוזומים מבעלי חיים שטופלו ב-LPS בהשוואה לתרבית משותפת עם אקסוזומים מעכברי ביקורת שטופלו ב-PBS. יתר על כן, תאים שטופלו באקסוזומים מעכברים שטופלו ב-LPS מדגימים ביטוי מוחלש משמעותית של זונולה אוקלודנס בהשוואה לבקרות המצביע על שלמות תאים פחות שלמה לאחר תרבית משותפת של אקסוזומים שטופלו ב-LPS. ניתן להשלים את ההזרקה התוך-צפקית של LPS, מיצוי שטיפת הסימפונות והאצלת אקסוזומים משטיפת הסימפונות את כל השלבים בפרק זמן קצר יחסית.לאחר הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו אקסוזום ותרבית משותפת של תאי אפיתל כדי לענות על שאלות נוספות לגבי הדיבור ההדדי בין תאים מולדים ומבניים במיקרו-סביבה המכתשית של הריאה. דיבור צולב בין תאים חיסוניים מולדים ותאים מבניים באמצעות דילוג אקסוזומי תורם לתגובה הדלקתית ולשיבוש המחסום המבני, מה שמצביע על כך שמיקוד מיקרו-RNA אקסוזומי עשוי לספק פלטפורמה נורמלית לטיפול בפגיעה ריאתית חריפה ותסמונת מצוקה נשימתית חריפה. לאחר צפייה בסרטון זה אתה אמור להבין היטב כיצד לגרום לפגיעה ריאתית ספטית בעכברים, לבודד נוזל שטיפת סימפונות מעכברים, לבודד אקסוזומים מנוזל השטיפה ולהשתמש במודל תרבית משותפת לחקירת דיבור צולב תוך-תאי.אל תשכח שעבודה עם LPS עלולה להיות מסוכנת וכי תמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון לבישת ציוד המגן האישי המתאים בעת ביצוע הליך זה.

bronchoalveolar-lavage-exosomes-lipopolysaccharide-induced-septic

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

Source: Yuan, Z., et al. Bronchoalveolar Lavage Exosomes in Lipopolysaccharide-induced Septic Lung Injury. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates an in vivo mouse model for inducing and analyzing acute lung injury (ALI) using intraperitoneal administration of bacterial lipopolysaccharide. The inflammatory cascade triggered by alveolar macrophages and neutrophils leads to epithelial and endothelial barrier disruption, allowing fluid and immune cells to accumulate in the alveoli. Alveolar...

Lipopolysaccharide-Induced Acute Lung Injury in Mice for Exosome and Immune Analysis

התגובה החיסונית המארחת לזיהום הפתוגן היא תהליך מוסדר היטב. ניצול מודל חשיפת ריאות lipopolysaccharide בעכברים, ניתן לבצע הערכות ברזולוציה גבוהה של המנגנונים המורכבים הקשורים להיווצרות מחלה.

הניצול של לוע התחתון Intratracheal PAMP מנהל ושטיפה ברונכואלוואולרית כדי להעריך את תגובת מארח חיסון של עכברים

אנו מתארים שיטה לגרימת דלקת ריאות neutrophilic על ידי אתגר לlipopolysaccharide תרסיס על ידי עִרפּוּל, מודל פציעת ריאות חריפה. בנוסף, טכניקות ניתוחיות בסיסיות לבידוד ריאה, אינטובציה לקנה הנשימה ושטיפה ברונכואלוואולרית הם גם תיארו.

שיטה ליצירת ריאות neutrophilia שימוש התרסיס lipopolysaccharide

lavages ריאתי חוזר בחזירים הרדימו לגרום לפציעת ריאות דומה היבטים מרכזיים של תסמונת מצוקה נשימתית חריפת אדם (ARDS). לשם כך הריאות lavaged שוב ושוב עם מי מלח 0.9% ב 37 מעלות צלזיוס. מטרת הפרוטוקול היא הקלה לשחזור של חילוף גזים ופרמטרים המודינמיים למחקר ARDS.

דלדול פעילי שטח הנגרמת שטיפה בחזירים כמודל של תסמונת מצוקה נשימתית חריפה (ARDS)

מצב בריאותי של הריאה משתקף על ידי סוג ומספר של תאים חיסוניים הנמצאים bronchioles של הריאה. אנו מתארים טכניקת שטיפה ברונכואלוואלית המאפשרת בידוד ומחקר של תאים לא דליקים וגורמים מסיסים ממערכת הנשימה התחתונה של עכברים.

ברונכאלווולאר של ריאות Murine כדי לנתח דלקת תאים דלקתית

כאן, אנו מתארים שני שלפוחית חוץ-תאית בידוד םילוקוטורפ אולטראפילטרציה צנטריפוגה, ultracentrifugation עם צפיפות צנטריפוגה הדרגתיות, לבודד שלפוחית חוץ-תאית מדגימות נוזלים שטיפה bronchoalveolar מאתר. השלפוחיות המוגלתיות חוץ-תאית נגזר נוזל שטיפת מאתר bronchoalveolar על ידי שתי השיטות לכמת, מאופיין.

בידוד של שלפוחית חוץ-תאי של נוזל שטיפה Bronchoalveolar מאתר באמצעות טכניקת צנטריפוגה אולטראפילטרציה

הציג כאן הוא צעד אחר צעד הליך כדי לגרום לפציעה ריאה חריפה בעכברים על ידי ישירה intratracheal ליפוסכאלפסיד ולבצע ניתוח FACS של דגימות דם, ברונמכתשי נוזל ששטיפה, ורקמות ריאות. מיניציה מינימלית, טיפול פשוט, תוכנות טובה, ו טיטור של חומרת המחלה הם יתרונות של גישה זו.

גרימת פציעה חריפה של הריאה בעכברים על ידי הישירה ליפופוליסכראסטיליאלגרלציה

אוזון משולב ועכברים חשופים אנדוטוקסין חיידקי מראים מוות תאי נרחב, כולל זה של נויטרופילים. ראינו התאמות תאיות כגון שיבוש של lamellipodia ציטוסלטל, ביטוי תאי מוגבר של subunit סינתאז V ATP מורכב β ואנגיוסטין בשטיפת ברונכו-מכתשית, דיכוי התגובה החיסונית ריאות וגיוס נויטרופילים מעוכבים.

הדמיה של התאמות תאיות ריאות במהלך אוזון משולב ו- LPS המושרה פגיעה ריאות חריפה מורין

במחקר זה, טכניקת החדרה אנדוטרכיאלית לא פולשנית הוכחה כמפתחת ALI בעכברים באמצעות לרינגוסקופ בסיסי להבטחת העברת LPS מדויקת לריאות. ה-LPS מושתל דרך צינור אנדוטרכיאלי באמצעות לרינגוסקופ. גודל הפגיעה בריאתיות מוערך במספר נקודות זמן.

מתן לא פולשני של ליפופוליסכריד באנדוטרכיה כדי לגרום לפגיעה ריאתית חריפה אצל מכרסמים

פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה transfecting siRNA ב cytotrophoblasts villous אדם המבודד טרי באמצעות microporation וזיהוי מתחמים-חלבון ה- DNA בתאים אלה. תאי transfected יכולים להיות במעקב על ידי כתם מערבי Emsa מנתח בזמן תרבות 4 ימים.

ניתוח Transfection siRNA ו Emsa על Cytotrophoblasts Villous אדם המבודד טרי

חקור את תפקיד האקסוזומים בפציעת ריאות חריפה המושרית על ידי LPS בעכברים. למד כיצד לבודד אקסוזומים משטיפה ברונכואלוולרית ולנתח את השפעתם על תאים אפיתליאליים ומולקולות דלקתיות.

Exosomes Bronchoalveolar שטיפה בפציעה ליפופוליסכריד-induced ריאות זיהומית

גלה סרטונים נוספים