Name: Fractionation subcellular של דגימות מדרכי העיכול טריים וקפואים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: למד שיטת פרקציה תת-תאית לדגימות ביופסיה ממערכת העיכול, טריות או קפואות. הפרוטוקול מפריד חלבונים ציטופלזמיים וגרעיניים לניתוח מיקום חלבונים במחקרים גסטרואנטרולוגיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחברים להכיר את הסיוע של לופז Ander ו Miren Telletxea הקלטה ועריכה וידאו. ACR ממומן על-ידי התחברות Ikerbasque של פרויקט מחקר שבסיסה Celiacos דה מדריד (ACM). מחדרהמלון הוא ממומן על ידי פרויקט ISCIII-PI16/00258, והיתה שותפה במימון מאת האיחוד האירופי ERDF/ESF "דרך להפוך את אירופה". הוא ממומן על ידי מענק פרוייקט מחקר 2015111068 של מחלקת הבריאות בסקית. IRG מלכה פרחיה נתמכים על ידי מענקים מלגת predoctoral את UPV/EHU והבסקים משרד החינוך, בהתאמה.

מחקר זה אושרה על-ידי קרוסס אוניברסיטת אתיקה המנהלים, ניתוחים בוצעו לאחר הסכמה מדעת היה המתקבלים בכל המקצועות או הוריהם.
1. ביופסיה אוסף
הערה: דגימות ביופסיה מן התריסריון דיסטלי של המטופלים מתקבלים במהלך אנדוסקופיה אבחון שגרתי ניהול ביופסיות הטווח בין 2 ו- 10 מ"ג במשקל. הרקמה ביופסיה היא רקמה מורכבת המורכב לסוגי תאים שונים לרבות אפיתל, מערכת החיסון ותאי אנדותל. הגסטרואנטרולוגיה קליניים לבצע אנדוסקופיה את הבאים הוקמה הנחיות קליניות.
<ol><li>הנח את הביופסיה על נייר סינון סטרילי רק לאחר אנדוסקופיה.</li>
	<li>להשתמש מלקחיים כדי להעביר את ביופסיות 1.5 mL צינורות, להשרות אותם עם PBS, ולמקם אותו לתוך cryotube.</li>
	<li>שמור צינורות על הקרח עד שהם מגיעים במעבדה.<ol>
<li>הפעל עיבוד של ביופסיות טריים באופן מיידי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ביופסיות קפוא, פלאש להקפיא את הביופסיה המכילים צינורות, לאחסן בחנקן נוזלי עד השימוש. הערה: חשוב לשמור על המדגם קפוא עד המאגר שהושלם קר 1 נוסף.</li>
</ol>2. מאגר הכנה
הערה: לפני שמתחילים, תוספת המאגרים כדלקמן.
<ol><li>להוסיף 1 מ"מ DTT (ריכוז סופי), מאגר פרוטאז, פוספטאז מעכב קוקטייל (1 x ריכוז סופי) למאגר היפוטוניק 1, hypertonic 2 (טבלה 1).<ol>
<li>להכין 1.5 מ של מאגר 1 ו- 150 µL מאגר 2 עבור דגימה. DTT יהיה למנוע החמצון של הדגימות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להכין מאגר שטיפת גרעינים על-ידי הוספת 1% דטרגנט (nonyl phenoxypolyethoxylethanol) כדי ריכוז סופי של 0.1% אל המאגר כבר שהושלם 1. להכין 1 מ"ל גרעינים מאגר שטיפת לדגימה.</li>
</ol>3. ביופסיה המגון
<ol><li>
ביופסיות טריים
	<ol>
<li>מקום איחדו חד פעמיים את המיקסר ממונע. לוודא איחדו יגיע לתחתית הצינור.</li>
		<li>להוציא את הביופסיה מ cryotube ולמקם אותו צינור 1.5 מ עם טיפ פיפטה.</li>
		<li>להוסיף 200 µL מאגר שהושלם 1 צינור 1.5 מ.</li>
		<li>Homogenize את הביופסיה עם איחדו עד הרקמה מופרת לחלוטין ולשמור אותו בקרח.</li>
		<li>לאחר כל והביופסיות הם הומוגני להמשיך בשלב 4. הערה: יש לשנות בקווקז חד פעמי בין ביופסיות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ביופסיות קפוא התראה: להתמודד עם חנקן נוזלי בקפידה; מגע של חנקן נוזלי עם העור או העיניים עלול לגרום פגיעה חמורה מקפיא. להגן על כפות הידיים והעיניים תמיד בעת עבודה עם חנקן נוזלי.<ol>
<li>קח כמה חנקן נוזלי בתוך קופסה לאחסון את cryotubes שאוחזר למיכל חנקן.</li>
		<li>למצוא את הביופסיה במיכל חנקן ולמקם את cryotube בתיבה עם החנקן הנוזלי. חזור על שלב זה עבור כל והביופסיות.</li>
		<li>להעביר את הביופסיה cryotube צינור 1.5 מ. הערה: ביופסיות תצורף הצינור קפוא. לדחוף את הביופסיה עם טיפ פיפטה סטרילי אז זה הם ינותקו מהצינור.</li>
		<li>להוסיף 200 µL מאגר שהושלם 1.</li>
		<li>Homogenize הרקמה באמצעות שהעקב ופצצות מרגמה עד הרקמה מופרת לחלוטין, שמירה על הטמפרטורה ב 4 מעלות צלזיוס לאורך כל ההליך. הערה: אל תתנו ביופסיות להפשיר לפני הוספת המאגר.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. ציטופלזמה בידוד
<ol><li>דגירה ביופסיה homogenized על קרח למשך 10 דקות.</li>
	<li>להוסיף 10 µL של 1% סבון (nonyl phenoxypolyethoxylethanol) כל דגימה כדי ריכוז סופי של 0.05%. הערה: תאים ויוצרים פרץ על ידי פירוק osmotic כמו הנוזל מתון ישבש את קרום התא.</li>
	<li>דגירה על קרח למשך 5 דקות.</li>
	<li>מערבולת בקצרה, צנטריפוגה ב 400 x g ב- 4 הלעפה תרוטרפמט למשך 2 דקות.</li>
	<li>לאחר vortexing, להסיר את תגובת שיקוע, להעביר אותו צינור נקי mL 1.5; זה יהיה השבר cytoplasmic. אל תמחק את גלולה.</li>
</ol>5. גרעיני בידוד
<ol><li>Resuspend בגדר מהשלב הקודם עם 200 µL גרעינים שטיפת המאגר.</li>
	<li>Centrifuge את הצינור למשך 2 דקות 400 x g ו- 4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>למחוק את תגובת שיקוע, חזור על התהליך הכביסה פעמיים נוספות. הערה: מנקי יסיר cytoplasmic זיהום בהשבר הגרעין.</li>
	<li>לאחר לשטוף את השלישי, resuspend בגדר ב 100 µL מאגר 2.</li>
	<li>לנער את הדגימה נמרצות ב 4 הלעפה תרוטרפמט במשך 30 דקות לחלופין, דגירה המדגם על קרח, מערבולת כל 5 דקות.</li>
	<li>לאחר טלטולים, centrifuge את הדגימה 10 דקות בשיא המהירות (> 12,000 x g) ו- 4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>לאחר vortexing, להעביר את תגובת שיקוע לתוך 1.5 נקי חדש. mL שפופרת. זה יהיה השבר הגרעין.</li>
</ol>6. חלבון כמת
הערה: לכמת את החלבונים עם bicinchoninic חומצה (BCA) חלבון assay ערכת. ריכוז חלבונים בהשברים ינוע בין 0.5 ל- 5 µg/µL, להיות נמוך השבר הגרעין (ראו טבלה 2 ריכוז חלבון הנובעת מ- 2 מ ג ביופסיות).
<ol><li>להכין עיקול רגיל עם כמויות (µg) אלבומין שור (BSA) שלהלן12: 0-0.5-1-2-3-4-5-6.</li>
	<li>הכינו את ריאגנטים הדרושים לשימוש µL 100 של המיקס הסופי BCA לדגימה.</li>
	<li>פיפטה 2 µL של כל שבר חלבון במנת טוב 96, להוסיף את תערובת BCA, בצע את הוראות היצרן עבור הקריאה.</li>
</ol>

<ol><li>Cox, B., Emili, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+subcellular+fractionation+and+protein+extraction+for+use+in+mass-spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Tissue subcellular fractionation and protein extraction for use in mass-spectrometry-based proteomics.</a> Nature Protocols. 1 (4), 1872-1878 (2006).</li>
<li>Itzhak, D. N., Tyanova, S., Cox, J., Borner, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global%2C+quantitative+and+dynamic+mapping+of+protein+subcellular+localization%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Global, quantitative and dynamic mapping of protein subcellular localization.</a> eLife. 5, (2016).</li>
<li>Preedy, V. R., Watson, R. R., Ronald, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPreedy%2C+VR+%22Methods+in+disease+investigating+the+gastrointestinal+tract%22">Methods in disease investigating the gastrointestinal tract</a>. , Greenwich Medical Media. (1998).</li>
<li>Alex, P., Gucek, M., Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+proteomics+in+the+study+of+inflammatory+bowel+diseases%3A+Current+status+and+future+directions+with+available+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammatory+bowel+diseases%22%5BJournal%5D)">Applications of proteomics in the study of inflammatory bowel diseases: Current status and future directions with available technologies.</a> Inflammatory bowel diseases. 15 (4), 616-629 (2009).</li>
<li>Ericsson, C., Franzén, B., Nistér, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frozen+tissue+biobanks.+Tissue+handling%2C+cryopreservation%2C+extraction%2C+and+use+for+proteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+oncologica+%28Stockholm%2C+Sweden%29%22%5BJournal%5D)">Frozen tissue biobanks. Tissue handling, cryopreservation, extraction, and use for proteomic analysis.</a> Acta oncologica (Stockholm, Sweden). 45 (6), 643-661 (2006).</li>
<li>Hoffmann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+application+of+a+subcellular+fractionation+method+to+kidney+and+testis+for+the+determination+of+conjugated+linoleic+acid+in+selected+cell+organelles+of+healthy+and+cancerous+human+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">New application of a subcellular fractionation method to kidney and testis for the determination of conjugated linoleic acid in selected cell organelles of healthy and cancerous human tissues.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 381 (6), 1138-1144 (2005).</li>
<li>Foster, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mammalian+Organelle+Map+by+Protein+Correlation+Profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Mammalian Organelle Map by Protein Correlation Profiling.</a> Cell. 125 (1), 187-199 (2006).</li>
<li>Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+fractionation+and+isolation+of+subcellular+proteins+from+tissue+or+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells.</a> MethodsX. 2, e440-e445 (2015).</li>
<li>Börner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+protein+extraction+from+human+pancreatic+cancer+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Subcellular protein extraction from human pancreatic cancer tissues.</a> BioTechniques. 46 (4), 297-304 (2009).</li>
<li>Antalis, T. M., Shea-Donohue, T., Vogel, S. N., Sears, C., Fasano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+disease%3A+protease+functions+in+intestinal+mucosal+pathobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+clinical+practice.+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of disease: protease functions in intestinal mucosal pathobiology.</a> Nature clinical practice. Gastroenterology. 4 (7), 393-402 (2007).</li>
<li>Cutler, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCutler%2C+P+%22Protein+purification+protocols%22">Protein purification protocols</a>. , Humana Press. (2004).</li>
<li>Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Bicinchoninic+Acid+%28BCA%29+Assay+for+Protein+Quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Protein+Protocols+Handbook%22%5BJournal%5D)">The Bicinchoninic Acid (BCA) Assay for Protein Quantitation.</a> The Protein Protocols Handbook. , 11-14 (1996).</li>
<li>McLane, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+localization+of+T-bet+and+Eomes+in+CD8+T+cell+memory+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology+%28Baltimore%2C+Md.%3A+1950%29%22%5BJournal%5D)">Differential localization of T-bet and Eomes in CD8 T cell memory populations.</a> Journal of immunology (Baltimore, Md.: 1950). 190 (7), 3207-3215 (2013).</li>
<li>Nguyen, K. T., Holloway, M. P., Altura, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CRM1+nuclear+export+protein+in+normal+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+biochemistry+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">The CRM1 nuclear export protein in normal development and disease.</a> International journal of biochemistry and molecular biology. 3 (2), 137-151 (2012).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

הפרוטוקול המתואר כאן משמש את fractionation גרעינית, cytoplasmic של ביופסיות מעיים. החלבונים מטוהרת הם לא שפגע בסימני והוא יכול לשמש לא רק בניתוח תספיג כמוצג באיור 2 ו- 3 אלא גם מבחני הדורשים מקופלת מקורי חלבונים כגון immunoprecipitation, electrophoretic ניידות shift assay (EMSA) או יליד לזיהוי בג'ל (עמוד).
השיטה המתוארת מסתמך על המגון מכני של הרקמה יחד עם פירוק osmotic להתפוצץ קרום התא מבלי להשפיע על קרום גרעיני. התוצאה היא fractionation נקי של שנ...

חלבונים להשתתף כמעט את כל הפונקציות הביולוגי בתוך תא, כל וריאציה במבנה שלהם, כמות או מיקום יכול להוביל תרחיש פתוגניים. רקמות מדגם fractionation שיטות הן בגישה שימושי כדי להפחית את המורכבות של מחלות הקשורות חלבון ניתוחים. מספר מחקרים להשתמש במידע לוקליזציה חלבון או להעשיר את חלבון מתא סלולרית ספציפית, אז עבור fractionation לשחזור של חלבונים שלמים פרוטוקול זה שימושי לענות על שאלות ביולוגיות מסוימות. לקביעת ההתאמה subcellular של חלבונים וניטור הפצה compartmental או אינטראקציות על הבסיס שלהם תנאים המחלה תסייע לזהות מחלה הקשורה הבדלים תפקודיים1,2. לכן, בשיטה זו שואפת reproducibly fractionate רקמת המעי ביופסיות, טריים וקפואים, לתוך תאים subcellular cytoplasmic וגרעיני.
דגימות הביופסיה מעיים מתקבלים באופן שגרתי במהלך אנדוסקופיה הליכים3 (איור 1), יכול לשמש ביעילות עבור כימות חלבון או לימודים immunoprecipitation. מאז דגימות רקמה מן המעי אפיתל יכיל חלבונים אשר עשויים להיות מעורבים ישירות בפתוגנזה המחלה4, דגימות ביופסיה מעיים הם מקור חשוב מאוד לצורך זיהוי מוצלח מעיים מחלות ספציפיות חלבונים. דגימות רקמה, החולה קפוא מאוחסנים יחד עם המידע הקליני הם משאבים שימושיים עבור חלבונים, הכנה מדגם לשחזור ופשוט הוא סוגיה מרכזית לספק מידע compartmental תא באמצעות הגבלת כמויות קפוא רקמות5.
ישנם מספר ערכות זמינים מסחרית לצורך הקמת מכשול ההפרדה של שברים הסלולר, אבל אלה יקרים יותר, בדרך כלל זמן רב יותר מאשר בפרוטוקול המוצג כאן. פרוטוקולים בהתבסס על צנטריפוגה הדרגתיים מרובים-צעד, מעברי צבע רציף גם בעבר שימשו את fractionation של מגוון התאית בתאים ברקמות שונות6,7. עם זאת, שמירה על מרקם של מעברי צבע רציף לעתים קרובות משימה קשה. פרוטוקולים דומה המבוסס על פירוק רציפים של ממברנות תוארו קודם לכן אבל הם בדרך כלל צריך יותר משני מאגרי, הידיים בזמן הוא עוד8 .
כאשר fractionating דגימות רקמה, לזכור את הרקמה הזאת דגימות נוכח תא התא, התא-מטריקס אינטראקציות כי הן לא נוכח בתאים בתרבית חשוב בעת הליך שאיבת חלבון. פירוט נאותה בין תאים מטריצה חוץ-תאית מבלי להשפיע על איכות החלבון יהיה גורם קריטי ב בידוד חלבון9רקמת המעי. ב פרוטוקול זה, אנשי קשר תא התא, התא-מטריקס הם קודם שבור, משחררים את התאים ומאפשר את המאגר להגיע אל התאים הבודדים. כדי למנוע ערבוב לפני fractionation חלבון-תא, פירוט של אנשי הקשר להתרחש מבלי לשנות את התקינות של התאים או את הקרומים גרעיני.
בשל העשרת של פרוטאזות שונים רירית המעי10, חשוב לשלוט השפלה חלבון במהלך החילוץ. כדי למזער את ההשפלה חלבון פוטנציאליים, מעכבי פרוטאז מרובים חייבים להיכלל במאגרי מיצוי חלבונים. בנוסף, אם תמציות עומדים לשמש עבור מבחני פונקציונלי, זה חיוני כדי למנוע את דנטורציה של חלבונים או proteolysis כמו זה יגרום לאובדן חלבון פעילות11. למטרה זו, הפרוטוקול מבוצע ב 4 ° C, phenylmethylsulfonyl טריים פלואוריד (PMSF) מתווסף המאגרים-ריכוז סופי של 0.1 מ מ רק לפני השימוש כדי לעכב עוד יותר proteolysis.
הצעד הראשון תא fractionation הוא שיבוש רקמות פירוק התא. כאמור, המטרה היא disaggregate את התאים ואת לשבור שאותם לפתוח במינימום נזקים. דגימות רקמה מעיים חייבת להיות הומוגני, התאים lysed כדי להשיג שבירה המרבי של קרום התא. ב פרוטוקול זה, אנו משתמשים במערבל שהעקב ממונע לשבור רקמת המעי אשר הוא הומוגני תוך שניות על-ידי פעולה vortexing במהירות גבוהה. לאחר המגון, תאי הרקמות מודגרת בתוך מאגר היפוטוניק יפרץ קרום התא, אך ימנע הגרעינים שלמים, ואחריו תוספת של חומר ניקוי denaturing (nonyl phenoxypolyethoxylethanol) מערבולת קצר להפרדת הגרעינים מתוך השבר cytoplasmic. לאחר הסרת הציטופלסמה, קרום גרעין התא הוא פרץ לתוך מאגר hypertonic ברעידות.
השיטה המוצגת כאן היא שיטה המתאימה עבור fractionation subcellular של ביופסיות מעיים טריים וקפואים זה הושגו במהלך הליכי אנדוסקופי, נע בין 2 ו- 10 מ"ג במשקל. את הפרוטוקול היא קלה, לשחזור ואת יכולה להתבצע באמצעות מכשור מעבדתי בסיסי, ריאגנטים בתוך פחות משעה.

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034-1kg</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9333-1kg</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E9884-100G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>5588886-1kg</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10197777001</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Thermo Scientific</td><td>36978</td><td></td></tr><tr><td>מעכבי פרוטאינאז ופוספטאז</td><td>Thermo Scientific</td><td>A32959</td><td></td></tr><tr><td>NP-40&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CA-630</td><td>חומר ניקוי</td></tr><tr><td>BCA מבחן Thermo</td><td>Scientific</td><td>23227</td><td>ערכת כימות חלבון</td></tr><tr><td>עלי פלסטיק חד פעמיים</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z359947-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Dounce הומוגנייזר</td><td>VWR</td><td>431-0100</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוצנטריפוגה</td><td>Eppendorf</td><td>5415-R</td><td></td></tr><tr><td>שייקר</td><td>IKA</td><td>MS3 בסיסי</td><td></td></tr></tbody></table>

fractionation subcellular של דגימות מדרכי העיכול טריים וקפואים

Subcellular Fractionation from Fresh and Frozen Gastrointestinal Specimens

המטרה של פרוטוקול זה היא fractionate רקמה אנושית מעיים מתקבל על ידי אנדוסקופיה לתוך תאים גרעינית, cytoplasmic לניתוח לוקליזציה של חלבונים ספציפיים או חלבון מתחמי במדינות רקמות שונות (קרי, בריא נגד המחלה). שיטה זו שימושית עבור fractionation של שתי דגימות רקמה מעיים טריים וקפואים; זה נגיש עבור כל המעבדות לא זמן רב.

איור 1 מראה של צביעת אאוזין hematoxylin של מקטע המעי ביופסיה עם שלם villi ומבנים הקריפטה.
התוצאות נציג של fractionation גרעינית, cytoplasmic באמצעות פרוטוקול זה מוצגים נתוני 2 ו- 3. בניסוי שמוצג באיור 2, רעננה (Fh) ו- (Fz) קפוא ביופסיה בעת ובעונה אחת היו fractionated בעקבות פרוטוקול המובאת כאן, אבן חשופה המערבית התבצע בעזרת μg 20 של כל ...

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לביצוע של fractionation סלולרית פשוטה לצורך הקמת מכשול ההפרדה subcellular של חלבונים cytoplasmic וגרעיני ב אנושי ביופסיות מעיים טריים וקפואים.

Fractionation subcellular של דגימות מדרכי העיכול טריים וקפואים

The purpose of this protocol is to fractionate human intestinal tissue obtained by endoscopy into nuclear and cytoplasmic compartments for the ...

מטרת הפרוטוקול הבא היא ליצור שברים תת-תאיים מדגימות קפואות או טריות במערכת העיכול. חלבונים לוקחים חלק כמעט בכל התפקודים הביולוגיים שלך בתוך התא. בכל וריאציה שהם מופקים בין מיקום יכול להוביל לתרחיש פתוגני.מחקרים מסוימים ינצלו את הערכת לוקליזציה של חלבון או יצטרכו לפלוש לחלבון מתא תא ספציפי. לכן הפיצול הניתן לשחזור של חלבונים שלמים חשוב מבחינה זו. דגימות ביופסיה של המעי ניתנות להשגה לאחרונה במהלך הליכי אנדוסקופיה וניתן להשתמש בהן ביעילות לכימות חלבונים או מחקרי משקעים חיסוניים.דגימות מעיים קליניות הן משאב חשוב לזיהוי יעיל של רקמות וחלבונים ספציפיים למחלה. שמה של שיטה זו הוא פיצול רקמת מעי אנושית המתקבלת על ידי אנדוסקופיה לתאים גרעיניים וציטופלזמיים לצורך ניתוח לוקליזציה של חלבון או מתחמי חלבון ספציפיים. שיטה זו משמשת לפיצול של שניהם.ראשית, מתרחשת ביוזה של המעי הקפוא שלנו. להליך הרקמה הקפואה, יש להקפיא דגימות מיד לאחר המיצוי ולאחסן בחנקן נוזלי עד לשימוש. חשוב לשמור על הדגימה קפואה עד להוספת מאגר ההומוגניזציה הקרה.לדגימות טריות, העבירו את הביופסיה למיקרו-צינור של 1.5 מ"ל והמשיכו על קרח עד לתחילת ההליך. דגימות רקמה קפואות מחוברות בדרך כלל לדופן הצינור הקריוטיוב, ניתן לשחרר את הרקמה באמצעות קצה פיפטה סטרילי לפני העברתה למיקרו-צינור חרוטי של 1.5 מ"ל. הוסף 200 מ"ל של בופר, אחד בתוספת DDT ומעכבי פוספטאז ופרוטאז למיקרו-צינור המכיל את הדגימה.הומוגניזציה של הדגימה עם כלי עד שהרקמה מופרעת לחלוטין ושמור אותה על קרח. דגרו את הדגימה על קרח למשך 10 דקות. הוסף 10 מ"ל של חומר ניקוי 1 אחוז לכל דגימה לריכוז סופי של 0.05 אחוז על מנת לשבש את קרום התא.דגירה על קרח במשך חמש דקות. מערבולת קצרה וצנטריפוגה ב -400 גרם ב -4 מעלות למשך שתי דקות. הסר את הסופרנטנט המכיל את חלק החלבון הציטופלזמי והעביר אותו לצינור נקי.אין להשליך את הגלולה. Re השעו את הגלולה ב-200 מ"ל של בופר שניים בתוספת DDT ומעכבי פוספטאז ופרוטאז. צנטריפוגה בחום של 400 גרם למשך 2 דקות.השלך את הסופרנטנט וחזור על הליך הכביסה פעמיים נוספות. לאחר הכביסה השלישית, השעו מחדש את הגלולה ב-100 מ"ל של מאגר שתיים. לנער במרץ בחום של 4 מעלות למשך 30 דקות.צנטריפוגה בחום של 4 מעלות במהירות מרבית למשך 10 דקות. העבירו את הסופרנטנט המכיל את חלק החלבון הגרעיני לצינור נקי. שברים ציטופלזמיים וגרעיניים מוכנים כעת לכימות ולניסויים במורד הזרם.רירית המעי עשירה במספר פרוטאזות ולכן יש לשלוט בפירוק החלבון במהלך המיצוי על מנת למזער את פירוק החלבון, יש לכלול מעכבי פרוטאז מרובים במאגרי מיצוי החלבון. בנוסף, התמציות ישמשו לבדיקות נוספות. חיוני להימנע מנטורציה של חלבון או פרוטאוליזה.מכיוון שהדבר גורם לאובדן פעילות החלבון. כתוצאה ממגעי התא-תא ומטריצת התא הקיימים ברקמות, יש ליישם שינויים מסוימים בפרוטוקולי מיצוי החלבון המשמשים באופן שגרתי בתרביות תאים. הפרדת התאים מהמטריצה הטרנס-תאית מבלי להשפיע על איכות החלבון היא גורם קריטי לבידוד יעיל של חלבוני רקמת המעי.משמאל, הטבלה מציגה את ריכוזי החלבון של כל אחד מהשברים מדגימות הביופסיה הטריות והקפואות של 2 מ"ל. הריכוזים מוצגים במיקרוגרם למיקרוליטר. בניסוי זה, דגימה טרייה וקפואה חולקה בו זמנית בהתאם לפרוטוקול.וכתם מערבי בוצע באמצעות 20 מ"ג מכל דגימה. כדי לבדוק את טוהר השברים, HSP90 וטובולין שימשו כבקרות ציטופלזמיות ו-HDAC1 ו-H3 כבקרות גרעיניות. כפי שניתן לראות, HSP90 וטובולין ממוקמים בעיקר בציטופלזמה ו-HDAC1 ו-H3 בגרעין עם ערבוב שיורי מאוד בין שני השברים.כדי לראות אם הפרוטוקול משפיע על מוות תאי, זיהינו גם CASP3. שתי הדגימות מציגות צביעה מינימלית מאוד עבור CASP3 המאשרת כי ההליך אינו משפיע על מסלול המוות התאי גם לאחר הקפאת הבזק של הביופסיות. הדגימות הקפואות ששימשו בניסוי זה הגיעו מאדם עם מצב דלקתי במעי וכצפוי, pSTAT1 מופיע בציטופלזמה של דגימה זו, ומאשר שהשינויים בחלבון נשמרים לאחר הפיצול, ולכן ניתן להשתמש בהם לניתוח פונקציונלי במורד הזרם.שחזור התוצאות בביופסיות קפואות מוצג באיור זה. השברים נקיים עם ערבוב מינימלי של חלבון בתא. ביופסיות טריות וקפואות יכולות לשמש באותה מידה בפרוטוקולים אלה, כאשר ביופסיות קפואות נותנות תוצאות נקיות וניתנות לשחזור כפי שניתן לראות באיור 1 ו-2.הפרוטוקול המתואר כאן נועד ליצור את שברי החלבון האפשריים. עם זאת, שונות מהותית מסוימת בתוך הדגימה כולל גודל ומצב הרקמה עלולה להוביל לסטיות בכמויות החלבון ובכמויות ההתפלגות בשברים.

subcellular-fractionation-from-fresh-frozen-gastrointestinal

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

ב חלוקה subcellular באתרו של בתאי יונקים על coverslips מיקרוסקופ מאפשר הדמיה של לוקליזציה חלבון.

ב ההיפוך חלוקה subcellular באתרו של בתאי יונקים חסיד שאינן חסיד

סרטון זה מתאר את הפרוטוקול לבידוד גרעינים בודדים מרקמת גליומה טרייה קפואה. הגרעינים הבודדים יכולים לשמש כדגימות לטכניקות ריצוף כגון ריצוף RNA של גרעינים בודדים (snRNA) ובדיקת גרעינים בודדים לריצוף כרומטין נגיש טרנספוזאז (snATAC) כדי לקבל תובנות עמוקות יותר לגבי הטרוגניות בין ותוך גידולים שנצפתה בגליומה של רקמות העצבים המרכזיות.

בידוד גרעינים מרקמות גליומה טריות קפואות: שיטה להשגת גרעינים שלמים מדגימות גידולי גליומה

כאן אנו מתארים שיטה פשוטה לבידוד של תאי פני השטח של המעי הגס של עכברים מובחנים מרחבית מתאי בסיס הקריפטה הבסיסיים.

Cryosectioning שיטה לMicrodissection של Murine גס רירית

כאן, מוצג פרוטוקול לבידוד והקמת תרביות פיברובלסטים/מיופיברובלסטים ראשוניים (MF) מתאי קיבה, מעי דק ורקמות מעי גס קפואים עם פנוטיפ MF. תאים אלה מבטאים CD90, α-SMA ווימנטין. MFs יכולים לשמש למגוון בדיקות פונקציונליות כולל פעילות אנזימטית וייצור ציטוקינים.

בידוד של פיברובלסטים / myofibroblasts 90 + CD מאדם דוגמאות במערכת העיכול קפוא

המטרה של פרוטוקול זה היא להשיג דגימות RNA גבוהה-שלמות של הגרעינים המעית מבודד מבולבל, resected טריים מעיים רקמה אנושית באמצעות לייזר לכידת microdissection (LCM). פרוטוקול זה כולל הכנת קפואה דגימות של רקמות אנושיות מעיים, cryosectioning, ethanolic מכתים, התייבשות, הפונקציה LCM, והפקת RNA.

אופטימיזציה של לכידת לייזר Microdissection עבור בידודו של הגרעינים המעית מרקמות אנושיות מוקפאות

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לבודד את קרום פלזמה, הציטופלסמה ואת המיטוכונדריה U937 תאים ללא שימוש צנטריפוגה במהירות גבוהה. טכניקה זו ניתן לטהר שברים subcellular הבאים בחינת לוקליזציה חלבון באמצעות immunoblotting.

תא Fractionation של תאים U937, בהעדר צנטריפוגה במהירות גבוהה

פרוטוקול זה מתאר מספר הליכים להכנת דגימות רקמה באיכות גבוהה קפואה בזמן נקרוזה לשימוש במערכת שביט להעריך נזק DNA: 1) רקמות טחון, 2) מגורד תאים אפיתל ממערכת העיכול, ו 3) לקוביות רקמה דגימות, הדורשות הומוגון באמצעות מכשיר משתמש ברקמה.

שימוש ברקמות קפואות בתוך שיטת שביט להערכת נזק לדנ א

הטרוגניות תוך-גידולית היא תכונה אינהרנטית של גידולים, כולל גליומות. פיתחנו פרוטוקול פשוט ויעיל המשתמש בשילוב של חוצצים וצנטריפוגה הדרגתית כדי לבודד גרעינים בודדים מרקמות גליומה קפואות טריות למחקרי רצף גרעין יחיד ו- ATAC.

בידוד גרעינים מגידולים טריים במוח קפוא ל-RNA-seq חד-גרעיני ו-ATAC-seq

פרוטוקול פיצול זה יאפשר לחוקרים לבודד חלבונים ציטופלסמיים, גרעיניים, מיטוכונדריאליים וממברנות מתאי יונקים. שני השברים התת-תאיים האחרונים מטוהרים עוד יותר באמצעות שיפוע צפיפות איזופיקני.

פיצול תאים של תאי U937 על ידי טיהור הדרגתי בצפיפות איזופיקנית

הפרוטוקול מספק גישה אמינה ואופטימלית לבידוד גרעינים מדגימות גידולים מוצקים לצורך ריצוף מולטיומי באמצעות פלטפורמת 10x Genomics, כולל המלצות לתנאי דיסוציאציה של רקמות, שימור בהקפאה של תרחיפים חד-תאיים והערכה של גרעינים מבודדים.

בידוד גרעינים אופטימלי מדגימות גידול מוצק טרי וקפוא לריצוף מולטיומי

אנו מתארים מודל מורין של אילאוס לאחר הניתוח שנוצר באמצעות מניפולציה במעיים. תפקוד המעבר במערכת העיכול, שינויים פתולוגיים והפעלת תאי מערכת החיסון הוערכו 24 שעות לאחר הניתוח.

מודל Ileus Murine לאחר הניתוח

למד שיטת פרקציה תת-תאית לדגימות ביופסיה ממערכת העיכול, טריות או קפואות. הפרוטוקול מפריד חלבונים ציטופלזמיים וגרעיניים לניתוח מיקום חלבונים במחקרים גסטרואנטרולוגיים.

Fractionation subcellular של דגימות מדרכי העיכול טריים וקפואים

גלה סרטונים נוספים