Name: ניתוח גנטי של Transthyretin Ala97Ser תורשתיות הקשורות עמילואידוזיס (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
Description: למד פרוטוקול לאבחון מוטציות נקודתיות בעמילואידוזיס תורשתי של טרנסתירטין באמצעות PCR ואלקטרופורזה על ג'ל אגרוז. השיטה מאפשרת זיהוי מוקדם של המוטציה Ala97Ser בנבדקים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מאחלים תודה גברת שין-כיף וו לה עזרה בניסויים. מחקר זה נתמך על ידי מענק של תכנית המחקר הרפואי של צ'נג קונג (CMRPG3C0371, CMRPG3C0372, CMRPG3C0373) ו IRB 100-4470A3, 104-2462A3, טייוואן.

בדיקה שבוצעה במעבדה בוצע בהתאם לדרישות של קלינית מעבדה שיפור תיקונים (CLIA) בשנת 1988, התקנות שאושרו על-ידי מוסדיים סקירה לוח של צ'נג קונג אנדרטת החולים ו האוניברסיטה (רשיון מס ' 100 - 4470A3 ו- 104-2462A3). הסכמה מדעת היה המתקבלים לכל החולים.
1. דם דוגמה אוסף
<ol><li>לאסוף דם לתוך צינורות שטופלו EDTA זמינים מסחרית. לערבב בעדינות, לאחסן דגימת דם ב 4 ° C עד עיבוד.</li>
</ol>2. DNA החילוץ מדם היקפי
להשתמש ערכת חילוץ DNA להפקת DNA גנומי (ראה טבלה של חומרים).
<ol><li>להוסיף 10 מ של פתרון 1 דגימת הדם 4.0 מ"ל. דגירה המדגם על קרח למשך 10 דקות.</li>
	<li>Centrifuge הדגימה ב g x 2,000 דקות 5-4 מעלות צלזיוס. להסיר ולמחוק את תגובת שיקוע בקפידה. Resuspend בגדר ב- 3 מ"ל של פתרון 1.</li>
	<li>Centrifuge המדגם-g x 2,000 עבור 5 דקות ב 4 ° C שוב ולמחוק את תגובת שיקוע. Resuspend בגדר ב- 3 מ"ל של פתרון 2.</li>
	<li>להוסיף 10 µL של pronase מניות פתרון (225 מ"ג/מ"ל) כדי לקבל ריכוז הסופי של µg 100/מ"ל ומערבבים היטב. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.</li>
	<li>להרגיע את הצינורית על קרח במשך 10 דקות הוסף 0.8 מ של פתרון 3 לדגימת, היפוך 3 - 5 פעמים. במקום מדגם על קרח למשך 5 דקות.</li>
	<li>Centrifuge הדגימה ב 3000 g x למשך 15 דקות ב 4 º C. להעביר בזהירות את תגובת שיקוע שפופרת צנטרפוגה חרוט סטרילי 15 מ"ל.</li>
	<li>הוסף µL 6 בפתרון RNase מניות (10 mg/mL) כדי לקבל ריכוז סופי של 20 µg/mL. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.</li>
	<li>להוסיף 2.5 מ ל אלכוהול איזופרופיל, לערבב היטב על-ידי היפוך בעדינות מספר פעמים, כדי לזרז את הדנ א (קווצות חומר לבן, צימרי, דמויי אניץ יהוו). שימוש pipet נשא גדול, להעביר את precipitant DNA שפופרת צנטרפוגה 1.5 mL החדש.</li>
	<li>צנטריפוגה ב 12,000 x g עבור מינימום 3-4 מעלות צלזיוס. תבטל את תגובת שיקוע בקפידה. צניפה לשטוף את הדנ א על-ידי הוספת µL 500 של 70% אתנול.</li>
	<li>תגובת שיקוע צנטריפוגה-g x 12,000 עבור 1 דקות וזורקים. האוויר יבש DNA צניפה בטמפרטורת החדר. להוסיף 100 µL של ddH2O, דגירה-65 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות עד resuspend ה-DNA.</li>
</ol>3. הדנ א כמת
להשתמש ספקטרופוטומטרים (ראה טבלה של חומרים) כדי לזהות את כמות ואיכות הדנ א הגנומי.
<ol><li>להיכנס לתוך המחשב מחובר למכונה ספקטרופוטומטרים. פתח את התוכנה.</li>
	<li>אתחול המכשיר ספקטרופוטומטרים:<ol>
<li>לחץ על "חומצת גרעין" על התוכנה ספקטרופוטומטרים.</li>
		<li>לנקות את המעמד עם מגבון נייר חד פעמיות, מים מורתחים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>בלנק ספקטרופוטומטרים:<ol>
<li>לטעון את 2 µL של מים מטוהרים על הכן.</li>
		<li>הנמך את הזרוע העליונה של ספקטרופוטומטרים ולחץ על "ריק" לכיול.</li>
		<li>כאשר זה נעשה, להרים את הזרוע ויבש את המעמד עם מגבון.</li>
	</ol>
</li>
	<li>למדוד את הדגימה:<ol>
<li>לחץ על "ה-DNA-50" על סוג הדגימה.</li>
		<li>לטעון µL 2 של דנ א על הכן.</li>
		<li>להוריד את הזרוע ולחץ על "מדד" כדי למדוד את היחס A260/A280, הריכוז של המדגם.</li>
		<li>לנקות את המעמד בין כל הפעלה עם מגבון, מים מורתחים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לחץ על "Print Screen" כדי לאסוף את הנתונים.</li>
</ol>4. גנטית ניתוחים של מוטציות
להגביר את המטרה DNA עם ה-PCR4. לבצע PCR בתגובה 25 µL תערובת באמצעות של ה-DNA פולימראז קיט (ראה טבלה של חומרים). טבלה 1 מציגה הגן TTR תחל intronic.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>ג'ין</td>
			<td>פריימר רצף</td>
		</tr>
<tr>
<td>Exon1</td>
			<td>F: 5'-TCAGATTGGCAGGGATAAGC-3' R: 5'-GCAAAGCTGGAAGGAGTCAC-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td>Exon2</td>
			<td>F: 5'-TCTTGTTTCGCTCCAGATTTC-3' R: 5'-TCTACCAAGTGAGGGGCAAA-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td>Exon3</td>
			<td>F: 5'-GTGTTAGTTGGTGGGGGTGT-3' R: 5'-TGAGTAAAACTGTGCATTTCCTG-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td>Exon4</td>
			<td>F: 5'-GACTTCCGGTGGTCAGTCAT-3' R: 5'-GCGTTCTGCCCAGATACTTT-3'</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1. ג'ין TTR תחל intronic. (רצף ההתייחסות NCBI: NC_000018.10)
<ol><li>הוסף את ריאגנטים בטבלה מס ' 2 צינור PCR 0.2 מ"ל.</li>
</ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>רכיבים</td>
			<td>נפח (µL)</td>
			<td>ריכוז סופי</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 x מאגר</td>
			<td>2.5</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2 (25 מ מ)</td>
			<td>1.5</td>
			<td>1.5 מ מ</td>
		</tr>
<tr>
<td>משפר GC 360</td>
			<td>1</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>360 DNA פולימראז</td>
			<td>0.2</td>
			<td>2 U-תגובה</td>
		</tr>
<tr>
<td>dNTP מיקס (25 מ מ כל אחד)</td>
			<td>2</td>
			<td>2 מ מ</td>
		</tr>
<tr>
<td>פריימר F (10 מיקרומטר)</td>
			<td>1</td>
			<td>מיקרומטר 0.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>פריימר R (10 מיקרומטר)</td>
			<td>1</td>
			<td>מיקרומטר 0.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>דנ א (100 ng)</td>
			<td>2</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>כיתה ה-PCR מים</td>
			<td>13.8</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>הנפח הכולל</td>
			<td>25</td>
			<td>-</td>
		</tr>
</tbody></table>בטבלה 2. תנאי ריאקציה PCR.
<ol start="2"><li>לערבב בעדינות, צנטריפוגה בקצרה על צנטריפוגה benchtop כדי לאסוף את כל הרכיבים לתחתית הצינור. הכנס צינור thermocycler.</li>
	<li>לבצע PCR 30 מחזורים. כל מחזור מורכב צעד דנטורציה עבור 30 s ב 94 ° C, פריימר חישול ב-30 s-58 ° C ופולימראז סיומת עבור 45 s ב-72 מעלות (ראו טבלה 3).</li>
</ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>שלב</td>
			<td>טמפרטורה (° C)</td>
			<td>זמן</td>
			<td>מחזור</td>
		</tr>
<tr>
<td>דנטורציה הראשונית</td>
			<td>95</td>
			<td>5 דקות</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>שלב דנטורציה דנ א</td>
			<td>94</td>
			<td>30 s</td>
			<td>מחזורים</td>
		</tr>
<tr>
<td>שלב מחזק פריימר</td>
			<td>58</td>
			<td>30 s</td>
			<td>מחזורים</td>
		</tr>
<tr>
<td>שלב ההרחבה של פולימראז</td>
			<td>72</td>
			<td>45 s</td>
			<td>מחזורים</td>
		</tr>
<tr>
<td>שלב התארכות פוסט</td>
			<td>72</td>
			<td>10 דקות</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>סוף ה-PCR רכיבה על אופניים</td>
			<td>4</td>
			<td>לא מוגדר</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>בטבלה 3. תנאי הרכיבה עבור הגברה מוצרי ה-PCR.
<ol start="4"><li>לאמת את המוצר PCR דמיין עם אלקטרופורזה בג'ל:<ol>
<li>הכנת ג'ל 1.2% agarose:<ol>
<li>מערבבים 1.2 גר' אבקת agarose עם 100 מ של 0.5 x TBE בבקבוקון שניתן לחמם במיקרוגל. מיקרוגל למשך 2 דקות עד agarose זה התפרקה לחלוטין. לקרר את התערובת agarose עד 55 מעלות צלזיוס.</li>
			<li>להוסיף התערובת agarose 2 µL של אתידיום ברומיד פתרון (10 mg/mL) ומערבבים בעדינות. שופכים את התערובת agarose לתוך מגש ג'ל שבו כ 5-7 מ מ, ולאחר מכן להוסיף את comb(s) במקום. לאפשר את לחזק (לפחות 30 דקות), הסר בזהירות comb(s).</li>
		</ol>
</li>
		<li>דוגמיות ולהפעיל של ג'ל agarose:<ol>
<li>המקום ג'ל ומגש לתוך התא אלקטרופורזה. למלא את התא אלקטרופורזה 0.5 x TBE עד הג'ל מכוסה.</li>
			<li>בזהירות לטעון 2 µL של דנ א. לחץ דם 100 סולם (ראה טבלה של חומרים) לנתיב אחד של הג'ל כמו סמן גודל מולקולרי. עומס לצבוע/מדגם תערובת (5 µL של תמהיל המוצרים PCR עם µL 1 6 x צבע הטעינה) לתוך מסלולים נוספים.</li>
			<li>הפעל את אספקת החשמל. הפעל את הג'ל במשך 25 דקות ב- 100 וולט.</li>
			<li>להסיר את הג'ל מהתא אלקטרופורזה. דמיינו את שברי DNA תחת אולטרא סגול בכל מערכת הדמיה.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. רצפי DNA
<ol><li>לטהר PCR מוצרים באמצעות ערכת מסחרי, רצף מסחרית או עם ברצף אוטומטית (ראה טבלה של חומרים).</li>
	<li>להגיש רצפי לשרת NCBI הפיצוץ כדי להשוות שהשאילתה נוקלאוטיד מסדי הנתונים של נוקלאוטיד10. לאחר הצגת התוצאות, לבצע רצף היישורים ולזהות את השינוי הצפוי.</li>
</ol>

<ol><li>Planté-Bordeneuve, V., Said, G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22094129">Familial amyloid polyneuropathy.</a> The Lancet Neurology. 10 (12), 1086-1097 (2011).</li>
<li>Planté-Bordeneuve, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+treatment+of+transthyretin+familial+amyloid+polyneuropathy+with+tafamidis%3A+a+clinical+and+neurophysiological+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Long-term treatment of transthyretin familial amyloid polyneuropathy with tafamidis: a clinical and neurophysiological study.</a> Journal of Neurology. 264 (2), 268-276 (2017).</li>
<li>Nichols, W. C., Benson, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hereditary+amyloidosis%3A+detection+of+variant+prealbumin+genes+by+restriction+enzyme+analysis+of+amplified+genomic+DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Genetics%22%5BJournal%5D)">Hereditary amyloidosis: detection of variant prealbumin genes by restriction enzyme analysis of amplified genomic DNA sequences.</a> Clinical Genetics. 37 (1), 44-53 (1990).</li>
<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+Chain+Reaction%3A+Basic+Protocol+Plus+Troubleshooting+and+Optimization+Strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), e3998(2012).</li>
<li>Hsu, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+expressions+of+hereditary+Transthyretin+Ala97Ser+related+Amyloidosis+%28ATTR%29+in+Taiwanese%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurology%22%5BJournal%5D)">Phenotypic expressions of hereditary Transthyretin Ala97Ser related Amyloidosis (ATTR) in Taiwanese.</a> BMC Neurology. 17 (1), 178(2017).</li>
<li>Barroso, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+safety+and+efficacy+of+tafamidis+for+the+treatment+of+hereditary+transthyretin+amyloid+polyneuropathy%3A+results+up+to+6+years%5BTitle%5D)+AND+%22Amyloid%22%5BJournal%5D)">Long-term safety and efficacy of tafamidis for the treatment of hereditary transthyretin amyloid polyneuropathy: results up to 6 years.</a> Amyloid. 24 (3), 194-204 (2017).</li>
<li>Rapezzi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease+profile+and+differential+diagnosis+of+hereditary+transthyretin-related+amyloidosis+with+exclusively+cardiac+phenotype%3A+an+Italian+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Disease profile and differential diagnosis of hereditary transthyretin-related amyloidosis with exclusively cardiac phenotype: an Italian perspective.</a> European Heart Journal. 34 (7), 520-528 (2013).</li>
<li>Mariani, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotype-phenotype+correlation+and+course+of+transthyretin+familial+amyloid+polyneuropathies+in+France%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Genotype-phenotype correlation and course of transthyretin familial amyloid polyneuropathies in France.</a> Annals of Neurology. 78 (6), 901-916 (2015).</li>
<li>Hammarström, P., Jiang, X., Hurshman, A. R., Powers, E. T., Kelly, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence-dependent+denaturation+energetics%3A+A+major+determinant+in+amyloid+disease+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Sequence-dependent denaturation energetics: A major determinant in amyloid disease diversity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, suppl 4 16427-16432 (2002).</li>
<li>Johnson, M., Zaretskaya, I., Raytselis, Y., Merezhuk, Y., McGinnis, S., Madden, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NCBI+BLAST%3A+a+better+web+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">NCBI BLAST: a better web interface.</a> Nucleic Acids Research. 36, Web Server issue 5-9 (2008).</li>
<li>Fox, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next+generation+sequencing+for+the+detection+of+actionable+mutations+in+solid+and+liquid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Next generation sequencing for the detection of actionable mutations in solid and liquid tumors.</a> Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).</li>
<li>Date, Y., Nakazato, M., Kangawa, K., Shirieda, K., Fujimoto, T., Matsukura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+three+transthyretin+gene+mutations+in+familial+amyloidotic+polyneuropathy+by+analysis+of+DNA+extracted+from+formalin-fixed+and+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Neurological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Detection of three transthyretin gene mutations in familial amyloidotic polyneuropathy by analysis of DNA extracted from formalin-fixed and paraffin-embedded tissues.</a> Journal of the Neurological Sciences. 150 (2), 143-148 (1997).</li>
<li>Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., Madden, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer-BLAST%3A+a+tool+to+design+target-specific+primers+for+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction.</a> BMC Bioinformatics. 13, 134(2012).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MR+%22Molecular+cloning%3A+A+laboratory+manual%22">Molecular cloning: A laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2012).</li>
<li>Buckingham, L., Flaws, M. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBuckingham%2C+L+%22Molecular+diagnostics%3A+Fundamentals%2C+methods%2C+and+clinical+applications%22">Molecular diagnostics: Fundamentals, methods, and clinical applications</a>. , F.A. Davis Co. Philadelphia. (2012).</li>
<li>Tan, S. C., Yiap, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA%2C+RNA%2C+and+Protein+Extraction%3A+The+Past+and+The+Present%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedicine+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">DNA, RNA, and Protein Extraction: The Past and The Present.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2009, (2009).</li>
<li>Rapezzi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+cardiac+amyloidoses%3A+disease+profiles+and+clinical+courses+of+the+3+main+types%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Systemic cardiac amyloidoses: disease profiles and clinical courses of the 3 main types.</a> Circulation. 120 (13), 1203-1212 (2009).</li>
<li>Gertz, M. A., Dispenzieri, A., Sher, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25311231">Pathophysiology and treatment of cardiac amyloidosis.</a> Nature Reviews Cardiology. 12 (2), 91-102 (2015).</li>
<li>Vrana, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+diagnosis+and+typing+of+systemic+amyloidosis+in+subcutaneous+fat+aspirates+by+mass+spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Clinical diagnosis and typing of systemic amyloidosis in subcutaneous fat aspirates by mass spectrometry-based proteomics.</a> Haematologica. 99 (7), 1239-1247 (2014).</li>
<li>Nakamura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+new+transthyretin+variant+%28Ile49%29+in+familial+amyloidotic+polyneuropathy+using+electrospray+ionization+mass+spectrometry+and+nonisotopic+RNase+cleavage+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Heredity%22%5BJournal%5D)">Identification of a new transthyretin variant (Ile49) in familial amyloidotic polyneuropathy using electrospray ionization mass spectrometry and nonisotopic RNase cleavage assay.</a> Human Heredity. 49 (4), 186-189 (1999).</li>
<li>Ueda, M., Ando, Y. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25228988">Recent advances in transthyretin amyloidosis therapy.</a> Translational Neurodegeneration. 3, 19(2014).</li>
<li>Brown, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+testing+improves+identification+of+transthyretin+amyloid+%28ATTR%29+subtype+in+cardiac+amyloidosis%5BTitle%5D)+AND+%22Amyloid%22%5BJournal%5D)">Genetic testing improves identification of transthyretin amyloid (ATTR) subtype in cardiac amyloidosis.</a> Amyloid. 24 (2), 92-95 (2017).</li>
<li>Tasaki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+of+wild-type+and+mutated+transthyretins%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Clinical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Rapid detection of wild-type and mutated transthyretins.</a> Annals of Clinical Biochemistry. 53 (4), 508-510 (2015).</li>
<li>Plante-Bordeneuve, V., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17698792">Diagnostic pitfalls in sporadic transthyretin familial amyloid polyneuropathy (TTR-FAP).</a> Neurology. 69 (7), 693-698 (2007).</li>
<li>Hsu, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+prospective%2C+observational+study+of+patients+with+uncommon+distal+symmetric+painful+small-fiber+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A prospective, observational study of patients with uncommon distal symmetric painful small-fiber neuropathy.</a> PLoS ONE. 12 (9), 0183948(2017).</li>
<li>Salvi, F., Pastorelli, F., Plasmati, R., Bartolomei, I., Dall'Osso, D., Rapezzi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotypic+and+phenotypic+correlation+in+an+Italian+population+of+hereditary+amyloidosis+TTR-related+%28HA-TTR%29%3A+Clinical+and+neurophysiological+aids+to+diagnosis+and+some+reflections+on+misdiagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Amyloid%22%5BJournal%5D)">Genotypic and phenotypic correlation in an Italian population of hereditary amyloidosis TTR-related (HA-TTR): Clinical and neurophysiological aids to diagnosis and some reflections on misdiagnosis.</a> Amyloid. 19, suppl 1 58-60 (2012).</li>
<li>Suhr, O. B., Lundgren, E., Westermark, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+mutation%2C+two+distinct+disease+variants%3A+Unravelling+the+impact+of+transthyretin+amyloid+fibril+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Internal+Medicine%22%5BJournal%5D)">One mutation, two distinct disease variants: Unravelling the impact of transthyretin amyloid fibril composition.</a> Journal of Internal Medicine. 281 (4), 337-347 (2017).</li>
<li>Vilà-Rico, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+post-translational+modifications+in+human+serum+transthyretin+associated+with+familial+amyloidotic+polyneuropathy+by+targeted+LC-MS+and+intact+protein+MS%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of post-translational modifications in human serum transthyretin associated with familial amyloidotic polyneuropathy by targeted LC-MS and intact protein MS.</a> Journal of Proteomics. 127, 234-246 (2015).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

ישנם שני שלבים קריטיים בתוך הפרוטוקול. ראשית, על מנת לקבל מספר מספיק של כדוריות הדם הלבנות, הדגימה hemodiluted צריך להיות נמנעה11. שנית, השימוש תחל PCR המתאים הוא היסוד כדי להשיג תוצאות אמינות12. השתמשנו בכלי האינטרנט פריימר-הפיצוץ כדי לעצב את4,תחל13; מינימום של 40 בסיסי זוגות בכל צד של exons TTR ארבע שאמור להיות מכוסה. אנחנו גם פועלים הפיצוץ NCBI לבדוק יחודיות של תחל.
כמה שיפורים מבוצעים...

Transthyretin (TTR) עמילואידוזיס (הפו) היא הצורה הנפוצה ביותר של עמילואידוזיס מערכתית תורשתי1, עלולה להיגרם כתוצאה מוטציה דומיננטית תורשתית אוטוזומלית ג'ין transthyretin (TTR)2. מוטציות TTR יציבות מבנה החלבון tetrameric, להוביל דיסוציאציה שלה לתוך מונומרים זה ומרכיב לתוך הסיבים עמילואיד2. יותר מ-100 מוטציות TTR amyloidogenic כבר דווח על ברחבי העולם1. ניתוח גנטי עם שיטות (PCR) תגובת שרשרת של פולימראז לאשר הנוכחות של מוטציה נקודת TTR ויש יתרונות כולל הימנעות הטיפול radioactively שכותרתו הגששים בהשוואה תספיג דנ א3. PCR הוא מהיר, קל, זול ואמין טכניקה שהוחלו לשדות רבים מדעי מודרני4.
אבחון מוקדם של המחלה מתקדמת, חמורה הוא מאתגר בהתחשב הטרוגניות פנוטיפי שלה. עם הגדלת תשומת לב והכרה רחבה יותר על הביטויים המוקדמים של הפו, כמו גם טיפולים המתעוררים5, מחקרים האבחון המתאים, כולל בדיקות גנטיות TTR ולכן הם אנושות הבסיסית כדי לשפר את הפרוגנוזה. יתר על כן, מוטציות שונות קשורים עם penetrance שונים של התכונה, הגיל של תחילת, דפוסים של התקדמות, חומרת המחלה, חציון ההישרדות, היעילות של השתלת כבד, או מייצבים TTR2,6, ו מעלות משתנה במעורבות נוירולוגית, תרופות, אשר יש השלכות נהדר על יעוץ גנטי-7,-8,-9. חוץ מזה, בדיקה גנטית ומדויקים הוא הכלי היחיד אשר מבדיל בין שני סוגי הפו ברורים: תורשתי (מוטציה) וסוג הפרוע (טופס שאינו-מוטציה, עמילואידוזיס מערכתית סנילי, הסוכן המיוחד)7. זה הכרחי כדי לאשר את סוגי הפו, כי הטיפולים קיימים הבדלים2. לכן, אין הצורך הגובר לתאר את הפרוטוקול stepwise של הבדיקה הגנטית TTR.
הגישה מולקולרית כדי לזהות את המוטציה יומחשו באמצעות Ala97Ser, המוטציה אנדמיים הנפוץ ביותר בטייוואן, כדוגמה. שינויים בשלב הפקת דנ א להפחית את כמות הפתרונות שלושה בשימוש ותשואות כמות מספקת של ה-DNA. פרוטוקול זה, כל ארבע TTR exons נותחו, בעוד אזורים כולל 5' במעלה הזרם, 3' במורד הזרם, היזמים, אינטרונים, אזורים לא מתורגם (UTR) היו לא רציף.

<table><tbody><tr><td>צינורות מטופלים ב- EDTA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ערכת מיצוי DNA</td><td>BD Stratagen</td><td>200600</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר NanoDrop ND2000&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NanoDrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>מגבי משימות עדינים</td><td>קימברלי-קלארק</td><td>Kimtech Science Kimwipes</td><td></td></tr><tr><td>AmpliTaq Gold 360 DNA Polymerase ערכת</td><td>Applied Biosystems</td><td>4398823</td><td></td></tr><tr><td>TTR גן פריימרים אינטרוניים&nbsp;</td><td>Exon1</td><td>F: 5'-TCAGATTGGCAGGGATAAGC-3'</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Exon1</td><td>R: 5'-GCAAAGCTGGAAGGAGTCAC-3'</td><td></td></tr><tr><td></td><td>אקסון 2</td><td>F: 5'-TCTTGTTTCGCTCCAGATTTC-3'</td><td></td></tr><tr><td></td><td>אקסון 2</td><td>R: 5'-TCTACCAAGTGAGGGGCAAA-3'</td><td></td></tr><tr><td></td><td>אקסון 3</td><td>F: 5'-GTGTTAGTTGGTGGGGGTGT-3'</td><td></td></tr><tr><td></td><td>אקסון3</td><td>R: 5'-TGAGTAAAACTGTGCATTTCCTG-3'</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Exon4</td><td>F: 5'-GACTTCCGGTGGTCAGTCAT-3'</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Exon4</td><td>R: 5'-GCGTTCTGCCCAGATACTTT-3'</td><td></td></tr><tr><td>thermocycler</td><td>Applied Biosystems</td><td>GeneAmp PCR System 9700</td><td></td></tr><tr><td>תא אלקטרופורזה&nbsp;</td><td>סולם DNA ADVANCE</td><td>Mupid-2plus</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Protech</td><td>PT-M1-100</td><td></td></tr><tr><td>צבע</td><td>BioLabs</td><td>B7021</td><td></td></tr><tr><td>AlphaImager EC</td><td>Alpha Innotech</td><td>AlphaImager EC</td><td></td></tr><tr><td>רצף אוטומטי&nbsp;</td>מנתח <td></td>DNA של <td>Applied Biosystems</td><td>3730XL</td></tr></tbody></table>

ניתוח גנטי של transthyretin ala97ser תורשתיות הקשורות עמילואידוזיס

Genetic Analysis of Hereditary Transthyretin Ala97Ser Related Amyloidosis

בדיקה גנטית היא הבדיקה האמינה ביותר עבור transthyretin תורשתי הקשורים עמילואידוזיס צריכה להתבצע ברוב המקרים של transthyretin עמילואידוזיס (הפו). הפו היא מחלה נדירה אך קטלנית עם פנוטיפים הטרוגניות; לכן, האבחנה לפעמים מתעכב. עם הגדלת תשומת לב והכרה רחבה יותר על הגילויים המוקדמים של הפו, כמו גם טיפולי המתעוררים, מחקרים האבחון המתאים, כולל את transthyretin (TTR) גנטי לבדוק, כדי לאשר את סוגי, ולכן הם וריאציות של הפו היסוד כדי לשפר את הפרוגנוזה. ניתוח גנטי עם שיטות (PCR) תגובת שרשרת של פולימראז ולאשש את קיומן של מוטציות נקודה TTR הרבה יותר מהר ובטוח יותר מאשר בשיטות המקובלות כגון תספיג דנ א. במסמך זה, נדגים אישור גנטי של המוטציה Ala97Ser הפו, המוטציה אנדמיים הנפוץ ביותר בטייוואן. הפרוטוקול כוללת ארבעה שלבים עיקריים: איסוף דגימות דם, הפקת דנ א, ניתוח גנטי של כל ארבע TTR exons עם PCR, ואת רצפי DNA.

Agarose בג'ל של שני חולים, אחת הלהקות חשף בריא בודדים של גודל הצפוי, כולל מוצר ה-PCR bp 454 עבור אקסון 4 של הגן TTR (איור 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57743/57743fig1.jpg"> איור 1 . אלקטרופורזה בג'ל המתארים PCR מוגבר TTR ג'ין. רגיל: אדם בריא. 100 מ': ליין bp סולם הדנ א כמו סמן גודל מולקולרי. מסלולים 1:246 bp (אקסון 1...

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לאשר הנוכחות של נקודת מוטציה לאבחון של עמילואידוזיס transthyretin תורשתי, Ala97Ser, המוטציה אנדמיים הנפוץ ביותר בטייוואן, כדוגמא.

ניתוח גנטי של Transthyretin Ala97Ser תורשתיות הקשורות עמילואידוזיס

Genetic testing is the most reliable test for hereditary transthyretin related amyloidosis and should be performed in most cases of transthyretin ...

עם תשומת לב גוברת לביטויים מוקדמים של עמילואידוזיס טרנסתירטין, כמו גם טיפולים מתפתחים, מחקרים מתאימים לאישור הסוגים והגרסאות של עמילואידוזיס טרנסתירטין הם בסיסיים לשיפור הפרוגנוזה. היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא שבדיקה זו אפשרית וקלה לביצוע במעבדה הקלינית. כדי להתחיל בפרוטוקול יש להשיג ערכת מיצוי DNA, להוסיף 10 מיליליטר של תמיסה אחת לדגימת הדם הקודמת של 4.0 מיליליטר שהושגה ולדגור את הדגימה על קרח למשך 10 דקות.לאחר הדגירה צנטריפוגה הדגימה ב -2000 גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. הסר בזהירות והשליך את הסופרנטנט. השעו מחדש את הגלולה בשלושה מיליליטר של תמיסה אחת.צנטריפוגה את הדגימה ב-2000 גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס שוב. השליכו את הסופרנטנט. השעו מחדש את הגלולה בשלושה מיליליטר של תמיסה שתיים.לאחר מכן, הוסף 10 מיקרוליטר של תמיסת מלאי פרונאז כדי לקבל ריכוז סופי של 100 מיקרוגרם למיליליטר ולערבב היטב את התוכן. דגרו את ה-DNA ב-37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת, מצננים את הצינור על קרח למשך 10 דקות.הוסף 0.8 מיליליטר תמיסה שלוש לדגימה והפוך אותה שלוש עד חמש פעמים. לאחר מכן, הניחו את הדגימה על קרח למשך חמש דקות. צנטריפוגה את הדגימה ב-3000 גרם למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס.העבירו בזהירות את הסופרנטנט לצינור צנטריפוגה חרוטי סטרילי של 15 מיליליטר והוסיפו שישה מיקרוליטרים של תמיסת מלאי RNase כדי לקבל ריכוז סופי של 20 מיקרוגרם למיליליטר. דגרו את הדגימה, הוסיפו 2.5 מיליליטר אלכוהול איזופרופיל לצינור והפכו בעדינות את הצינור מספר פעמים כדי לזרז את ה-DNA המופיע כגדילים של חומר פלוקולנטי לבן. עם פיפטה גדולה העבירו את המשקעים לצינור צנטריפוגה חדש של 1.5 מיליליטר.צנטריפוגה את המשקעים ב -12, 000 גרם למשך שלוש דקות בארבע מעלות צלזיוס. השליכו את הסופרנטנט בזהירות. לאחר מכן שטפו את כדור ה-DNA על ידי הוספת 500 מיקרוליטר של 70% אתנול.צנטריפוגה של הדנ"א ב-12,000 גרם למשך דקה אחת והשליכו את הסופרנטנט. יבש את כדור ה-DNA באוויר בטמפרטורת החדר. הוסף 100 מיקרוליטר של DDH2O ודגר את הדגימה ב-65 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות כדי להשעות מחדש את ה-DNA.בצע PCR בתערובת תגובה של 25 מיקרוליטר באמצעות ערכת DNA פולימראז. הוסף את הריאגנטים לצינור PCR של 0.2 מיליליטר. מערבבים את התוכן בעדינות וצנטריפוגה קצרה בצנטריפוגה עליונה.הנח את הצינור במחזור תרמי. בצע את ה-PCR במשך 30 מחזורים עם שלב דנטורציה למשך 30 שניות ב-94 מעלות צלזיוס, פריימר המאפשר 30 שניות ב-58 מעלות צלזיוס והארכת פולימראז למשך 45 שניות ב-72 מעלות צלזיוס. הכינו ג'ל אגרוז 1.2% על ידי ערבוב 1.2 גרם אבקת אגרוז עם 100 מיליליטר של 0.5 XTBE בבקבוק הניתן למיקרוגל.מיקרוגל את התמיסה למשך שתי דקות עד להמסה מלאה של האגרוז. מצננים את תערובת האגרוז ל 55 מעלות צלזיוס. מוסיפים לתערובת האגרוז שני מיקרוליטרים של תמיסת אתידיום ברומיד ומערבבים בעדינות.מזגו את התערובת למגש ג'ל לעומק של כחמישה עד שבעה מילימטרים. לאחר מכן, הכנס את המסרק. הניחו לג'ל להתמצק למשך 30 דקות לפחות.לאחר שהג'ל התמצק, הסר בזהירות את המסרק. הנח את הג'ל והמגש בתא האלקטרופורזה. מלאו את תא האלקטרופורזה ב-0.5 XTBE עד לכיסוי הג'ל.טען בזהירות שני מיקרוליטרים של סולם DNA של 100 זוגות בסיסים לנתיב האחד של הג'ל כסמן גודל מולקולרי. טען את תערובת הצבע והדגימה לנתיבים הנוספים. הפעל את ספק הכוח והפעל את הג'ל למשך 25 דקות ב -100 וולט.הסר את הג'ל מתא האלקטרופורזה. לבסוף, דמיין את שברי ה-DNA תחת אור UV במערכת הדמיה. אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז של שני חולים ואדם בריא אחד חושפת רצועות בגדלים הצפויים, כולל מוצר PCR של 454 זוגות בסיסים לאקסון 4 של הגן TTR.כרומטוגרמות רצף חשפו החלפת נוקלאוטיד T ל-G באקסון 4 של הגן TTR וכתוצאה מכך מוטציה מיסנסנס והחלפת אלנין לסרין במיקום חומצת אמינו 97 בשני חולים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לאשר את נוכחותן של מוטציות נקודתיות לאבחון עמילואידוזיס טרנסתירטין תורשתי.

genetic-analysis-hereditary-transthyretin-ala97ser-related

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי בשילוב עם טכנולוגיית ביו-פאנינג יצרנו מערכת ביו-פאנינג שלילית וחיובית לרכישת נוגדנים כנגד וריאנטים חלבונים ספציפיים למחלה הנמצאים בכל חומר ביולוגי, אפילו בריכוזים נמוכים.  הצלחנו להשיג נוגדנים לגרסאות חלבון TDP-43 המעורבות בטרשת אמיוטרופית צידית.

רומן הכוח האטומי מיקרוסקופית מבוסס Biopanning לבידוד של חומרים כימיים מסוימים מורפולוגיה נגד גרסאות TDP-43 בטרשת לרוחב amyotrophic

מוצגת גישה של גנטיקה הפוכה להבנת משפחות גנים הקשורות למחלות אנושיות, תוך שימוש בעכבר כמערכת מודל, ומתוארת לוח הזמנים של הפנוטיפ של העכברים שלאחר מכן. מכיוון שעכברים פגומים בגן מעניין, HtrA2, הפגינו תסמינים פרקינסוניים, משטר הפנוטיפ מתמקד בזיהוי פגמים נוירולוגיים.

משטר phenotyping עבור עכברים מהונדסים גנטית בשימוש ללמוד גנים מעורבים מחלות אנושיות של הזדקנות

פרוטוקול זה מתאר שיטה רגיש למדוד את קצב ההעברה nucleocytoplasmic בתוך נוירון כמו NSC-34 תאים תאים על ידי כימות השינוי בזמן אמת ביבוא גרעיני של חלבון NLS-NES-GFP.

Assay למדוד Nucleocytoplasmic התחבורה בזמן אמת בתוך מוטורי נוירון כמו NSC-34 תאים

התצהיר עמילואיד מהווה סימן היכר של מחלות שונות, פוגעת באיברים שונים רבים. מאמר זה מתאר את היישום של זריחה oligothiophene מצומדת זורח מכתים בשילוב עם טכניקות במיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית. שיטה זו מכתימים מייצגת כלי רב עוצמה עבור זיהוי וחקירה של אגרגטים חלבון ב setups קליניים ומדעיים.

הדמיה עמילואיד ברקמות מוכתם Oligothiophenes מצומדת זורח על ידי היפרספקטרליות קונאפוקלית מיקרוסקופ והדמיה שלמים קרינה פלואורסצנטית

יישוב הדור הבא רצפי היא גישה זמן - ו וחסכוניים זה נהיה יותר ויותר פופולרי לחקר מחלות והן אבחון קליני. הפרוטוקול המתואר כאן מציג את זרימת העבודה המורכבים הדרושים עבור רצף והתהליך ביואינפורמטיקה המשמש לזיהוי גנטי גרסאות שתורמים למחלות.

ממוקד הדור הבא רצפי וכן ביואינפורמטיקה צינור להעריך גורמים גנטיים של המחלה החוקתי

בהווה לומדים, נתאר מתודולוגיה לניתוח של גנוטיפ C924T. הפרוטוקול מורכב משלושה שלבים: הפקת דנ א, ההגברה ידי תגובת שרשרת פולימראזית (PCR), וניתוח של ההגבלה שבר אורך פולימורפיזם (RFLP) על agarose ג'ל.

שיטה ללמוד את פולימורפיזם C924T של הגן לקולטן של Thromboxane A2

ניתוח אות לרעש ברמת חומצת אמינו קובע מהי השכיחות של וריאציה גנטית במיקום נתון חומצת אמינו מנורמל על רקע וריאציה גנטית של אוכלוסיה נתונה. דבר זה מאפשר זיהוי של variant "נקודות חמות" בתוך רצף חלבונים (אות) המתנשא מעל התדירות של שמתגלה נדירה באוכלוסיה (רעש).

קביעת הסבירות של Variant פתוגניות באמצעות חומצת אמינו ברמת ניתוח אות לרעש של וריאציה גנטית

בדיקות דם מבוססות עבור מחלות ניווניות חיוניים ליישום מחקרים קליניים בקנה מידה גדול. בדיקת דם אמינה ומאומתת צריך לדרוש נפח דגימה קטן, כמו גם להיות שיטת דגימה פחות פולשנית, במחיר סביר, והניתן לקריאה. נייר זה מדגים כי התפוקה הגבוהה של אלקטרופורזה באמצעות נימי הכוח מספקת את הקריטריונים להתפתחות ביואלית פוטנציאלית.

שימוש של אלקטרופורזה נימי הנוגדנים כדי לחפש בסמנים פוטנציאליים של טרשת Amyotrophic לרוחב בטסיות האדם

בהתבסס על משפחת הקרדיומיופתיה התורשתית המשפחתית שנמצאה בעבודה הקלינית שלנו, יצרנו מודל עכבר C57BL/6N עם מוטציה נקודתית (G823E) בלוקוס MYH7 של העכבר באמצעות הנדסת גנום בתיווך CRISPR/Cas9 כדי לאמת מוטציה זו.

חקירת הפתוגנזה של מוטציית MYH7 Gly823Glu בקרדיומיופתיה היפרטרופית משפחתית באמצעות מודל עכבר

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשימוש בגרסה העדכנית ביותר של יישור הרצף של הסוכנות להגנת הסביבה של ארה"ב כדי לחזות רגישות בין מינים (SeqAPASS) כלי. פרוטוקול זה מדגים את היישום של הכלי המקוון לניתוח מהיר של שימור חלבונים ולספק תחזיות הניתנות להתאמה אישית וניתנות לפרשנות בקלות של רגישות כימית בין מינים.

הדגמה של יישור הרצף לחיזוי בין מינים כלי רגישות להערכה מהירה של שימור חלבונים

כאן, אנו מתארים מערכת שמרים המשחזרת γ-הפרשה אנושית. מערכת זו מאפשרת זיהוי ומחקר של מוטציות המשפיעות על הפעילות ובדיקת מעכבי γ-סקרטאז (GSI). תוך ניצול תכונות אובדן התפקוד של מוטציות משפחתיות של מחלת אלצהיימר, ניתן לסנן מאפנני γ-סקרטאז (GSM).

שמרי אפייה (Saccharomyces cerevisiae) מודלים של מחלת אלצהיימר לסינון גנים, מוטציות וכימיקלים המשפיעים על ייצור בטא עמילואיד על ידי γ-secretase

למד פרוטוקול לאבחון מוטציות נקודתיות בעמילואידוזיס תורשתי של טרנסתירטין באמצעות PCR ואלקטרופורזה על ג'ל אגרוז. השיטה מאפשרת זיהוי מוקדם של המוטציה Ala97Ser בנבדקים.

ניתוח גנטי של Transthyretin Ala97Ser תורשתיות הקשורות עמילואידוזיס

גלה סרטונים נוספים