ניתוח של הפרעה פנימית AtHIRD11 ואיגוד לקראת יוני מתכת על ידי נימי אלקטרופורזה בג'ל אלקטרופורזה נימי זיקה

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח הנוגעות לטקטוניקה של חלבוני הפרעה פנימית כגון שינויים קונפורמטיביים עקב קשירת ברזל מתכת. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא דורשת מעט מאוד ציוד וניתן להשיג את התוצאות במהירות רבה. מי שידגים את ההליך יהיה מתיאס שטיין, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי.

כדי להתחיל, השתמש בחותך זכוכית על צלחת זכוכית כדי לחתוך נימי סיליקה חשופים עם ציפוי חיצוני פוליאמיד וקוטר פנימי של 50 מיקרון לאורכים של 33 ו -30 סנטימטר. השתמש בעט כדי לסמן את האמצע של חלון זיהוי ברוחב סנטימטר אחד במרחק של 24.5 סנטימטרים מקצה אחד של הנימים עבור ניסוי CGE וב-21.5 סנטימטרים מקצה אחד של הנימים עבור ניסוי ACE. בעזרת מבער יש לשרוף את הציפוי החיצוני של הפוליאמיד 0.5 סנטימטרים לפני ואחרי כל סימן.

באופן דומה, השתמש במבער כדי להסיר סנטימטר אחד מהציפוי בשני קצוות הנימים. לאחר מכן, השתמש באתנול וברקמה רכה כדי לנקות את קצות הנימים וחלונות הזיהוי. התקן נימי במערכת CE עם חלון הזיהוי ליד השקע.

לאחר הכנת פתרונות, על פי פרוטוקול הטקסט, השתמש בתמיסת סידן כלוריד 250 מיקרו-מולרית למילוי מזרק של 10 מיליליטר. לאחר מכן חבר מסנן PVDF של 0.2 מיקרון למזרק ודחף 2 מיליליטר מהתמיסה דרך המסנן כדי להשליך אותו. השתמש בסידן כלורי הנותר במזרק כדי למלא 10 בקבוקונים עד לנפח המרבי המותר.

סמן כל בקבוקון כבקבוקון כ-250 בקבוקון כניסת תמיסת סידן כלוריד מיקרו-מולרי. לאחר מכן, בעזרת תמיסת הסידן הכלורי, מלאו 10 בקבוקונים באמצע הדרך. סמן כל אחד כבקבוקון יציאת תמיסת סידן כלוריד 250 מיקרומולרי.

לאחר מכן, עם תמיסות מתכת אחרות המכילות מלח, מלאו בקבוקונים בצורה דומה. בנוסף, עבור כל זוג בקבוקוני כניסה ויציאה, השתמש ב-30 מיקרו-מולרי Tris Buffer להכנת סט דומה של בקבוקוני כניסה ויציאה. עם סמן EOF של 60 מיקרו-מולרי אצטניליד, מלאו 10 בקבוקונים.

לאחר מכן השתמש בתמיסת הדגימה של מיליגרם אחד למיליליטר כדי למלא בקבוקון אחד. לאחר הכנת הניתוח, על פי פרוטוקול הטקסט, הפעל את ההפרדה על ידי הזרקה הידרודינמית של תמיסת הדגימה לניסויי CGE והחלת 0.1 בר למשך ארבע דקות בכניסה. לאחר מכן, הפעל 16.5 קילו-וולט שלילי ולחץ של 2.0 בר בשני קצוות הנימים למשך 25 דקות.

לאחר הכנת השיטה למדידות ללא ליגנדים, הכינו את השיטה למדידות עם ליגנדים על ידי שימוש תחילה בתמיסת EDTA 0.1 מולרית לשטיפת הנימים ב-2.5 בר למשך דקה. לאחר מכן השתמש במים נטולי יונים כדי לשטוף את הנימים. לאחר מכן, אזנו את הנימים באמצעות תמיסת ליגנד כדי לשטוף אותו ב-2.5 בר למשך 1.5 דקות.

לאחר מכן, הזריק את תמיסת האצטניליד ב-0.05 בר למשך 6 שניות והחלף את בקבוקוני הכניסה והיציאה לליגנד המכיל בקבוקוני חיץ. יש למרוח 0.05 בר למשך 2.4 שניות על מנת לדחוף את תמיסת האצטניליד פנימה מקצה הנימים. הפעילו 10.0 קילו-וולט למשך 6 דקות וגלו את שיא האצטנליד של הנכס באורך גל של 200 ננומטר.

לאחר שטיפת הנימים במים נטולי יונים של EDTA ותמיסת הליגנד, כמו קודם, יש להזריק את דגימת החלבון ולהחליף את בקבוקוני הכניסה והיציאה לליגנד טרי המכיל בקבוקוני חיץ. לחלופין, חזור על ביצוע מדידות עם ובלי ליגנדים. לאחר מכן, חזור על השיטה באמצעות תמיסות ליגנד האדמה האלקליין.

לבסוף, השתמש בפתרונות הבאים כדי לבצע את אותה שיטה. לאחר מכן, חשב את השינוי ביחסי גודל המטען עבור אינטראקציות יוני מתכת חלבון שונות. מוצגת כאן האלקטרופרוגרמה של דגימת AtHIRD11 שהתקבלה במהלך ניסויי CGE.

גודל הפפטיד גדל משמאל לימין. שיא מספר ארבע הוא בעל המסה הגדולה ביותר ומציין את החלבון השלם. הפסגות הקטנות יותר, שתיים ושלוש, מייצגות זיהומים קטנים יותר.

איור זה מייצג את האלקטרופרוגרמה של אצטניליד במהלך ניסויי ACE. תמיסת האצטנילידים מראה רק שיא גבוה אחד מכיוון שלא אמורים להיות בו זיהומים. זמן הזיהוי של מקסימום השיא מציין את זמן הנדידה של הזרימה האלקטרואוסמוטית ומשמש לחישוב האינטראקציה.

אלקטרופרוגרמה זו של דגימת AtHIRD11 במהלך ניסוי ACE בוצעה בהיעדר SDS ויוני מתכת. מלבד שני הזיהומים מהאלקטרופרוגרמת CGE, קיימות לפחות חמש פסגות, הקשורות לחלבון עצמו. הערכה גרפית של שינויי זמן הנדידה הנמדדים בנוכחות יוני המתכת השונים לשיא שש, מוצגת כאן.

הוא מיוצג על ידי הערך המחושב דלתא R על RF. כל תוצאה מציינת עד כמה חזק השינוי התרחש על ידי ערכו והסימן שלו כפי שמצוין על ידי השינוי הכולל באחריות של קומפלקסי יוני מתכת החלבון. לאחר שליטה, ניתן לבצע את הטכניקה עבור שותף אינטראקציה אחד תוך שמונה שעות, כולל אינטראקציית CGE אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשנות את תמיסות החלבון למדידות זמן ארוכות מכיוון שתוצרי פירוק יכולים לגדול עם הזמן ולשנות את תמיסות Tris Buffer על מנת להשיג תוצאות מדויקות יותר.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד לחתוך ולנקות נימים, כמו גם, להגדיר שיטת אלקטרופורזה נימית זיקה, על מנת להעריך את התנהגות הקישור של חלבונים מופרעים מהותיים.