אופטימיזציה של לכידת לייזר Microdissection עבור בידודו של הגרעינים המעית מרקמות אנושיות מוקפאות
June 14th, 2018
המטרה של פרוטוקול זה היא להשיג דגימות RNA גבוהה-שלמות של הגרעינים המעית מבודד מבולבל, resected טריים מעיים רקמה אנושית באמצעות לייזר לכידת microdissection (LCM). פרוטוקול זה כולל הכנת קפואה דגימות של רקמות אנושיות מעיים, cryosectioning, ethanolic מכתים, התייבשות, הפונקציה LCM, והפקת RNA.
שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח על מערכת העצבים המעי, כגון פרופיל הביטוי של גרעיני המעי במעיים של בני אדם בוגרים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן להשתמש בה כדי להשיג תשואות גבוהות של RNA מגרעיני מעיים אנושיים תוך שמירה מקסימלית על איכות ה-RNA. התחל עם רקמת מעי חתוכה באורך של 20 סנטימטר.
ראשית, חתוך את רקמת השומן והחיבור. הימנע מחתך הסרוזה, מה שעלול להוביל לנזק מבני למקלעת המיאנטרית. לאחר מכן, בצע חתך אורכי לכל אורך הדגימה הגזומה, רצוי באתר ההתקשרות המזנטרי.
לאחר מכן, נתחו והשליכו את ה-taeniae coli מהמעי הגס כדי שהרקמה תוכל להשתטח. כעת, מרחו את המעי, כשהרירית כלפי מטה, על קרש חיתוך צונן. לאחר מכן, חותכים רצועות ברוחב 1.25 סנטימטר לכל אורך הרקמה.
כשהם נחתכים, העבירו כל חתיכה לתמיסת אחסון רקמות צוננות לאחסון זמני. לאחר מכן, חותכים כל רצועה למקטעים שאורכם שניים עד 1.5 סנטימטרים. לאחר חיתוך רצועה למקטעים, יש למחוק את הקטעים יבשים.
חשוב שהרקמה תהיה יבשה מאוד כדי שלא ייווצרו גבישי קרח על הרקמה כשהיא קפואה. כעת, סדרו את חתיכות הרקמה המיובשות, כשהרירית כלפי מעלה, על תבנית פלסטיק קרה וחד פעמית. לאחר מכן, שטחו כל חתיכה באמצעות מלקחיים מעוקלים כדי להסיר בועות אוויר כלואות.
הרקמות יתרחבו ככל שהן שטוחות. לאחר שיטוח מקטעי הרקמה, העריכו את עוביהם לפני ההקפאה. במידת הצורך, דחוף את שולי הדגימה פנימה עד שדגימת המעי מתקרבת לעובי המקורי שלה.
כעת, העבירו את תבנית הבסיס העמוסה על תרחיץ של קרח יבש ו-2-מתילבוטן. הרקמה אמורה לקפוא לחלוטין תוך 30 עד 60 שניות. לאחר מכן, יבש מיד את תחתית התבנית בעזרת מגבונים קרים שנשמרו על קרח יבש.
כעת, בדוק את המדגם. שימו לב לכל הדגימות שאינן נראות שטוחות. לאחר מכן, עטפו את התבנית בנייר אלומיניום שסומן מראש וצונן לפני השימוש.
לאחר מכן, כסו את נייר הכסף בשכבת ניילון נצמד כדי למזער התייבשות. שמור את הדגימות על קרח עד שניתן יהיה לאחסן אותן במינוס 80 מעלות צלזיוס. לאחר הכנת החומרים הנדרשים, שפכו תלולית של שלושה עד חמישה מילימטרים של TFM על מחזיק דגימת קריוסטט גדול והעבירו מיד את דגימת המעי, עם צד הסרוזה כלפי מעלה, אל ה-TFM.
לאחר מספר שניות בטמפרטורת החדר, העבירו את מחזיק הדגימה לקרח יבש וכסו אותו באבקת קרח יבש. לפני החיתוך, וודא שה- TFM נמצא מתחת למישור המקלעת המיאנטרית. לאחר מכן, הרכיב את מחזיק הדגימה לתוך ראש דגימת הקריוסטט ויישר את הדגימה עם להב הקריוסטט.
הפוך את מישור המקלעת המיאנטרית למקביל ללהב החיתוך. כעת, צרו שמונה קטעי מיקרון דרך הסרוזה ושריר האורך עד שתגיעו למקלעת המיאנטרית כדי לאתר את מקלעת המיאנטרית, הרכיב דגימה וצבוע אותה בצבע מימי, כגון 1% סגול קריסטל.
כדי להמשיך, זהה את הצומת בין שכבות השרירים האורכיות והמעגליות. בתחילת החיתוך, הסרוזה תסומן בנוכחות רקמת חיבור. חלק מהשומן המזנטרי שנותר עשוי להיות נוכח גם לאורך הסרוזה.
לאחר מכן, היריעה של שכבת השריר האורכית החיצונית נראית לעין לאחר שהושג הגבול בין שכבות השרירים האורכיות והעגולות, ייצפה חלק מגרעיני המעי. בחלקים הבאים, מקלעת המיאנטרית תהיה ברורה מאוד עם רצועות גדולות של גנגליונים בתוך קטע אחד. כעת, אסוף קטעים סדרתיים עבור המיקרו-דיסקציה של לכידת לייזר.
צ'יל PEN מחליק בקריוסטט למשך חמש עד 10 שניות והשתמש בהם כדי להרכיב את החלקים. בקטעים הטובים ביותר יהיו הרבה נוירונים וגליה. כעת, המשך להכתים ולאחר מכן לייבש את החלקים כמתואר בפרוטוקול הטקסט.
בהכנה, הכנס מחסנית של כובעי LCM לשלב המיקרוסקופ LCM. לאחר מכן, טען את השקופית לדוגמה על הבמה ורכוש תמונת סקירה כללית של השקופית. זהה את המיקום הרצוי עבור LCM וטען מכסה על המגלשה.
לאחר מכן, יישר את לייזר האינפרא אדום והתאם את עוצמת הלייזר ומשך הזמן לנקודת לכידה בקוטר 20 עד 30 מיקרון. לאחר מכן, תאר את הגרעינים הרצויים לאיסוף. הקפידו להישאר בגבולות אזור האספנות על הכובע, המוצג כעיגול ירוק.
עבור כל אחד מהגנגליונים המתוארים על ידי עקבות חיתוך UV, התאם את כתמי ה-IR כך שתהיה לפחות נקודת IR אחת כל 100 עד 500 מיקרון כדי להבטיח שכל הגרעינים ייאספו כאשר המכסה מורם מהדגימה. לאחר מכן, לחץ על כפתור IR UV Cut כדי להמשיך באיסוף כל הגרעינים המסומנים. לאחר השלמת האיסוף, העבר את המכסה למיקום חדש וחזור על תהליך האיסוף.
ניתן לחזור על זה במשך 60 עד 80 דקות. כאשר מכסה ה- LCM עמוס במספיק גנגליונים, העבר אותו לתחנת בקרת איכות. אם יש פסולת על המכסה, נגב אותה באמצעות מברשת צבע עדינה שהוכנה לשימוש ב-RNA.
השתמש בקצה פיפטה לכל פסולת שקשה להסיר. לאחר מכן, אבטח את המכסה על צינור מיקרופוגה של 0.5 מיליליטר מלא ב-230 מיקרוליטר של מאגר ליזה RNA. הפוך את המכסה, מערבל אותו לזמן קצר ולאחר מכן דגר את הדגימה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
מאוחר יותר, צנטריפוגה את הדגימה למשך חמש דקות בטמפרטורה של 5,000 גרם ומעלה, ולאחר מכן העבירו את צינור המיקרופוגה לקרח יבש. הדגימה מוכנה כעת למיצוי ה-RNA. בעת משיכת שני כובעים של גנגליונים אנטרי לדגימה, התקבל יותר מננוגרם אחד של RNA, מספיק ל-RNA-Seq, וה-RNA היה באיכות מעולה.
שלמות ה-RNA של הדגימה המוצגת היא 8.3. כמו כן נאספו דגימות עם מספרי תקינות של 7.5 ו-6.9. בסך הכל, יותר מ-95% מכלל הדגימות המוכנות היו טובות מספיק עבור RNA-Seq.
איכות מערכי הנתונים של RNA-Seq הוערכה באמצעות צינור ביואינפורמטיקה. הטיית הקצה מצביעה על כך שהדגימות רוצפו בהצלחה והיו להן הטיה צנועה של שלושה קצה ראשוני. תרשים ביוטיפ של גנים מראה שתוצאות הריצוף היו עקביות במידה רבה.
לאחר השליטה, ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לאסוף שכפולים ביולוגיים של RNA מגרעינים אנטריים באיכות ובכמות מספיקים עבור RNA-Seq תוך שמונה עד 12 שעות בלבד. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב שדגימות המעי האנושיות יוקפאו שטוחות ככל האפשר. זה יבטיח שתוכל לאסוף חתכים גדולים מאוד של גרעיני מעיים אנושיים המעובדים במהירות ובקלות באמצעות מיקרו-דיסקציה לכידת לייזר.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה כללית
מחקר זה מתאר פרוטוקול לחילוץ RNA בעל איכות גבוהה מגנגליה אנטרית מבודדת מרקמות מעיים אנושיות שהוצאו טרי באמצעות מיקוח מיקרוסקופי באמצעות לייזר (LCM). השיטה נועדה לחקור את פרופילי הביטוי של מערכת העצבים האנטרית במעיים האנושיים, ולהעמיק את הבנתנו על תפקודי העצבים בתוך מערכת העיכול.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה מולקולרית
- גסטרואנטרולוגיה
רקע
- למערכת העצבים האנטרית יש תפקיד קריטי בתפקוד מערכת העיכול.
- RNA באיכות גבוהה חיוני לחקר פרופילי ביטוי גנים.
- מיקוח מיקרוסקופי באמצעות לייזר מאפשר בידוד מדויק של מבנים תאיים.
- טכניקה זו מאפשרת ניתוחים מולקולריים מפורטים מרקמות שלמות.
מטרת המחקר
- להשיג תשואות גבוהות של RNA מגנגליה אנטרית אנושית.
- לשמר את איכות ה-RNA תוך צמצום נזק לרקמות.
- להעריך את פרופילי ביטוי הגנים במערכת העצבים האנטרית האנושית.
שיטות ששימשו
- מיקוח מיקרוסקופי באמצעות לייזר (LCM) של גנגליה אנטרית מדגימות רקמות אנושיות.
- רקמות מעיים שהוצאו טרי עברו עיבוד בידוד גנגליה.
- שלבים קריטיים כללו קירור חתכים, צביעה והתייבשות.
- חילוץ ה-RNA עקב אחרי טכניקות ה-LCM כדי להשיג איכות RNA גבוהה.
תוצאות עיקריות
- הפרוטוקול הניב מעל 1 ננו-גרם של RNA בעל איכות גבוהה לרצף.
- מספרי איכות ה-RNA הצביעו על איכות RNA מצוינת המתאימה ל-RNA-Seq.
- יותר מ-95% מהדגימות היו מספיקות לניתוחי רצף.
מסקנות
- מחקר זה מדגים שיטה יעילה לבידוד RNA מגנגליה אנטרית אנושית.
- התוצאות מאפשרות תובנות עמוקות יותר לגבי המנגנונים המולקולריים של מערכת העצבים האנטרית.
- לשיטה זו יש השלכות על מחקר הפרעות במערכת העיכול ותפקוד עצבי.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Laser-capture microdissection (LCM) enables precise isolation of enteric ganglia from human intestinal tissue, providing high-integrity RNA for transcriptomic analysis. This approach supports target validation in gastrointestinal neuroscience by delivering disease-relevant molecular data from primary human tissue. The method reduces biological noise and enhances predictive confidence in early discovery workflows focused on enteric nervous system pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating pure populations of enteric ganglia for RNA-seq analysis.
- Operational Value: Preserves RNA integrity while minimizing contamination from surrounding tissue layers.
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking through direct measurement of gene expression in disease-relevant human neural tissue.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, high-quality RNA inputs suitable for reproducible transcriptomic assays.
- Operational Value: Uses PEN-membrane slides and ethanol-compatible dyes to improve capture efficiency and RNA yield.
- Scientific Value: Enables quantitative dependent variable measurements (e.g., RNA integrity number) for assay qualification.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant human tissue data that bridges discovery and preclinical validation.
- Operational Value: Yields sufficient RNA quantity (>1 ng per sample) for downstream sequencing applications.
- Scientific Value: Supports translational biomarker discovery by enabling profiling of enteric nervous system targets in human tissue.
Pipeline & Workflow Integration
The LCM workflow fits within the discovery biology phase, enabling hypothesis testing and pathway clarification prior to lead identification. It generates quantitative molecular readouts that inform go/no-go decisions in target selection. The method produces reusable, standardized tissue preparations that support enterprise-scale screening campaigns.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing by isolating pure neuronal populations for molecular profiling.
- Screening: Delivers standardized, high-integrity RNA samples enabling reliable compound effect measurements.
- Analytics: Provides RNA integrity number (RIN) and yield metrics to assess sample quality before sequencing.
- Translational Research: Connects human tissue data to preclinical models through conserved gene expression patterns.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable protocol for isolating neural tissue across multiple tissue blocks and experimental conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in neural target validation.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized tissue preparation, staining, and LCM parameters.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling rapid acquisition of human-validated molecular data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets based on human enteric nervous system expression profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue handling, cryosectioning, and laser-capture microdissection.
- Dependent on cryostat, LCM system, and RNA-compatible staining reagents (e.g., Cresyl Violet).
- Necessitates standardized protocols for tissue flattening, freezing, and section orientation.
- Must account for tissue variability across donors and intestinal regions when scaling.
- Limited by RNA degradation risks if samples are not processed rapidly or kept sufficiently dry.
