זיהוי סמנים התקפה אלימה של Mycobacterium abscessus עבור שכפול תאיים ב Phagocytes

הקרנת ספריית מוטנטים ומחקרים תמלוליים של פתוגנים תאיים יכולים לעזור לענות על שאלות מפתח על התאמות גנומיות ורגולטוריות של פתוגנים של עניין המשמשים כדי לשרוד בתוך המארח. היתרונות העיקריים של טכניקות אלה הם כי הם טכניקות חקירה בקנה מידה גדול, כי הם מספקים תובנה אובייקטיבית לתוך הסתגלות לחיים תאיים. ההשלכות של טכניקות אלה להרחיב לכיוון הטיפול של מורסה Mycobacterium לשייך למחלה זו על ידי מתן תובנה על מטרות פוטנציאליות לטיפול בחיסון.

התחל על ידי culturing amoeba Acanthamoeba castellani, או Ac, ב 30 מיליליטר של פפטון שמרים גלוקוז בינוני ב 75 פתיתי רקמת סנטימטר מרובע בטמפרטורת החדר. לאחר שעה אחת להשתמש פיפטה 25 מיליליטר כדי להסיר את supernatant, ולשטוף את התאים שלוש פעמים עם 10 מיליליטר של חיץ Ac ללא פחמן או חנקן לכל לשטוף. לאחר הכביסה האחרונה, נתק את האמבה מתחתית הבקבוק עם טלטול נמרץ אחד, והתאם את התאים בצינור פלקון, לחמש פעמים 10 לריכוז של חמש אמבה למיל במאגר AC טרי.

זרעים חמש פעמים 10 לארבעה אמבה לגם בצלחת 96 באר. מניחים את הצלחת ב 32 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת בלי לרעוד, כדי לאפשר את אמבה צף tropho-zoites לדבוק בארות. בינתיים, לחמם את החיידקים על קרח, ולהוסיף חמישה microliters של חיידקים מופשרים לכל באר בסוף הדגירה.

לאחר 1.5 שעות ב 32 מעלות צלזיוס, להשליך את supernatant על ידי היפוך הצלחת על ערימה של גזה סטרילית במגש מתכת מעקר מתחת למכסה המנוע אדים. לשטוף כל באר שלוש פעמים עם 200 microliters של מדיום Ac טרי לגם. לאחר הכביסה האחרונה, הדגירה את התרבות השיתוף עם 20 microliters של מדיום טרי בתוספת אמיקצין לגם, כדי לחסל את כל mycobacteria חוץ תאי שנותר במשך שעתיים.

ואחריו שלוש שטיפות במדיום Ac טרי, כפי שהודגם רק. לאחר מכן, מוסיפים 200 מיקרוליטרים של מדיום, בתוספת אמיקצין טרי לכל באר, ואחריו תוספת של חמש פעמים 10 לשבע חיידקים Escherichia coli מושבת חום. לאחר 48 שעות, lyse התאים עם 10 microliters של 10% נתרן dodecyl סולפט לגם, במשך 30 דקות ב 32 מעלות צלזיוס, ולהפיץ חמישה microliters של lysate על קולומביה אגר צלחות המכיל 5% דם כבשים.

עוד לדלל את lysates על ידי הוספת 25 microliters של מים סטריליים על כל טיפה. כאשר כל הlysates כבר מצופה, לאטום את הצלחות עם סרט פרפין פלסטיק, ו דגירה התרבויות במשך שלושה עד ארבעה ימים ב 37 מעלות צלזיוס. כאשר מושבות מופיעות על הלוחות, לצלם את התרבויות ולזהות את המוטנטים לקוי לצמיחה תאית על ידי מרבצים עם המספר הנמוך ביותר של מושבות חיידקים.

עבור מיצוי RNA mycobacteria תאיים, לגדל תחילה M.מורססוס ב 7H9 בינוני בתוספת גליצרול וגלוקוז לשלב אמצע מעריכי ב 50 צינורות מיליליטר ב 120 סל"ד. בסוף התרבות, לשטוף את החיידקים פעמיים עם 10 מיליליטר של חיץ Ac לכל לשטוף, ולמדוד את O.D.600 כדי להעריך את ריכוז החיידקים. לאחר מכן, להוסיף 8.5 פעמים 10 לשמונה mycobacteria ל 8.5 פעמים 10 לשישה amoebae ב 10 מיליליטר של מדיום AC טרי עבור דגירה של שעה אחת ב 30 מעלות צלזיוס ו 80 סל"ד.

בסוף הדגירה, קוצר את התאים על ידי צנטריפוגה, ולשטוף את גלולה שלוש פעמים ב 10 מיליליטר של חיץ Ac טרי לכל לשטוף באותם תנאי צנטריפוגה. לאחר מכן להשעות מחדש את התאים ב 10 מיליליטר של חיץ Ac טרי בתוספת amikacin לחסל כל חיידקים חוץ תאיים, ו דגירה התאים במשך ארבע שעות ב 30 מעלות צלזיוס ו 80 סל"ד, ואחריו שתי שטיפות במאגר AC טרי. לאחר הכביסה האחרונה, להשעות מחדש את amoebae נגוע בארבעה מיליליטר של פתרון קר שלוש, בתוספת 280 microliters של בטא mercaptoethanol לשבש את amoebae על הקרח במשך 10 דקות.

בסוף הדגירה, צנטריפוגה התא lysate כדי גלולה חיידקים תאיים ששוחררו, ולהשעות מחדש את גלולת חיידקי במיליליטר אחד של פתרון קר שלוש. חשוב להסיר את כל על טבעי כדי למנוע זיהום עם RNA אמובה או פרוטאזות שאולי עשה את הדגימות. לקצור את החיידקים ששוחררו עם צנטריפוגה שנייה, ולהשעות מחדש את גלולה במיליליטר אחד של חיץ החילוץ.

ואז דגירה במשך 24 שעות ב 80 מעלות צלזיוס שליליות. מעבירים את הפתרון המיקובקטריאלי לשני צינורות בורג מיליליטר המכילים חרוזי זירקוניום עד לסימן ההדרגה של 500 מיקרוליטר, ואחסנו את הצינורות למשך 24 שעות נוספות ב-80 מעלות צלזיוס שליליות כדי להקל על הפעלת סינון RNA ופירוק תאים. ביום הניתוח, להפשיר את הדגימות על קרח, ו lyse התאים עם שני סיבובים של הומוגניזציה ב 6000 סל"ד במשך 25 שניות, ואחריו הומוגניזציה סיבוב אחד ב 6000 סל"ד במשך 20 שניות.

בין כל סיבוב של הומוגניזציה, לקרר את הדגימות על הקרח במשך דקה אחת, כדי למנוע השפלה RNA. לאחר הסיבוב השלישי של הומוגניזציה, לקרר את הדגימות על קרח במשך 20 דקות, ולהוסיף 200 microliters של כלורופורם מדולל אלכוהול isoamyl לכל צינור. מערבולת לדקה אחת, ואז צנטריפוגה הדגימות, ולהוסיף 0.8 מיליליטר של isopropanol קר לשלב המימי עבור דגירה של שעתיים עד שלוש שעות ב 20 מעלות צלזיוס שלילי.

בסוף הדגירה, צנטריפוגה הדגימות שוב, ולשטוף את כדורי 500 microliters של קר 70% אתנול מבלי לערבב. ואז מיד להסיר את האתנול על ידי צנטריפוגה. שאף את העל-טבעי לייבוש הכדורים ברכז צנטריפוגלי, והשהה מחדש את הכדורים ב-100 מיקרוליטרים של מים נטולי DNA/RNA.

מיצוי MRNA Mycobacterial כפי שהוכח, מאפשר הערכה של משפחות גנים המושרה והמודחק על ידי קיבוץ הגנים על פי תפקידם בתגובה לסביבה מוגבלת במקור של חומרים מזינים ומינרלים, או לסביבה היפוקסית או חומצית. בהתנגדות ללחץ חמצוני וניטרוזטיבי, או בביטוי של גורמי ארסיות בתגובה לאמבה סביבתית. בעת ניסיון הליכים אלה, חשוב לזכור לבצע את התרבות ואת בידוד RNA של דגימות מבוקרות נגועות בו זמנית, כדי למנוע השפעות אצווה.

בעקבות הליך זה, שיטות אחרות כמו רצף RNA כפול ניתן ליצור מראש כדי לענות על שאלות נוספות על אינטראקציות פתוגן המארח. לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום המיקרוביולוגיה כלפי ארסיות מיקובקטריה במודל המארח של האמבה. אל תשכח כי עבודה עם amoebae עלול להיות מסוכן מאוד, כמו amoebae עלול להפוך ציסטות אם אתה לא בצע את השלבים המתוארים בהליך.