Name: לכימות ויבריו cholerae קולוניזציה ושלשולים במודל דג זברה למבוגרים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: למדו כיצד לכמת קולוניזציה של Vibrio cholerae ושלשולים בדגי זברה בוגרים. שיטה זו מאפשרת חקר מחזור החיים המלא של החיידק בפונדקאי טבעי ותורמת להבנת דינמיקת ההדבקה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

תודה נילי מלודי, ג'ון אלן, באזל Abuaita, ו דונה Runft על מאמציהם בסיוע לפיתוח המודל דג זברה. המחקר דיווחו כאן נתמכה על ידי המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות של מכוני הבריאות הלאומיים תחת מספרי פרס R21AI095520 ו- R01AI127390 (כדי ג'פרי ה Withey). התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים, ואינם מייצגים בהכרח את הנופים הרשמי של מכוני הבריאות הלאומיים.

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של ווין סטייט. שיטה זו תוארה לראשונה בשנת Runft. et al. 12
1. קביעת רמות קולוניזציה מעיים
הערה: קולוניזציה מעיים הוא מדד שימושי ביותר במודל דג זברה כמו זה יכול לשמש כדי להשוות את הכושר היחסי של זנים שונים נ' cholerae או את ההשפעות של מוטציות או הסתרה ג'ין.
<ol><li>חיסון של דג זברה על ידי טבילה הערה: פירוש של חשיפה דומה את המסלול הטבעי של זיהום.<ol>
<li>הכנת נ' cholerae
		<ol>
<li>לחסן מ ל מרק lysogeny (ליברות) עם מבודדים נ' cholerae המושבה מ LB צלחת, תקופת דגירה זה ב 37 ° C עם טלטול (180 סל ד) של 6-8 h (לילה תרבות).</li>
			<li>לחסן 25 מ של טרי בינוני LB בלוק בבקבוקון חרוט 250 מ עם 50 µL של התרבות לילה לעיל. תקופת דגירה זה של 16 – 18 h ב 37 ° C עם טלטול (150 סל ד).</li>
			<li>לקרוא את הצפיפות האופטית-600 nm (OD600) של 1/10 לדילול של התרבות לילה כדי להעריך את מספר החיידקים לכל mL (ה OD600 = 1 הוא ~ 109 CFU/mL.)</li>
			<li>הקציר התאים על ידי צנטריפוגה ב 6,000 g עבור 10 דקות להסיר את המדיה עם פיפטה או שופכים אותו לתוך פתרון החיטוי. Resuspend התאים ב- PBS סטרילי לריכוז הרצוי, בדרך כלל בין 1 x 107 עונה 1 פרק 1010 מ"ל ל- PBS. הערה: הנה, אנחנו מתייחסים מים אוסמוזה הפוכה בלוק המכיל מלחי ים 60 מ ג/ליטר כ סטרילי זיהום מים.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
חיסון, דגירה
		<ol>
<li>מניחים דג זברה ארבעה או חמישה לתוך גביע 400 מ ל המכיל 200 מיליליטר מים דלקת סטרילית.</li>
			<li>להוסיף 1 מ"ל של נ' cholerae (מתוך שלב 1.1.1.4.) כדי להכניס את ריכוז זיהום הרצוי (בדרך כלל 5 x 104 ל- 5 x 107 CFU/mL) 200 מ של זיהום מים.</li>
			<li>לכסות את. הספל עם מכסה מחורר כדי למנוע את הדגים קופצים החוצה; העליון של תיבה עצה 200 µL עובד עליו היטב.</li>
			<li>תווית לכל כוס כימית, למקם אותם לתוך חממה חזית הזכוכית שוכן בגובה 28 º C משך זמן הניסוי.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
נוהל חשיפה חלוף הערה: חלוף חשיפה נ' cholerae (בדרך כלל 6 h) ואחריו הסרת של החיידק לחסן שימושית עבור הלומדים את השידור, כימות מדויקת יותר של החיידקים מופרש.<ol>
<li>לאחר 6 שעות של חשיפה, שופכים את המים הספל דרך מחוך כדי לאסוף את הדגים. למחוק את המים נגועים לתוך מכולה של אקונומיקה כדי להרוג את נ' cholerae.</li>
			<li>מניחים את הדג שהוסר ב גביע 200 מיליליטר מים דלקת סטרילית. לאפשר את הדגים לשחות במים נקיים זה עבור 5 דקות כדי להסיר את החיידקים משטח של הדג.</li>
			<li>חזור על הפעולות נטו (שלב 1.2.2) ומניחים את הדגים בתוך החדש של 200 מ ל סטרילי זיהום מים. לשמור את הדגים בתוך זה משך זמן הניסוי.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>המתת חסד
	<ol>
<li>כאשר הניסוי הגיעה נקודת הסיום הרצוי שלו, לקחת דגימה של הזיהום מים (15 מ ל היא בדרך כלל מספקות) כדי לאפשר מופרש ספירת חיידקים ועל המידה של שלשול (כגון mucin assay, תכולת החלבון ו/או יתר), אם הרצויה (סעיף 2).</li>
		<li>יוצקים את שארית המים דרך מחוך (כדי לאסוף את הדגים) לתוך אקונומיקה כדי להרוג את נ' cholerae במים.</li>
		<li>מניחים את הדג לתוך גביע המכילים זיהום מים בתוספת µg 336/mL של אתיל 3-aminobenzoate methanesulfonate (tricaine), דגירה הדג בפתרון זה tricaine למשך 20 דקות ב- RT. הערה: רשת הדיג חיטוי עם פתרון 10% מלבין.</li>
	</ol></li>
	<li>דיסקציה
	<ol>
<li>הכנת דגים<ol>
<li>סקופ דג מחוץ הפתרון tricaine עם כפית פלסטיק חד פעמיות ומניחים אותו על פני השטח ויבתר.</li>
			<li>מיקום הדג עם הצד הבטני פונה כלפי מעלה, pin זה דרך הלסת התחתונה, עם הצד הקהה של ה-pin בזווית מהמרכז של הגוף. במקום אחר pin רק האחורי עד פי הטבעת, גם בזווית, והגוף.</li>
		</ol>
</li>
		<li>חשיפה של מערכת העיכול<ol>
<li>ספוגית (גחוני) של הדג עם מגבון נטולת טבול 70% אתנול.</li>
			<li>לחטא סכין ומספריים Vannas על ידי טובלים אותם 70% אתנול בוער להם.</li>
			<li>עושים חתך קטן לאורכו בבטן רק מתחת לעור על ידי חדירה המאזניים באמצעות את האזמל. תיזהרי לא לחתוך יותר מדי עמוק, כמו מערכת העיכול ממוקם בדיוק מתחת לעור.</li>
			<li>בעזרת המספריים, להרחיב את החתך בקפידה לאורך הגוף, חיתוך לא עמוק יותר מאשר רמת העור והימנעות פי הטבעת.</li>
			<li>לעשות שני חתכים לרוחב עם המספריים לכיוון הראש של הדג כדי לאפשר פתיחה של החתך.</li>
			<li>להצמיד את העור בכל צד של חתכים לרוחב השטח ויבתר לדוג את הסיכות החוצה מהגוף. הערה: הקצוות של הסיכות בעבר חיטוי על ידי שלהוב אותם עם אלכוהול.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
הסרה של מערכת העיכול הערה: מערכת העיכול צריך להיות גלוי כמו צינור חיוור, רזה מאוד על האיברים האחרים.<ol>
<li>להבה-לעקר את המלקחיים ולאחר מכן להשתמש בהם כדי להסיר את כל מערכת העיכול (בדרך כלל 12-15 מ"מ אורך). מקם את המעי לתוך צינור המגון המכילה חרוזי זכוכית (ראה שלבים 1.4.1–1.4.2) ו 1 מ"ל של 1 x PBS או LB, על קרח.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>המגון
	<ol>
<li>להכין הצינורות המגון מראש מאת g ~1.5 השוטף של חרוזי זכוכית 1 מ מ לתוך 2 mL צינורות פקקי בורג (למלא אותם בערך בחצי הדרך), ואז לחטא אותם על-ידי autoclaving.</li>
		<li>להוסיף 1 מ"ל של LB סטרילי או 1 x PBS.</li>
		<li>ברגע במעי דג זברה היו מוסף (שלב 1.3.3.1) את הצינורות, בורג הפקקים בחוזקה, ולאחר מכן לאבטח את צינורות מהמגן מערבולת.</li>
		<li>Homogenize הדגימות עבור 1 דקות על ההגדרה המרבי, ולאחר מכן מגניב אותם על קרח דק 1-2 לחזור מחזור המגון זה פעם נוספת עבור המגון מלאה. הערה: מספר שיטות חלופיות המגון גם יעבוד.</li>
	</ol></li>
	<li>לכימות קולוניזציה מעיים רמות
	<ol>
<li>להכין צינורות (מבחנות זכוכית קטנים או צינורות microcentrifuge 1.5 mL) דילול homogenate טורי על-ידי הוספת µL 900 ק ג או 1 x PBS כל שפופרת. עבור כל דג, להכין 5 – 6 צינורות ולעשות דילולים טורי 10-fold של homogenate המעי על ידי הוספת µL 100 של homogenate הרכבת התחתית הראשונה, vortexing זה לערבב ולאחר מכן הוספת 100 µL ברכבת התחתית הראשונה הצינור השני.</li>
		<li>חזור על הליך זה עד דילולים כל היה מוכן.</li>
		<li>צלחת 100-200 µL של כל דילול על פלטות אגר LB המכיל 100 µg/mL של סטרפטומיצין (אם משתמשים זנים עמידים בפני סטרפטומיצין) ו- µg/mL 40 של X-גל (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside). דגירה הלוחות ב 30 מעלות צלזיוס במשך 16-18 h.</li>
		<li>לאחר לילה הדגירה, לספור מושבות נ' cholerae על הלוחות, באמצעות מונה הניתן המושבה אוטומטית או ידנית לספור את המושבות; זה עוזר לסמן את המושבות שנספרו עם טיפ סמן.</li>
		<li>לקבוע את CFU לכל דג המעי על ידי הכפלת הרוזן צלחת הגורם דילול של ההשעיה, לוקח בחשבון את עוצמת הקול זה היה מצופה.</li>
	</ol></li>
</ol>2. מדידה של דגים שלשול
הערה: ארבעה מדדים שונים שימשו להערכת דגים שלשול: רמות mucin המים, את רמות החלבון המופרשת הכוללת את המים, את יתר600 של המים, את נ' cholerae CFU מים13. שלשול בדרך כלל הופך להיות ראייה ברורה כ 6 שעות לאחר החשיפה של דג זברה כדי נ' cholerae כמתואר לעיל.
<ol><li>
לקבוע רמות mucin הערה: הפרשת Mucin הנגרמת במהלך הקולוניזציה נ' cholerae , הוא מדד טוב של רמות הפרשה, ובמיוחד בתחילת זיהום13. Mucin וזמינותו הינה וריאציה על החומצה המחזורית microtiter assay שיף19.<ol>
<li>להכין את החומרים הבאים: 50% (w/v) חומצה המחזורית פתרון מניות ו- 0.1% חומצה המחזורית הפתרון עובד (µL 10 של המניה המחזורית חומצה 50% יתווספו 5 מ ל חומצה אצטית 7% — להשתמש מיד לאחר ביצוע), mucin סטנדרטים, 96-ובכן microtiter צלחות, שיף מגיב.<ol>
<li>הכנת תקנים mucin על ידי השעיית הכמויות הבאות של mucin (מתוך הבטן חזירי סוג III) במאגר אצטט נתרן (100 מ מ סודיום אצטט, 5 מ מ EDTA, pH ל 5.5 עם חומצה אצטית): 400 µg/mL 300 µg/mL, 200 µg/mL, 150-µg/mL , µg 100/mL, µg 75/mL, µg 50/mL, µg 25/mL ו- 10 µg/mL. להכין הצלחת על-ידי הוספת µL 100 של זיהום מים כל טוב זה ישמש בבית וזמינותו כדלקמן: ריק 1 x PBS; סטנדרטים mucin כמתואר לעיל, או דגימת מים מן הזיהום דגים. כל מדגם דולר.</li>
		</ol>
</li>
		<li>להוסיף 50 µL טריים 0.1% חומצה המחזורית לפתרון אחד טוב עם פיפטה רב-ערוצי ומערבבים על ידי pipetting למעלה ולמטה מספר פעמים.</li>
		<li>עוטף את הצלחת היטב בניילון נצמד, דגירה זה ב 37 ° C עבור h 1-1.5.</li>
		<li>מגניב את הצלחת עד בטמפרטורת החדר במשך 5-10 דקות להוסיף 100 µL Fuchsin פתרון (ריאגנט של שיף) כל טוב, וכל pipet למעלה ולמטה כדי לערבב את הכל.</li>
		<li>עוטף את הצלחת בניילון נצמד, דגירה זה בטמפרטורת החדר על פלטפורמה נדנדה עד צבע פיתחה; הצבע הוא פותח בדרך כלל בתוך 20 דקות לקרוא את ספיגת-560 nm שימוש בקורא צלחת.</li>
		<li>להתוות עקומה סטנדרטי mucin (OD560לעומת µg/mL mucin רגיל). לקבוע את רמות mucin הנעלמים על ידי זיהוי איפה OD560 נודע לכל נופל על העקומה רגיל ולקרוא את הריכוז mucin המתאים עבור ערך זה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
לקבוע רמות החלבון הערה: מלבד mucin, הכולל רמות חלבון במים הם proxy נוספת עבור הרמות של שלשול (צואה מעונן, נוזלי) המיוצר על ידי הדג. הליך זה משתמש assay ברדפורד סטנדרטיים כדי להעריך את רמות החלבון. רמות החלבון מוערך על פי עיקול רגיל אלבומין שור (BSA).<ol>
<li>מערבבים 100 µL של אחד הסטנדרטים BSA (ראה הערה להלן) או 100 µL של זיהום מים (מים מן כשהספל המכיל דגים נגועים) עם µL 900 של ברדפורד ריאגנט assay (פירס חלבון assay הכימית עובד עליו היטב) ב cuvette חד פעמיות. דגירה כל דוגמאות בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות. הערה: תקני BSA הבאים שימשו: 1,800 µg/mL 1,000 µg/mL, µg 750/מ"ל, 500 µg/mL, µg 250/mL, µg 125/mL, µg 50/mL, 25 µg/mL. הסטנדרטים BSA היו מדולל במים מזוקקים בלוק.</li>
		<li>לקרוא את יתר660 של כל תקן או לטעום אותם באמצעות ספקטרופוטומטרים.</li>
		<li>מגרש העקומה סטנדרטי BSA (OD660לעומת µg/mL). לקבוע את רמות החלבון של הנעלמים על-ידי זיהוי איפה OD660 נודע לכל נופל על העקומה סטנדרטי BSA ולקרוא את הריכוז mucin המתאימים ביותר עבור ערך זה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
מדד יתר600 הערה: הנוכחות של שלשול (צואה מעונן, נוזלי) ניכרת בעליל לאחר מספר h ונחישות פשוט OD600 יכול לשמש כדי לכמת את זה.<ol>
<li>היפוך הצינור המכיל את זיהום המים מספר פעמים לפיזור אחיד של התוכן. להוסיף 1 מ"ל של דגימת מים cuvette חד פעמיות. השתמש 1 מ"ל של מים דלקת סטרילית של הפקד שלילי.</li>
		<li>לבצע מדידה "ריק" באמצעות את ספקטרופוטומטרים ב 600 nm באמצעות המדגם שליטה שלילי. לקרוא כל מדגם המים ב 600 nm ולהקליט התוצאות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
קביעת מופרש נ' cholerae CFU/mL לאחר ההדבקה הערה: מרכיב עיקרי של השלשול שמפיק את דג זברה מופרש נ' cholerae. הקביעה של CFU/mL יכול לשמש למטרות כגון הערכת את שכפול חיידקים דגים העיכול וכן מידת המינון זיהומיות בניסויים שידור. פעולה זו נעשית כאשר זיהום חלוף התרחש. אם זיהום 24 שעות ביממה, וזמינותו הזה ימדוד את inoculum משולב בתוספת של excreted נ' cholerae.<ol>
<li>קח דגימת מים בנקודת הזמן הרצויים, באופן סדרתי למהול אותו כפי שתואר לעיל.</li>
		<li>לוחית רישוי של דילולים טורי במדיה סלקטיבית (המכיל סטרפטומיצין או אנטיביוטיקה מתאימה נוספת או DCLS אגר ליברות), דגירה אותם ב 30 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה.</li>
		<li>לספור את המושבות. לחשב את CFU לכל מיליליטר מים כפי שמתואר בשלב 1.5.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Harris, J. B., LaRocque, R. C., Qadri, F., Ryan, E. T., Calderwood, S. B. <a target="_blank" href="http://www.thelancet.com/journals/lancet/article/PIIS0140-6736(12)60436-X/abstract">Cholera.</a> The Lancet. 379 (9835), 2466-2476 (2012).</li>
<li>Dutta, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibrio+cholerae+non-O1%2C+non-O139+serogroups+and+cholera-like+diarrhea%2C+Kolkata%2C+India%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Vibrio cholerae non-O1, non-O139 serogroups and cholera-like diarrhea, Kolkata, India.</a> Emerging Infectious Diseases. 19 (3), 464-467 (2013).</li>
<li>Huq, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecological+relationships+between+Vibrio+cholerae+and+planktonic+crustacean+copepods%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Ecological relationships between Vibrio cholerae and planktonic crustacean copepods.</a> Applied and Environmental Microbiology. 45 (1), 275-283 (1983).</li>
<li>Halpern, M., Landsberg, O., Raats, D., Rosenberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturable+and+VBNC+Vibrio+cholerae%3A+interactions+with+chironomid+egg+masses+and+their+bacterial+population%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Ecology%22%5BJournal%5D)">Culturable and VBNC Vibrio cholerae: interactions with chironomid egg masses and their bacterial population.</a> Microbial Ecology. 53 (2), 285-293 (2007).</li>
<li>Broza, M., Halpern, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogen+reservoirs.+Chironomid+egg+masses+and+Vibrio+cholerae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pathogen reservoirs. Chironomid egg masses and Vibrio cholerae.</a> Nature. 412 (6842), 40(2001).</li>
<li>Halpern, M., Izhaki, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fish+as+hosts+of+Vibrio+cholerae%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Fish as hosts of Vibrio cholerae.</a> Frontiers in Microbiology. 8 (282), (2017).</li>
<li>Senderovich, Y., Izhaki, I., Halpern, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fish+as+reservoirs+and+vectors+of+Vibrio+cholerae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Fish as reservoirs and vectors of Vibrio cholerae.</a> PLoS ONE. 5 (1), e8607(2010).</li>
<li>Traore, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occurrence+of+Vibrio+cholerae+in+fish+and+water+from+a+reservoir+and+a+neighboring+channel+in+Ouagadougou%2C+Burkina+Faso%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infection+in+Developing+Countries%22%5BJournal%5D)">Occurrence of Vibrio cholerae in fish and water from a reservoir and a neighboring channel in Ouagadougou, Burkina Faso.</a> The Journal of Infection in Developing Countries. 8 (10), 1334-1338 (2014).</li>
<li>Booth, L. V., Lang, D. A., Athersuch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Vibrio+cholerae+non-01+from+a+Somerset+farmworker+and+his+tropical+fish+tank%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infection%22%5BJournal%5D)">Isolation of Vibrio cholerae non-01 from a Somerset farmworker and his tropical fish tank.</a> Journal of Infection. 20 (1), 55-57 (1990).</li>
<li>Torres-Vitela, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://jfoodprotection.org/doi/abs/10.4315/0362-028X-60.3.237">Incidence of Vibrio cholerae in fresh fish and ceviche in Guadalajara, Mexico.</a> Journal of Food Protection. 60 (3), 237-241 (1997).</li>
<li>Rowe, H. M., Withey, J. H., Neely, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+model+for+zoonotic+aquatic+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+%26+Comparative+Immunology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a model for zoonotic aquatic pathogens.</a> Developmental & Comparative Immunology. 46 (1), 96-107 (2014).</li>
<li>Runft, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+natural+host+model+for+Vibrio+cholerae+colonization+and+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a natural host model for Vibrio cholerae colonization and transmission.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (5), 1710-1717 (2014).</li>
<li>Mitchell, K. C., Breen, P., Britton, S., Neely, M. N., Withey, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+Vibrio+cholerae+enterotoxicity+in+a+zebrafish+infection+model%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Quantifying Vibrio cholerae enterotoxicity in a zebrafish infection model.</a> Applied and Environmental Microbiology. , (2017).</li>
<li>Klose, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+suckling+mouse+model+of+cholera%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The suckling mouse model of cholera.</a> Trends in Microbiology. 8 (4), 189-191 (2000).</li>
<li>Formal, S. B., Kundel, D., Schneider, H., Kunevn,, Sprinz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+with+Vibrio+cholerae+in+the+ligated+loop+of+the+rabbit+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Experimental+Pathology%22%5BJournal%5D)">Studies with Vibrio cholerae in the ligated loop of the rabbit intestine.</a> British Journal of Experimental Pathology. 42, 504-510 (1961).</li>
<li>Williams, E. M., Dohadwalla, A. N., Dutta, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diarrhea+and+accumulation+of+intestinal+fluid+in+infant+rabbits+infected+with+Vibrio+cholerae+in+an+isolated+jejunal+segment%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Diarrhea and accumulation of intestinal fluid in infant rabbits infected with Vibrio cholerae in an isolated jejunal segment.</a> The Journal of Infectious Diseases. 120 (6), 645-651 (1969).</li>
<li>Spira, W. M., Sack, R. B., Froehlich, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+adult+rabbit+model+for+Vibrio+cholerae+and+enterotoxigenic+Escherichia+coli+diarrhea%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Simple adult rabbit model for Vibrio cholerae and enterotoxigenic Escherichia coli diarrhea.</a> Infection and Immunity. 32 (2), 739-747 (1981).</li>
<li>Ritchie, J. M., Rui, H., Bronson, R. T., Waldor, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Back+to+the+future%3A+studying+cholera+pathogenesis+using+infant+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Back to the future: studying cholera pathogenesis using infant rabbits.</a> mBio. 1 (1), (2010).</li>
<li>Kilcoyne, M., Gerlach, J. Q., Farrell, M. P., Bhavanandan, V. P., Joshi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periodic+acid-Schiff%27s+reagent+assay+for+carbohydrates+in+a+microtiter+plate+format%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Periodic acid-Schiff's reagent assay for carbohydrates in a microtiter plate format.</a> Analytical Biochemistry. 416 (1), 18-26 (2011).</li>
<li>Balaji, V., Sridharan, G., Jesudason, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxicity+of+non+O1%2C+non+O139+Vibrios+isolated+from+fresh+water+bodies+in+Vellore%2C+south+India%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+Journal+of+Medical+Research%22%5BJournal%5D)">Cytotoxicity of non O1, non O139 Vibrios isolated from fresh water bodies in Vellore, south India.</a> Indian Journal of Medical Research. 110, 155-159 (1999).</li>
<li>Hasan, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nontoxigenic+Vibrio+cholerae+non-O1%2FO139+isolate+from+a+case+of+human+gastroenteritis+in+the+U.S.+Gulf+Coast%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Nontoxigenic Vibrio cholerae non-O1/O139 isolate from a case of human gastroenteritis in the U.S. Gulf Coast.</a> Journal of Clinical Microbiology. 53 (1), 9-14 (2015).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

דג זברה היא מודל חדש יחסית ללמוד נ' cholerae אך טומן בחובו הרבה הבטחה הגילוי העתידי של היבטים לא מוכרת של נ' cholerae ביולוגיה ו פתוגנזה11,12,13 . המודל דג זברה למבוגרים יש את היתרונות של להיות טבעי שני מארח נ' cholerae המכיל microbiota מעיים ללא פגע, בוגרת ומודל סביבתיים. החסרונות של המודל הם שני הגורמים העיקריים התקפה אלימה אנושי, הרעלן כולרה, הרעלן-coregulated pilus, אינם נדרשים עבור דג זברה מושבת א...

ויבריו cholerae הוא חיידק הימית, גראם שליליים, הגורמת של מחלות אנושיות כולרה, כמו גם שלשול נמשך "טפטוף"1,2. (פ') cholerae נמצא בסביבה בתחומים רבים של העולם, קשורה לעיתים קרובות עם אורגניזמים ימיים אחרים. אורגניזמים שיוך אלה כוללים פלנקטון, ביצה חרקים ההמונים, רכיכה חוליות דגים מינים3,4,5,6,7. מספר מחקרים שללו נ' cholerae מ ספינלי מעיים של דגים ב אזורים גאוגרפיים שונים7,8,9,10. הנוכחות של נ' cholerae בדגים מציין כי דגים עשוי לפעול כמו מאגר הסביבה. גם יכול להיות מעורב דגים בהעברת המחלה לבני, פיזור גיאוגרפי נ' cholerae זנים6.
כדי להבין טוב יותר איך נ' cholerae אינטראקציה עם דגים, רזבורה rerio, הידועה יותר בשם דג זברה, פותחה כמערכת מודל לימוד נגד כולרהe11. דג זברה הם ילידי דרום אסיה, כולל באזור מפרץ בנגל, אשר נחשב מאגר המוקדם של נ' cholerae. עד הראשון כולרה מגיפה בשנת 1817, כולרה לא דווח כי מחוץ מה שעכשיו הודו ובנגלדש. לכן, דג זברה, נ' cholerae כמעט בוודאות הקשורים אחד לשני על סולמות אבולוציוני, רומז כי דג זברה הם שורה נ' cholerae הסביבה הטבעית12.
דג זברה המודל נ' cholerae פשוטה לביצוע והוא יכול לשמש כדי לחקור את כל פתוגניים נ' cholerae מחזור החיים. דגים נחשפים נ' cholerae על ידי רחצה במים אשר חיסנה עם מספר ידוע של נ' cholerae. בתוך מספר שעות, קולוניזציה מעיים מתקיים, ואחריו את הייצור של שלשול. שלשול מורכב mucin, חלבונים, החיידקים מופרש ותוכן מעיים אחרים. ניתן לכמת את מידת שלשול באמצעות מדידות פשוטות מספר13. (פ') cholerae זה יש כבר מופרש על ידי דגים נגועים יכול להמשיך להדביק לדגים נאיביים, להשלמת המעגל זיהומיות. לפיכך, המודל דג זברה recapitulates נ' cholerae מחלות אנושיות תהליך12,14.
בשימוש לעתים קרובות ביותר נ' cholerae חייתיים היו עכברים וארנבות,14,15,16,17,18. מודלים אלה סייעו בהוספת לידע שלנו של נ' cholerae פתוגנזה. עם זאת, כי עכברים וארנבות, אינם טבעיים נ' cholerae מארחים, קיימות מגבלות אילו היבטים של מחזור חיי נ' cholerae יכול להילמד. הקולוניזציה נ' cholerae של עכברים וארנבות, דורש בדרך כלל העדר של microbiota מעיים או רעלני באנטיביוטיקה כדי לפגוע microbiota של המעי. שני הדגמים דורשים gavage להציג לחיידקים מערכת העיכול או מניפולציה כירורגי ישירות להחדיר את החיידקים לתוך המעיים. דג זברה יש יתרון בכך דג בוגר עם microbiota מעיים ללא פגע הם התנחלו בקלות תהליך זיהומיות קורה באופן טבעי, ללא כל פעולה הדרושה.
העבודה הנוכחית ממחישה את הניצול של דג זברה כמודל באיזמיר נ' cholerae זיהום. הזיהום, דיסקציה, ספירה של להמדינות נ' cholerae, כימות של שלשול הנגרם על ידי נ' cholerae יהיה לתאר12,13. מודל זה סביר להניח שתהיה שימושית למדענים מעוניין תהליך המחלה נ' cholerae והן בסגנון נ' cholerae סביבתיים.

<table><tbody><tr><td><חזק>מכשיר</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>חממת שייקר</td><td>ניו ברונסוויק סיינטיפיק, אדיסון, ניו ג'רזי</td><td>אקסלה E25</td><td></td></tr><tr><td>אינקובטור</td><td>NUAIRE, פלימות', MN</td> ספקטרופוטומטר <td>זרימה</td><td></td>אוטומטית</tr><tr><td></td><td>תרמו, וולת'אם, MA</td><td>Geaesys 6</td><td></td></tr><tr><td>Vortex הומוגנייזר</td><td>Minibeadbeater24</td><td>112011</td><td></td></tr><tr><td>מכונת שקילה</td><td>Ohaus, קולומביה, MD</td><td>Adventurer Pro</td><td></td></tr><tr><td>מערבל חום</td><td>קורנינג, קורנינג, ניו יורק</td><td>PC-420D</td><td></td></tr><tr><td>מבער מונה</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מושבה אוטומטי</td><td>REVSCI</td><td>120417B</td><td></td></tr><tr><td><חזק>חומרים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>400 מ"ל כוסות זכוכית</td><td>פיירקס</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מכסים מחוררים</td><td>מחזיק מיקרוטיפ עם חורים מקופסת</td><td></td><td></td>קצה</tr><tr><td>כפיות פלסטיק חד פעמיות</td><td>אופיס דיפו, בוקה רטון, FL</td><td>D15-25-7008</td><td></td></tr><tr><td>מערכת מיכלי דגים</td><td>Aquaneering, סן דייגו, קליפורניה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RO מטהר מים</td><td>Aqua FX</td><td>TK001</td><td></td></tr><tr><td>רשת דגים</td><td>מרינה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מזון דגים</td><td>טטרה סנפיר</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מותג הג'ונגל האדום</td> <td>שרימפס מלח</td><td>O.S.I. pro 80</td><td></td></tr><tr><td>לוח</td><td></td><td></td><td></td>קלקר</tr><tr><td>סיכות</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אזמל</td><td>כלים מדעיים משובחים, פוסטר סיטי, קליפורניה</td><td>10000-10</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים</td><td>כלים מדעיים משובחים, פוסטר סיטי, קליפורניה</td><td>11223-20</td><td></td></tr><tr><td>מספריים Vannas</td><td>Fine Scientific כלים, פוסטר סיטי, CA</td><td>15000-11</td><td></td></tr><tr><td>צינורות כובע בורג 2 מ"ל</td><td>פישר סיינטיפיק, המפטון, NH</td><td>02-681-375</td><td></td></tr><tr><td>חרוזי זכוכית 1 מ"מ</td><td>Bio Spec</td><td>11079110</td><td></td></tr><tr><td>חרוזי זכוכית להפצת</td><td>סיגמא, סנט לואיס, MO</td><td>18406-500G</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי</td><td>פישר ברנד, המפטון, NH</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>צינור צנטריפוגה 1.5 מ"ל</td><td>Midsci, Valley Park, MO</td><td>AVSS1700</td><td></td></tr><tr><td>צינור צנטריפוגה 50 מ"ל</td><td>קורנינג פלקון, קורנינג, ניו יורק</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>מבחנות</td><td>פיירקס</td><td>9820</td><td></td></tr><tr><td>פיפטת</td><td>זכוכית פישר ברנד, המפטון, NH</td><td>13675K</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו פיפטות</td><td>Sartorius Biohit, G&ouml; ttingen, גרמניה</td><td>m1000/m200/m20</td><td></td></tr><tr><td>טיפים</td><td>Genesee Scientific, סן דייגו, קליפורניה</td><td>24-150RS/24-412</td><td></td></tr><tr><td>כימיקלים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מלחי אוקיינוס מיידיים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>פוספט חוצץ</td><td>מלח VWR Life Science, Radnor, PA</td><td>K813-500 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>טריקאין (אתיל 3-אמינובנזואט מתאנסולפונאט מלח</td><td>סיגמא, סנט לואיס, MO</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-&beta;-D-galactopyranoside</td><td>Sigma, סנט לואיס, MO</td><td>10651745001</td><td></td></tr><tr><td>Schiff' s מגיב</td><td>סיגמה, סנט לואיס, MO</td><td>84655-250 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>חומצה תקופתית</td><td>פישר סיינטיפיק, המפטון, NH</td><td>10450-60-9</td><td></td></tr><tr><td>מוצין מקיבה חזירית</td><td>סיגמה, סנט לואיס, MO</td><td>M2378-100G</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר</td><td>פישר סיינטיפיק, המפטון, NH</td><td>9046-46-8</td><td></td></tr><tr><td>פירס 660 ננומטר מגיב לבדיקת חלבון</td><td>תרמו, וולת'אם, MA</td><td>22660</td><td></td></tr><tr><td>LB בינוני</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypton</td><td>BD Biosciences, סן חוזה, קליפורניה</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>תמצית משמרות</td><td>BD Biosciences, סן חוזה, קליפורניה</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>NACL</td><td>Fisher Scientific, המפטון, NH</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>BD Biosciences, סן חוזה, קליפורניה</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>TCBS אגר</td><td>BD Biosciences, סן חוזה, קליפורניה</td><td>265020</td><td></td></tr><tr><td>DCLS Agar</td><td>Sigma, סנט לואיס, MO</td><td>70135-500gm</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Office</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>פריזמה 5</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

לכימות ויבריו cholerae קולוניזציה ושלשולים במודל דג זברה למבוגרים

Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model

ויבריו cholerae ידועה בתור הסוכן זיהומיות הגורמת הכולירע מחלות אנושיות. בחוץ הפונדקאי. האנושי, נ' cholerae בעיקר קיימת בסביבה המימית, איפה זה מקיים אינטראקציה עם מגוון מינים ימיים גבוה יותר. דגים חוליות ידועים להיות מארח הסביבה והם פוטנציאל נ' cholerae מאגר בטבע. גם נ' cholerae וגם מיני דגים teleost רזבורה rerio, הידוע בכינויו דג זברה, מקורן היבשת ההודית, רומז על אינטראקציה ארוכת שנים בסביבות מימיות. דג זברה הם אורגניזם מודל אידיאלי ללמוד היבטים רבים של ביולוגיה, כולל מחלות זיהומיות. דג זברה יכול בקלות, במהירות קולוניה נ' cholerae לאחר חשיפה במים. קולוניזציה מעיים מאת נ' cholerae מוביל את הייצור של שלשול הפרשה של משוכפלים נ' cholerae. אלה מופרש חיידקים יכולים אז קדימה ליישב פונדקאים חדשים של דגים. כאן, אנחנו מדגימים כיצד להעריך נ' cholerae-קולוניזציה מעיים דג זברה ואיך לכמת נ' cholerae-induced דג זברה שלשול. המודל קולוניזציה צריך להועיל לחוקרים הלומדים אם הגנים של עניין עשוי להיות חשוב עבור המארח קולוניזציה ו/או להישרדות סביבתיים. כימות של דג זברה שלשול צריך להיות שימושי החוקרים ללמוד כל פתוגן מעיים המעוניינים לחקור את דג זברה כמערכת מודל.

(פ') cholerae התיישבות ספינלי מעיים דג זברה
כדי לספק דוגמה של רמות קולוניזציה אופייני שלנו להתבונן, אנחנו מחוסן 5 x 106 CFU של מגיפת באל תור נ' cholerae המתח N16961 ב 200 מ של מים בתוך המכיל מספר דג זברה. לאחר 6 שעות של זיהום, הדגים היו נשטפים במים מתוקים והועבר לתוך גביע 200 מיליליטר מים זיהום בלוק כמפורט בפרוטוקול. 18 h לאחר העברה (או 24 שעות לאחר ההדבקה העיקרית), הדגים היו מורדמים, והמעיים שלהם נלקחו...

דג זברה הם טבעיים ויבריו cholerae לארח והוא יכול לשמש מסכם את הדברים וללמוד כל מחזור זיהומיות של קולוניזציה שידור. כאן, אנחנו מדגימים כיצד להעריך נ' cholerae קולוניזציה רמות ולכמת שלשול אצל דג זברה.

Vibrio cholerae is best known as the infectious agent that causes the human disease cholera. Outside the human host, V. cholerae primarily exists in the ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הוויבריו כולרה, כגון כיצד הוויבריו כולרה מתיישב בחוף השקט ומתחרה במיקרוביוטת המעי כדי לבסס נישה. היתרון העיקרי של השיטה הזו הוא שדגים הם מארח ויבריו כולרה טבעי, כך שאנו יכולים לחקור את מחזור החיים המלא של ויבריו כולרה. ידגימו את ההליך דרובג'יוטי נאג, פוסט-דוקטורנט מהמעבדה שלי ופול ברין, דוקטורנט מהמעבדה שלי.לאחר הכנת תרביות V.cholerae, יש לחסן את דג הזברה על ידי טבילה. ראשית, הכניסו ארבעה או חמישה דגי זברה לכוס של 400 מיליליטר המכילה 200 מיליליטר של מי זיהום סטריליים. לאחר מכן הוסף מיליליטר אחד של תרבית V.cholerae לריכוז הזיהום הרצוי.לאחר מכן, מכסים את הכוס במכסה מחורר. לאחר הכנת כל הכוסות, העבירו אותן לאינקובטור קדמי מזכוכית המוגדר על 28 מעלות צלזיוס לחשיפה חולפת, לאחר כשש שעות, שפכו את מי הכוס דרך רשת דייגים כדי לאסוף את הדגים. יש להשליך את המים הנגועים באקונומיקה כדי להרוג את החיידקים.לאחר מכן, הכניסו את הדג ל-200 מיליליטר של מי זיהום סטריליים למשך חמש דקות. לאחר חמש דקות, העבירו את המים האלה דרך רשת דייגים, והשליכו את המים לאקונומיקה. כעת, הדג יכול להיכנס לכוס נקייה חדשה עם 200 מיליליטר של מי זיהום סטריליים.כאשר הניסוי הגיע לנקודת הסיום הרצויה, קח דגימה של 15 מיליליטר ממי הזיהום למטרות אבחון. לאחר מכן אספו את הדגים והשליכו את המים הנגועים כראוי. כוון את הצד הגחוני כלפי מעלה ואבטח את הגוף בעזרת סיכה דרך הלסת התחתונה וסיכה נוספת ממש אחורית לפי הטבעת.זווית את שני הפינים הרחק מהגוף. לאחר מכן, נגב את פני הגחון של הדג עם 70% אתנול. לאחר מכן, עקרו אזמל ומספריים של Vannas באמצעות 70% אתנול ולהבה.כעת, בעזרת האזמל, בצע חתך קטן לאורכו בבטן החודר לקשקשים, אך חותך רק עמוק כמו העור. לאחר מכן, בעזרת המספריים, האריכו את החתך בזהירות לאורך הגוף, וחתכו לא עמוק יותר מגובה העור. הימנע מחיתוך פי הטבעת.לאחר מכן בצע שני חתכים לרוחב לכיוון הראש כדי להרחיב את הפתח. לאחר מכן, הצמידו את העור מכל צד של החתכים הרוחביים למשטח הניתוח, תוך הפניית הסיכות החוצה, הרחק מהגוף. מערכת העיכול אמורה להיראות כעת כצינור דק מאוד וחיוור.כעת, השתמש בשני זוגות מלקחיים מעוקרים להבה כדי להסיר בזהירות את כל מערכת העיכול שיכולה להיות שבירה למדי. העבירו את הרקמה לתוך צינור הומיניזציה המכיל חרוזי זכוכית ומיליליטר אחד של חיץ קר. לאחר מכן, הומוגניזציה של הרקמות כמתואר בפרוטוקול הטקסט וכימת רמות קולוניזציה במעי.לאחר מכן, בצע דילולים סדרתיים של הומוגנט המעי. לכל דג הכינו חמישה או שישה דילולים פי עשרה בנפחים של מיליליטר אחד. מערבולת את הצינורות לערבוב.לאחר מכן, צלחת 100 עד 200 מיקרוליטר מכל דילול על לוחות אגר LB המכילים סטרפטומיצין ו-X-gal. דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך 16 עד 18 שעות. לאחר הדגירה של הלילה, ספרו את מושבות ה-V.cholerae על הצלחות.חיידקים אלה מייצרים בדרך כלל מושבות כחולות בהירות על מדיום LB עם X-gal. אם נצפות מספר מורפולוגיות מושבה, טלאי כמה מושבות של כל מורפולוגיה שונה על צלחת TCBS שונה. ב-TCBS, V.cholerae מייצר מושבות צהובות גדולות ושטוחות מעט עם מרכזים אטומים והיקפים שקופים.כדי לקבוע את רמות המוצין בשלשול דגים, בצע בדיקה על צלחת 96 בארות. בשלוש עותקים, טען 100 מיקרוליטר של מי זיהום עבור כל מצב בדיקה, כולל ריק, לבארות. לאחר מכן, מערבבים פנימה 50 מיקרוליטר של תמיסת חומצה תקופתית טרייה של 0.1% לכל באר בדיקה.השתמש בפיפטינג כדי לערבב. לאחר מכן, עטפו את הצלחת היטב בניילון ודגרו את הצלחת בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה עד שעה וחצי. לאחר הדגירה יש לקרר את הצלחת לטמפרטורת החדר.לכל באר מוסיפים 100 מיקרוליטר תמיסת פוקסין ומערבבים עם פיפטינג. כעת, עטפו מחדש את הצלחת והניחו אותה על נדנדה בטמפרטורת החדר. תוך כ-20 דקות, קרא את הצלחת ב-560 ננומטר באמצעות קורא צלחות.לכמת את התגובה הנגרמת על ידי מוצין בתמיסה. כדי למדוד את רמות החלבון בשלשול דגים השתמש במבחן ברדפורד. מערבבים 66 מיקרוליטר של אחד מתקני ה-BSA או 66 מיקרוליטר מי זיהום עם 1,000 מיקרוליטר של מגיב בדיקת ברדפורד בקובטה חד פעמית.כעת, דגרו את הדגימות בטמפרטורת החדר למשך שתי דקות. ואז לקרוא את הספיגה ב-660 ננומטר בספקטרופוטומטר. מדד פשוט לכמות השלשול הוא העכירות במים הנמדדת ב-600 ננומטר.מערבבים היטב את המים, מוסיפים מיליליטר אחד לקובטה חד פעמית ומבצעים מדידה. למדידה בסיסית, ריקה, השתמש במי זיהום נקיים. ניתן למדוד גם את חיידקי V.cholerae המופרשים.ניתן לעשות זאת עם דגים שהועברו למים נקיים לאחר החיסון. בצע דילולים סדרתיים של אליקווט של מי מיכל כפי שתואר קודם לכן. לאחר מכן צלחו את הדילולים על מדיה סלקטיבית ודגרו על הצלחות בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.מאוחר יותר, ספרו את המושבות כפי שתואר קודם לכן ולאחר מכן קבעו את ה-CFU. קבוצות של דגי זברה ששוכנו ב-200 מיליליטר מים חוסנו בחמישה מיליון CFU של כולרה מגיפה. לאחר שש שעות במים נגועים בחיידקים, הדגים עוברים למים נקיים למשך 18 שעות.לאחר מכן נקצרו מעי האוויר. כל דג הכיל כ-100,000 עד 1,000,000 תאי V.cholerae. מי הזיהום שימשו לבדיקות אחרות.רמות המוצין היו גבוהות יותר כאשר המינונים הזיהומיים היו גבוהים יותר. ה-OD600 של המים היה גבוה משמעותית כאשר דגים נדבקו ב-V.cholerae. לבסוף, רמת החלבון הכוללת במי הדגים הנגועים הייתה כמעט כפולה מזו שנצפתה במים של הדגים הלא נגועים.לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להדביק דג זברה בוגר בויבריו כולרה ולכמת שלשול הנגרם על ידי הזיהום. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כמו מבחני העברה, כדי להעריך הדבקה של דגים נאיביים על ידי דגים שנדבקו בעבר.

quantifying-vibrio-cholerae-colonization-diarrhea-adult-zebrafish

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

מקור: ברנוט, א., ואח', פענוח והדמיה של פתוגנזה ודימות של מיקובקטריום אבססיסוס בעוברי דגי זברה. J. Vis. Exp. (2015).הסרטון הזה מדגים פרוטוקול לבידוד וכימות של Mycobacterium abscessus מעובר דג זברה נגוע. ההליך כולל המתת חסד של עוברים, ניתוק רקמות והומוגניזציה לשחרור החיידקים, ולאחר מכן צנטריפוגה והשעיה מחדש בבופר סורפקטנטים. לבסוף, ההשעיה החיידקית מדוללת באופן סדרתי, מצופה על אגר עם תוספת אנטיביוטיקה, ומודגרת כדי לאפשר יצירת מושבות וכמות.

בידוד וגידול חיידקים מעוברי דגי זברה להערכת עומס זיהום

מקור: נג, ד. ואחרים. כימות קולוניזציה ושלשול של ויבריו כולרה במודל דגי זברה בוגרים. J. Vis. Exp. (2018)הסרטון הזה מדגים פרוטוקול לכימות העומס החיידקי במעיים בדגי זברה בוגרים שנדבקו בזן עמיד לאנטיביוטיקה של Vibrio cholerae. לאחר המתת חסד ונתיחה, מערכת העיכול מבודדת, מתאחדת עם חרוזי זכוכית, ומעובדת לשחרור החיידקים. ההומוגנט המתקבל מצופה על מדיום סלקטיבי, ומושבות בצבע כחול המבטאות β-גלקטוזידאז נספרות כדי להעריך את נטל החיידקים.

כימות עומס חיידקים במעי בדגי זברה הנגועים ב-Vibrio cholerae

מקור: נאג, ד., et.al. כימות קולוניזציה ושלשול של ויבריו כולרה במודל דגי זברה בוגרים. J. Vis. Exp. (2018)הסרטון הזה מדגים את החיסון של דגי זברה בוגרים בזן פתוגני Vibrio cholerae כדי לחקור קולוניזציה במעי ותוצאות מחלות. הוא מראה כיצד רעלים חיידקיים מפריעים לשלמות המעי, מה שמוביל לדליפת נוזלים, הפרשת ריר ושלשול מימי לפני שהדגים מוכנים לניתוח נוסף.

התיישבות מעיים והשראת שלשול על ידי Vibrio cholerae בדגי זברה בוגרים

מקור: פלורס, א. ואחרים. שימוש בפרוטוזואן Paramecium caudatum ככלי לזיהומים המועברים במזון בזחלי דגי זברה. J. Vis. Exp. (2019).הסרטון הזה מדגים את השיטה לקביעת מודל זיהום חיידקי במעי המועבר במזון לזחלי דגי זברה על ידי האכלה בפרמסיה הנגועה ב-E. coli פלואורסצנטי.

מידול זיהום במעי בזחלי דגי זברה באמצעות חיידקים המועברים במזון

סרטון זה מדגים שיטה לכימות זיהום פטרייתי בזחלי דגי זברה. נבגי פטריות מוזרקים במיקרו לחדר המוח האחורי של הזחל, והזחלים מודגרים כדי לאפשר התפתחות זיהום. הזחלים הנגועים נקצרים בפרקי זמן מוגדרים, והתקדמות ההדבקה מוערכת על ידי ספירת יחידות יוצרות מושבות.

טכניקה לכימות זיהום פטרייתי בזחלי דגי זברה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול שחפת אנוש מודל דג זברה למבוגרים באמצעות הפתוגן הטבעי שלה, התחממות עולמית. חילוץ DNA ו- RNA של האיברים הפנימיים של דג זברה נגוע יכול לשמש כדי לחשוף את שהסכום הכולל mycobacterial טוען את הדגים, של המחשב המארח תגובות מערכת החיסון עם qPCR.

מידול שחפת ב דג נגוע זברה בוגרת התחממות עולמית

הפרוטוקול מתאר נלוקסון דג זברה למבוגרים עם ביולוגי; לאחר מכן לנתח, הכנת המעי עבור cytometry, מיקרוסקופיה קונפוקלית ו- qPCR. שיטה זו מאפשרת ניהול של תרכובות ביו לעקוב אחר ספיגת מעיים ואת הגירוי המערכת החיסונית המקומית עורר. זה רלוונטי לבדיקה את הדינמיקה מעיים של אמצעי מניעה שבעל-פה.

צנרור שבעל-פה של דג זברה למבוגרים: מודל להערכת ספיגת מעיים של תרכובות ביו

כאן נתאר החיסונים של הבוגרים דג זברה (רזבורה rerio) עם חיסון מבוסס DNA עבור פרוטוקול להדגים את האימות של אירוע מוצלח חיסון. שיטה זו מתאימה להקרנה פרה של החיסון מועמדים במודלים שונים של זיהום.

חיסונים של דג זברה בוגרת להקרנה פרה של חיסונים מבוסס DNA

דג זברה (רזבורה rerio) הופכים נפוץ חוליות במודל חיה מושבת חיידקים, פתוגנזה. פרוטוקול זה המתאר את השימוש protozoan סנדלית caudatum כרכב שמקורם במזון זיהום בדג זברה הזחלים. Caudatum פ ברצון ולהרזיה חיידקים, לקבל נלקח על ידי דג זברה זחל דרך ההתנהגות טרף ושהם הטבעיים.

באמצעות את Protozoan סנדלית caudatum כמו רכב עבור זיהומים שמקורם במזון הזחלים דג זברה

מוצג כאן הוא שיטה יעילה ובטוחה כדי להדביק הזחלים דג זברה עם התווית fluorescently באופן אנאירובי C. הקושי על ידי הזרקת microinjection ו פולשני.

פיתוח מודל לזיהום של זחל בדג במשך שינוי קושי

פרוטוקול זה מתאר את השלבים העיקריים להשגת עוברי דגים נטולי חיידקים (GF) ושמירה עליהם מהזחלים ועד לשלב הנעורים, כולל דגימה וגילוי מצבם הסטרילי. השימוש במודלים של GF עם זיהום חשוב להבנת תפקיד המיקרובים בבריאות המאכסן.

ייצור, תחזוקה וזיהוי של מודלים של דגי זברה נטולי חיידקים מזחלים ועד שלבים צעירים

למדו כיצד לכמת קולוניזציה של Vibrio cholerae ושלשולים בדגי זברה בוגרים. שיטה זו מאפשרת חקר מחזור החיים המלא של החיידק בפונדקאי טבעי ותורמת להבנת דינמיקת ההדבקה.

לכימות ויבריו cholerae קולוניזציה ושלשולים במודל דג זברה למבוגרים

גלה סרטונים נוספים