לכימות ויבריו cholerae קולוניזציה ושלשולים במודל דג זברה למבוגרים

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הוויבריו כולרה, כגון כיצד הוויבריו כולרה מתיישב בחוף השקט ומתחרה במיקרוביוטת המעי כדי לבסס נישה. היתרון העיקרי של השיטה הזו הוא שדגים הם מארח ויבריו כולרה טבעי, כך שאנו יכולים לחקור את מחזור החיים המלא של ויבריו כולרה. ידגימו את ההליך דרובג'יוטי נאג, פוסט-דוקטורנט מהמעבדה שלי ופול ברין, דוקטורנט מהמעבדה שלי.

לאחר הכנת תרביות V.cholerae, יש לחסן את דג הזברה על ידי טבילה. ראשית, הכניסו ארבעה או חמישה דגי זברה לכוס של 400 מיליליטר המכילה 200 מיליליטר של מי זיהום סטריליים. לאחר מכן הוסף מיליליטר אחד של תרבית V.cholerae לריכוז הזיהום הרצוי.

לאחר מכן, מכסים את הכוס במכסה מחורר. לאחר הכנת כל הכוסות, העבירו אותן לאינקובטור קדמי מזכוכית המוגדר על 28 מעלות צלזיוס לחשיפה חולפת, לאחר כשש שעות, שפכו את מי הכוס דרך רשת דייגים כדי לאסוף את הדגים. יש להשליך את המים הנגועים באקונומיקה כדי להרוג את החיידקים.

לאחר מכן, הכניסו את הדג ל-200 מיליליטר של מי זיהום סטריליים למשך חמש דקות. לאחר חמש דקות, העבירו את המים האלה דרך רשת דייגים, והשליכו את המים לאקונומיקה. כעת, הדג יכול להיכנס לכוס נקייה חדשה עם 200 מיליליטר של מי זיהום סטריליים.

כאשר הניסוי הגיע לנקודת הסיום הרצויה, קח דגימה של 15 מיליליטר ממי הזיהום למטרות אבחון. לאחר מכן אספו את הדגים והשליכו את המים הנגועים כראוי. כוון את הצד הגחוני כלפי מעלה ואבטח את הגוף בעזרת סיכה דרך הלסת התחתונה וסיכה נוספת ממש אחורית לפי הטבעת.

זווית את שני הפינים הרחק מהגוף. לאחר מכן, נגב את פני הגחון של הדג עם 70% אתנול. לאחר מכן, עקרו אזמל ומספריים של Vannas באמצעות 70% אתנול ולהבה.

כעת, בעזרת האזמל, בצע חתך קטן לאורכו בבטן החודר לקשקשים, אך חותך רק עמוק כמו העור. לאחר מכן, בעזרת המספריים, האריכו את החתך בזהירות לאורך הגוף, וחתכו לא עמוק יותר מגובה העור. הימנע מחיתוך פי הטבעת.

לאחר מכן בצע שני חתכים לרוחב לכיוון הראש כדי להרחיב את הפתח. לאחר מכן, הצמידו את העור מכל צד של החתכים הרוחביים למשטח הניתוח, תוך הפניית הסיכות החוצה, הרחק מהגוף. מערכת העיכול אמורה להיראות כעת כצינור דק מאוד וחיוור.

כעת, השתמש בשני זוגות מלקחיים מעוקרים להבה כדי להסיר בזהירות את כל מערכת העיכול שיכולה להיות שבירה למדי. העבירו את הרקמה לתוך צינור הומיניזציה המכיל חרוזי זכוכית ומיליליטר אחד של חיץ קר. לאחר מכן, הומוגניזציה של הרקמות כמתואר בפרוטוקול הטקסט וכימת רמות קולוניזציה במעי.

לאחר מכן, בצע דילולים סדרתיים של הומוגנט המעי. לכל דג הכינו חמישה או שישה דילולים פי עשרה בנפחים של מיליליטר אחד. מערבולת את הצינורות לערבוב.

לאחר מכן, צלחת 100 עד 200 מיקרוליטר מכל דילול על לוחות אגר LB המכילים סטרפטומיצין ו-X-gal. דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך 16 עד 18 שעות. לאחר הדגירה של הלילה, ספרו את מושבות ה-V.cholerae על הצלחות.

חיידקים אלה מייצרים בדרך כלל מושבות כחולות בהירות על מדיום LB עם X-gal. אם נצפות מספר מורפולוגיות מושבה, טלאי כמה מושבות של כל מורפולוגיה שונה על צלחת TCBS שונה. ב-TCBS, V.cholerae מייצר מושבות צהובות גדולות ושטוחות מעט עם מרכזים אטומים והיקפים שקופים.

כדי לקבוע את רמות המוצין בשלשול דגים, בצע בדיקה על צלחת 96 בארות. בשלוש עותקים, טען 100 מיקרוליטר של מי זיהום עבור כל מצב בדיקה, כולל ריק, לבארות. לאחר מכן, מערבבים פנימה 50 מיקרוליטר של תמיסת חומצה תקופתית טרייה של 0.1% לכל באר בדיקה.

השתמש בפיפטינג כדי לערבב. לאחר מכן, עטפו את הצלחת היטב בניילון ודגרו את הצלחת בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה עד שעה וחצי. לאחר הדגירה יש לקרר את הצלחת לטמפרטורת החדר.

לכל באר מוסיפים 100 מיקרוליטר תמיסת פוקסין ומערבבים עם פיפטינג. כעת, עטפו מחדש את הצלחת והניחו אותה על נדנדה בטמפרטורת החדר. תוך כ-20 דקות, קרא את הצלחת ב-560 ננומטר באמצעות קורא צלחות.

לכמת את התגובה הנגרמת על ידי מוצין בתמיסה. כדי למדוד את רמות החלבון בשלשול דגים השתמש במבחן ברדפורד. מערבבים 66 מיקרוליטר של אחד מתקני ה-BSA או 66 מיקרוליטר מי זיהום עם 1,000 מיקרוליטר של מגיב בדיקת ברדפורד בקובטה חד פעמית.

כעת, דגרו את הדגימות בטמפרטורת החדר למשך שתי דקות. ואז לקרוא את הספיגה ב-660 ננומטר בספקטרופוטומטר. מדד פשוט לכמות השלשול הוא העכירות במים הנמדדת ב-600 ננומטר.

מערבבים היטב את המים, מוסיפים מיליליטר אחד לקובטה חד פעמית ומבצעים מדידה. למדידה בסיסית, ריקה, השתמש במי זיהום נקיים. ניתן למדוד גם את חיידקי V.cholerae המופרשים.

ניתן לעשות זאת עם דגים שהועברו למים נקיים לאחר החיסון. בצע דילולים סדרתיים של אליקווט של מי מיכל כפי שתואר קודם לכן. לאחר מכן צלחו את הדילולים על מדיה סלקטיבית ודגרו על הצלחות בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.

מאוחר יותר, ספרו את המושבות כפי שתואר קודם לכן ולאחר מכן קבעו את ה-CFU. קבוצות של דגי זברה ששוכנו ב-200 מיליליטר מים חוסנו בחמישה מיליון CFU של כולרה מגיפה. לאחר שש שעות במים נגועים בחיידקים, הדגים עוברים למים נקיים למשך 18 שעות.

לאחר מכן נקצרו מעי האוויר. כל דג הכיל כ-100,000 עד 1,000,000 תאי V.cholerae. מי הזיהום שימשו לבדיקות אחרות.

רמות המוצין היו גבוהות יותר כאשר המינונים הזיהומיים היו גבוהים יותר. ה-OD600 של המים היה גבוה משמעותית כאשר דגים נדבקו ב-V.cholerae. לבסוף, רמת החלבון הכוללת במי הדגים הנגועים הייתה כמעט כפולה מזו שנצפתה במים של הדגים הלא נגועים.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להדביק דג זברה בוגר בויבריו כולרה ולכמת שלשול הנגרם על ידי הזיהום. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כמו מבחני העברה, כדי להעריך הדבקה של דגים נאיביים על ידי דגים שנדבקו בעבר.