מיקרוסקופ אור גיליונות פלורסצנטיות לחקר הלב מאתר

היתרון העיקרי של טכנולוגיה זו הוא שהיא מאפשרת הדמיה מהירה של לב העכבר. וזה יכול לשמש כדי לבחון את נוכחותם של ערוצי אוויר לאחר ריפוי גנטי. למרות שיטה זו יכולה לספק תובנה לתוך קרדיולוגיה פיתוח, זה יכול להיות מיושם גם על מערכות אחרות, כגון נוירולוגיה ופולמונולוגיה.

בדרך כלל, אנשים יתקשו עם טכניקה זו כי הרכבה הדמיה של לב העכבר הבוגר יכול להיות קשה, וזה שונה טכניקות אחרות, מסורתיות, כגון מיקרוסקופיה קונפוקל הפוכה. מניחים לייזר גל מתמשך עם שלושה אורכי גל של 405 ננומטר, 473 ננומטר, ו 532 ננומטר. לאחר מכן, להדביק לשקף אחד וליישר אותו עם מישור המראה ב 45 מעלות לקורה.

פעולה זו תכוון את הלייזר לכיוון מפצל הקרן, המהווה את מערך התאורה הדו-צדדי. לאחר מכן, העבירו את הקרן דרך מסנן צפיפות נייטרלי בקוטר 50 מ"מ, מרחיב קרן וחור סיכה בקוטר 25 מ"מ, כולם ממוקמים במרחק של 150 מילימטרים זה מזה. מעבירים את הקורה דרך מפצל קרן 50-50, ממוקם 150 מילימטרים מהחור.

לאחר מכן, מניחים את המראה שני 150 מילימטרים ממפצל הקרן, ב 90 מעלות לקרן הקדמית, וליישר אותו כך מישור המראה שלה הוא בזווית של 45 מעלות לקרן. לאחר מכן, מניחים את המראה שלושה 100 מילימטרים ממראה 2, וליישר אותו כך מישור המראה שלה הוא בזווית של 45 מעלות לקרן משתקף ממראה 2. השתמש בקרן משתקפת זו כדי ליצור צד אחד של יריעת אור התאורה הכפולה.

בצד הרחוק של מפצל הקרן, מניחים את המראה חמש כך שמישור המראה שלה הוא ב-45 מעלות לקרן הנפלטת בכיוון קדימה. השתמש בקרן הנפלטת מהמראה חמש כדי ליצור את הצד השני של יריעת אור התאורה הכפולה. לאחר מכן, הגדר את מערכת התאורה הדו-צדדית בצורה מערכתית.

מניחים עדשה גלילית שני 150 מילימטרים מן המראה שלוש, ועוד עדשה גלילית זהה 150 מילימטרים מן המראה חמש, בצד השני של הגדרת תאורה כפולה. לאחר מכן, מניחים שתי מראות, כל אחת בתור עם העדשות הגליליות, במרחקים של 50 מילימטרים כדי לשקף את הקרן ב -90 מעלות. משני צידי יריעת האור, יוצרים כפיל אכרומטי מזוג עדשות, כאשר העדשה הראשונה ממוקמת 100 מילימטרים מהמראה הקודמת, וקוטר של סנטימטר אחד ואורך מוקד של 100 מילימטרים.

העדשה השנייה צריכה להיות ממוקמת 160 מילימטרים מהעדשה אחת, עם קוטר של סנטימטר אחד, ואורך מוקד של 60 מילימטרים. לאחר מכן, מניחים את מטרות התאורה 1 ו -2 150 מילימטרים מן הכפלות האכרומטיות הקודמות, כך שהם בקו אחד עם הקרן. הקרן הנפלטת מהמטרות יוצרת את יריעת האור להדמיית הדגימות.

ראשית, הכינו את דגימת חרוז הפלואורסצנט על ידי דילול תמיסת חרוזים 0.53 מיקרומטר, אחת עד 150,000, בתמיסת התאמת מדד שבירה מחוממת מראש, עם נקודת התכה נמוכה באחוז אחד. לאחר מכן, השתמש חתיכת צינורות זכוכית borosilicate עם קוטר פנימי של 12 מילימטרים, וקוטר חיצוני של 18 מילימטרים, לאורך של 30 מילימטרים. פיפטה תותבת חרוז agarose בצנרת borosilicate ולאפשר אגרוז להתגבש בטמפרטורת החדר.

עכשיו, למלא תא ABS מודפס 3-D עם פתרון 99.5 אחוז gylcerol. מניחים את צינורות הזכוכית borosilicate, המכיל את חרוזים, בתוך התא. צרף שלב תרגום ממונע תלת-מיתוני לצנרת הזכוכית הבורוסיליקט כדי לשלוט בתנועה ובכיוון של המדגם בתוך תא ה- ABS.

לאחר מכן, השתמש בתוכנה מעוצבת מותאמת אישית כדי להשיג תמונות באמצעות מצלמת sCMOS, בקצב של 30 מסגרות לשנייה. באמצעות בקר המנוע, הזז את הדגימה מילימטר אחד בכיוון הרוחד ורכוש תמונות בכל תוספת של מילימטר אחד, עד להדמיית המדגם כולו. ערמו את התמונות שנרכשו באמצעות תוכנת פריט חזותי, ולמדוד את פונקציית התפשטות הנקודות של המערכת באמצעות תמונות חרוזים אלה.

השתמש בפתרון התאמת אינדקס שבירה, עם pH של 7.5, ולהמיס אחוז אחד התעורר לתוך הפתרון התואם. מניחים דגימת לב עכבר בוגרת מנוקה לתוך פתרון התאמת אינדקס שבירה, עם אחוז אחד אגרוז מומס. לאחר מכן, להכניס את המדגם לתוך צינורות זכוכית borosilicate, ולאפשר agarose להתגבש בטמפרטורת החדר.

צרף שלב תרגום ממונע תלת-ממד לצנרת הזכוכית הבורוסיליקט כדי לשלוט בתנועה ובכיוון של המדגם בתוך תא ABS מודפס תלת-ממד. מקם את הדגימה כך שהיא נמצאת במרכז הקרן הגאוסית, שנוצרה על ידי מערכת התאורה הכפולה. לאחר מכן, הגדר את קצב הרכישה של מצלמת sCMOS ל- 30 מסגרות לשנייה.

עכשיו, באמצעות בקר המנוע, להזיז את המדגם מילימטר אחד בכיוון בית הספר ולרכוש תמונות בכל תוספת מילימטר אחד. המשך עד להדמיית הדגימה כולה. אחסן את התמונות שנרכשו באמצעות תוכנת פריט חזותי.

פתח את התמונות תלת-מיות באמצעות ערימות תמונות אלה. כדי לבצע זאת, הפוך את פונקציית כפולת הנקודות שנקבעה קודם לכן, ונצל אותה עבור ערימות התמונות שנרכשו. לבסוף, קבעו ערך עוצמת סף של פיקסלים לצפייה בקווי המתאר של הלב, והוסיפו צבע מדומה לתמונות, בהתאם לעוצמה זו של גווני אפור.

ביום אחד לאחר הלידה, אפשר לדמיין את השסתומים, אטריום, חדר, שריר pectinate, ו trabeculation, בין תכונות אחרות. ביום השביעי לאחר הלידה, התכונות מוגדרות עוד יותר. אטריום, חדר, ממדי חלל חדרית, ועובי קיר החדר ניכרים כולם.

כדי לחקור התברמות קרדיומיוציטים בתוך הלב, עכברים הטרוזיגיים היו קרויים כדי להראות קרדיומיוציטים. התאים המסווים מוצגים כאן, בכל כיוון מישור. שלושת המטוסים מוזגו, כדי ליצור עיבוד תלת מימדי של הלב.

האזור האדום בעיגול בתוך הכניסה מראה שני לבבות עכבר שקופים לאחר שעברו את טכניקת הבהירות והוחדרו לתוך צינורות הזכוכית הבורוסיליקטים. בנוסף ללימוד עכברים לאחר לידה, מערכת ההדמיה יכולה לשמש גם לחקר לב העכבר הבוגר. כאן, GFP מתויג ערוצי ROMK מוצגים ב 7.5 חודשים.

אלה נמצאו בעיקר בקיר החדר. לאחר השליטה, טכניקה זו יכולה להיעשות תוך שעה עד שתי דקות. בעת ניסיון הליך זה, חשוב להסיר את כל הבועות סביב המדגם בצינור.

שיטות אחרות, כגון פילוח אוטומטי של ערימות התמונה, ניתן לבצע כדי לענות על שאלות נוספות הקשורות לפגיעה לב וכלי דם והתחדשות. לאחר התפתחותה, טכניקה זו שימשה את החוקרים לחקר ארכיטקטורת הלב בשלבים התפתחותיים לאחר לידה ומבוגרים בעכברים.