Name: מיקרוסקופ אור גיליונות פלורסצנטיות לחקר הלב מאתר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: חקור מיקרוסקופ פלואורסצנטי בגיליונות אור לחקר הלב בעכברים. שיטה זו מאפשרת הדמיה מהירה של מבנה הלב ושינויים לאחר טיפול גנטי בקרדיולוגיה התפתחותית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצה להביע את תודתי תאו נגוין, אטסשי נאקאנו מ- UCLA למתן את הדגימה עכברים לתמונה. מחקר זה נתמך על ידי מענקים NIH HL118650 (ל Tzung ק Hsiai), HL083015 (ל Tzung ק Hsiai), HD069305 (כדי ש ג צ'י Tzung ק Hsiai.), HL111437 (ל Tzung ק Hsiai ו ש ג צ'י), HL129727 (ל Tzung ק Hsiai) ומערכת אוניברסיטת טקסס כוכבים מימון (כדי Juhyun לי).

כל ההליכים הקשורים בבעלי החיים אושרו על ידי המוסדיים סקירה ועדות (IACUC) ב אוניברסיטת קליפורניה, לוס אנג'לס, קליפורניה.
1. התקנת מערכת הדמיה
הערה: ראה איור 1 באיור 2.
<ol><li>לאחזר לייזר (CW) רציף wave עם אורכי גל 3: 405 ננומטר, 473 ננומטר, 532 ננומטר. מניחים 2 מראות (M1 ו- M2) 150 מ מ לגזרים וליישר אותן עם המטוסים המראה שלהם-45° על הקורה. הערה: שלב זה מתבצע כדי לנתב מחדש את הלייזר מן ההגדרה תאורה דו-צדדית. קרן וכתוצאה מכך יהיו באותו כיוון כמו הקרן הראשוני.</li>
	<li>להעביר את הקרן עד קוטר 25 מ מ איריס הסרעפת/הקדמוניות (PH), מסנן דחיסות נייטרלית בקוטר 50 מ מ (אבחון) עם טווח צפיפות אופטית של 0 - 4.0, במותחן קרן (מושלם), חתך 30 מ מ (S) עם הרוחב של ~ 0 - 6 מ מ, ומראה (M3) , כל מה ממוקם 150 מ מ אחד מהשני. במקום המראה עם המטוס המראה שלה בגיל 45° על הקורה.</li>
	<li>עוברים את הקרן דרך מפצל קרן 50: 50 הציב 150 מ מ M3. להציב מראה (M6) 150 מ מ המפצל קרן, ליישר אותה כך המטוס המראה שלה הוא ב- 45 מעלות על הקורה הנפלט בכיוון קדימה. השתמש קרן משתקף להקים בצד אחד של גליון אור כפול-תאורה.</li>
	<li>להציב מראה (M4) 150 מ מ המפצל קרן, ליישר אותה כך המטוס המראה שלה הוא ב- 45 מעלות על הקורה זה היה הנפלטים בזווית של 90° ' מ המפצל קרן. להציב מראה השני (M5) 150 מ מ M4, ליישר אותה כך המטוס המראה שלה הוא ב- 45 מעלות על הקורה שמשתקף M6. השתמש קרן הנפלטים M5 כדי ליצור את הצד השני של הגיליון אור כפול-תאורה.</li>
	<li>להגדיר את מערכת תאורה דו-צדדית באופן סימטרי (ראה איור 1). מקום אחד עדשה גלילית (CL1) [קוטר (ד) = 1; אורך המוקד (נ) = 50 מ"מ] 150 מ מ בקו אחד עם קרן הנפלטים M5 בצד אחד ואת עוד עדשה גלילית זהים (CL2) 150 מ מ בקו אחד עם קרן הנפלטים M6 בצד השני של setu כפול-תאורה עמ' למקם 2 מראות (M7, M8) כל קו עם עדשות גלילי במרחקים של 50 מ מ כדי לשקף את הקרן ב- 90 °.</li>
	<li>טופס של כפיל אכרומטי מזוג עדשות. מקם את העדשה הראשונה, L1 (d = 1; f = 100 מ מ), 100 מ מ M7, העדשה השניה, L2 (d = 1; f = 60 מ"מ), 160 מ מ L1. חזור על שזה בצד השני של כפול-התאורה עם עדשות זהה (L3, L4) להציב את המרחק אותו M8.</li>
	<li>המקום שיקוף, M9 ו- M10, 60 מ מ עדשות L2 ו- L4, בהתאמה, ובהתאם את הקרן. להציב מטרות תאורה, OL1 ו- OL2 (d = 2; f = 150 מ מ), 150 מ מ M9 M10 ו בקנה אחד עם הקרן. קרן הנפלטים מן המטרות טפסים הגיליון אור הדמיה הדגימות.</li>
	<li>להשתמש במדפסת תלת-ממד כדי להדפיס את בעל מדגם styrene טבעי בוטאדיאן (ABS). להטביע חתיכת כיסוי זכוכית [מקדם שבירה (RI) = 1.4745] בכל צד של החדר, הניצב על הקורה תאורה, כדי למזער את השבירה mismatching תשואה. אחיד במקום התא בין הקורות הנפלטים העדשות אובייקטיבי.</li>
	<li>התקנת מיקרוסקופ סטריאו עם הספרה 1 X הגדלה אובייקטיבית, מצלמה מדעי משלימים תחמוצת מתכת מוליכים למחצה (sCMOS) בניצב ההארה מטוס (ראה איור 2).</li>
</ol>2. הדמיה מערכת כיול
<ol><li>אחזר חרוזי פוליסטירן פלורסנט שאינן μm 0.53 בקוטר.</li>
	<li>הכן את הדגימה פלורסנט חרוז על ידי דילול הפתרון חרוז בפתרון תואמות מקדם שבירה (חישוקים) עם agarose הצבעה נמוך-להמיס 1% כדי 1:150, 000. חותכים פיסת זכוכית בורוסיליקט אבובים עם הקוטר הפנימי של 12 מ"מ וקוטר החיצונית של 18 מ מ לאורך של 30 מ מ. הערה: לאורך צינור זכוכית בורוסיליקט משמש כדי להתאים את מקדם שבירה (1.47).</li>
	<li>לערבב את הדגימה חרוז מדולל עם 1% agarose, pipette הפתרון חרוז/agarose אל הצנרת בורוסיליקט. אפשר את agarose לגבש בטמפרטורת החדר (23 ° C).</li>
	<li>למלא את התא ABS (מתוך שלב 1.7) פתרון גליצרול 99.5%. מקם את צינורות זכוכית בורוסיליקט המכיל את החרוזים בתוך החדר. מקום תא ABS מערכת ההדמייה כך שיהיה במרכז קרן גאוסיאנית שנוצרו על ידי מערכת תאורה כפולה.</li>
	<li>לצרף שלב translational ממונע תלת-ממדי לאורך צינור זכוכית בורוסיליקט כדי לקבוע את התנועה והכיוון של המדגם בתוך תא ABS (ראה תוספת איור 1).</li>
	<li>לרכוש תמונות באמצעות מצלמת ה-sCMOS בקצב של 30 מסגרות לשנייה (fps). באמצעות הבקר מוטוריים, הזז את הדגימה 1 מ מ בכיוון לרוחב, לרכוש תמונות על כל תוספת 1 מ מ באמצעות מצלמת ה-sCMOS. המשך עד המדגם כולו עם תמונה.</li>
	<li>ערימת תמונות נרכשות באמצעות תוכנת ויזואליזציה (ראה טבלה של חומרים). למדוד את הפונקציה הליין (PSF) של המערכת באמצעות הדימויים חרוז. השתמש הזה PSF deconvolution במהלך עיבוד בשלבים מאוחר יותר התמונה.</li>
</ol>3. הכנת הדוגמא
<ol><li>לנתח לבבות עכבר פראי סוג P1, זוגית משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים sarcolipin-Cre knockin עם העכבר הגן Rosa26-YFP (SlnCre / +; R26YFP כתב / +)-P7. הערה: המתת חסד בוצעה באמצעות פנטוברביטל בטכניקה המתוארת על ידי רובינס. et al. 10. הקרע בוצעה על פי בטכניקה המתוארת על ידי ה הלאומי ללב, ריאות, ודם המכון (NHLBI)10,11.</li>
	<li>לבצע חומר כימי ניקוי של לבבות מאתר כפי שתואר על ידי קווין סונג. et al. 12. הערה: השלבים הבאים יש לבצעו בשכונה fume מאז הכימיקלים בשימוש רעילים.<ol>
<li>לשטוף את הלבבות 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) 3 x 10 דקות. לאחר השטיפה, למקם את הלבבות בפתרון paraformaldehyde 4%, דגירה הדוגמיות הללו ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.</li>
		<li>מקם את הדגימות פתרון 4% אקרילאמיד המכילה 0.5% w/v של 2, 2'-Azobis dihydrochloride. לאפשר את הדוגמאות כדי דגירה ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לאחר לילה הדגירה, להסיר את הדגימות, דגירה אותם ב 37 מעלות צלזיוס במשך 2-3 h.</li>
		<li>לשטוף את הדגימות עם PBS ולאחר מכן למקם אותם בפתרון של 8% w/v dodecyl נתרן גופרתי, חומצה בורית w/v 1.25%. דגירה בדגימות ב 37 ° C עד הם טהורים. זה יכול לארוך מספר שעות תלוי בעובי של המדגם. לאחר ניקוי, להסיר את הדגימות ומניחים 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח ליום 1.</li>
		<li>להכין עם מקדם שבירה התאמת פתרון עם 40 גר' nonionic צפיפות בינונית הדרגתי (ראה טבלה של חומרים) ב- 30 מ ל ז 0.02 נקודות פוספט מאגר (PB), אזיד הנתרן Tween-20, ו- 0.01% 0.1%. להביא את הפתרון pH של 7.5 עם נתרן הידרוקסידי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>מקם את הדגימה שנוקה חישוקים עם מדד השבירה agarose 1.46-1.48 ו 1%. הכנס את הדגימה לתוך צינורות זכוכית בורוסיליקט ולאפשר את agarose לגבש בטמפרטורת החדר (23 ° C).</li>
	<li>לצרף שלב translational ממונע תלת-ממדי לאורך צינור זכוכית בורוסיליקט כדי לשלוט על תנועת והודפס הכיוון של המדגם בתוך תלת-ממד ABS קאמרית (ראה תוספת איור 1).</li>
</ol>4. דימות הלב למבוגרים
<ol><li>להזריק 8.7 x 10 וירוסים12 של סוג וירוס adeno-הקשורים וקטור 9 (AAV9) המכילה יזם ספציפיות הלב טרופונין T (cTnT), חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) באמצעי אחסון 100-μL לתוך וריד הזנב עכבר 2-חודש פראי סוג (C57BL/6). הערה: AAV9 פותחה על פי בטכניקה המתוארת על ידי יואן. et al. 13. זה גורם GFP לאגד הערוץ כליות אשלגן מדולרי החיצוני (ROMK) בהפקת AAV9-cTnT-ROMK-GFP (ראה טבלה של חומרים).</li>
	<li>לנתח את הלבבות העכבר למבוגרים-7.5 חודשים של גיל על פי בטכניקה המתוארת על ידי NHLBI11. הכינו את הדגימות באמצעות צעדים 3.1-3.3.</li>
	<li>להתחבר הבקר מנוע מנוע במפעיל. לצרף במפעיל לאורך צינור זכוכית בורוסיליקט כדי לשלוט על תנועת והודפס הכיוון של המדגם בתוך תלת-ממד ABS קאמרית.</li>
	<li>מקם את הדגימה כך זה במרכז קרן גאוסיאנית שנוצרו על ידי מערכת תאורה כפולה. לרכוש תמונות באמצעות מצלמת ה-sCMOS בקצב של 100 fps.</li>
	<li>באמצעות הבקר מוטוריים, להעביר את הדגימה 1 מ"מ לכיוון צירית, לרכוש תמונות על כל תוספת קבועה של 1 מ מ עם המצלמה sCMOS. המשך עד המדגם כולו עם תמונה. הערה: המערכת נשלטת על ידי תוכנת בקרת מכשיר מפותחות מותאם אישית.</li>
	<li>ערימת תמונות נרכשות באמצעות תוכנת ויזואליזציה (ראה טבלה של חומרים). לפתח תמונות תלת-ממד באמצעות אוספי תמונות אלה, תוכנת ויזואליזציה14. Deconvolve את PSF מהשלב 2.6 עם אוסף תמונות רכשה. הגדר ערך פיקסל עוצמת סף כדי לבחון את קווי המתאר של הלב ולהוסיף צבע מדומה תמונות בהתבסס על זה עוצמת גווני אפור.</li>
</ol>

<ol><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4537058/">Clarifying tissue clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li>
<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4-Dimensional+light-sheet+microscopy+to+elucidate+shear+stress+modulation+of+cardiac+trabeculation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1679-1690 (2016).</li>
<li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li>
<li>Huisken, J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+plane+illumination+microscopy+techniques+in+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology.</a> Development. 136 (12), 1963-1975 (2009).</li>
<li>Bakkers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+model+to+study+cardiac+development+and+human+cardiac+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease.</a> Cardiovascular Research. 91 (2), 279-288 (2011).</li>
<li>High, F. A., Epstein, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multifaceted+role+of+Notch+in+cardiac+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">The multifaceted role of Notch in cardiac development and disease.</a> Nature Reviews Genetics. 9 (1), 49-61 (2008).</li>
<li>Sachinidis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+specific+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Cardiac specific differentiation of mouse embryonic stem cells.</a> Cardiovascular Research. 58 (2), 278-291 (2003).</li>
<li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-sheet+fluorescence+imaging+to+localize+cardiac+lineage+and+protein+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Light-sheet fluorescence imaging to localize cardiac lineage and protein distribution.</a> Scientific Reports. 7, 42209(2017).</li>
<li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).</li>
<li>Robbins, N., Thompson, A., Mann, A., Blomkalns, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+excision+of+murine+aorta%3B+a+versatile+technique+in+the+study+of+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and excision of murine aorta; a versatile technique in the study of cardiovascular disease.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52172(2014).</li>
<li>National Heart, L., Blood Institute, <a target="_blank" href="http://community.parentprojectmd.org/profiles/blogs/standard-operating-procedures-for-duchenne-animal-models">Standard Operating Procedures (SOP's) for Duchenne Animal Models</a>. , (2015).</li>
<li>Sung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+three-dimensional+tissue+clearing+and+incorporation+of+colorimetric+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Simplified three-dimensional tissue clearing and incorporation of colorimetric phenotyping.</a> Scientific Reports. 6, 30736(2016).</li>
<li>Yuan, Z., Qiao, C., Hu, P., Li, J., Xiao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+adeno-associated+virus+vector+producer+cell+line+method+for+scalable+vector+production+of+different+serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">A versatile adeno-associated virus vector producer cell line method for scalable vector production of different serotypes.</a> Human Gene Therapy. 22 (5), 613-624 (2011).</li>
<li>FEI, <a target="_blank" href="https://www.fei.com/software/amira-user-guide/">Amira User's Guide</a>. , Konrad-Zuse-Zentrum fur Informationstechnik. Berlin. 59-138 (2017).</li>
<li>Gao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+imaging+of+3D+dynamics+in+thickly+fluorescent+specimens+beyond+the+diffraction+limit%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Noninvasive imaging of 3D dynamics in thickly fluorescent specimens beyond the diffraction limit.</a> Cell. 151 (6), 1370-1385 (2012).</li>
<li>Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+and+fast+live+imaging+with+two-photon+scanned+light-sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy.</a> Nature Methods. 8 (9), 757-760 (2011).</li>
<li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+light-sheet+imaging+with+virtual+reality+to+recapitulate+developmental+cardiac+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Integrating light-sheet imaging with virtual reality to recapitulate developmental cardiac mechanics.</a> JCI Insight. 2 (22), (2017).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

מערכת LSFM ואת בטכניקה המתוארת כאן מנצל קרן דו-צדדית תאורה בשילוב עם קרחת אופטי תמונת הלב העכבר אחרי לידה ומבוגרים שלבי התפתחותה. קרן תאורה יחיד מסורתי סובל הפוטונים פיזור וקליטה דרך רקמות עבה יותר, גדול יותר דגימות1,3. הקורות דו-צדדית לספק תאורה אפילו יותר של המדגם, ובכך למזער את ההשפעה של פיזור וממצאים אחרים כי הם לעיתים לראות בתמונות המיוצר על ידי תאורה צדדית. טכניקה זו גם מגביר את גודל המדגם זה יכול לדימות על-ידי התאמת המיקום של קורות גאוסיאנית כפול<sup class...

מיקרוסקופ אור גיליונות פלורסצנטיות הייתה הטכניקה פותחה לראשונה בשנת 1903 ומשמש היום כשיטה ללמוד ביטוי גנים וגם לייצר מודלים תלת-ממדי או 4-D של רקמות דגימות1,2,3. שיטה הדמיה זו משתמשת סדין דק של אור כדי להאיר מטוס בודד של מדגם כך רק את המטוס הוא נלכד על ידי הגלאי. המדגם יכול להיות עבר לכיוון-צירית ללכוד כל שכבה, מקטע אחד בכל פעם, ועיבוד דגם תלת-ממדי לאחר עיבוד שלאחר של תמונות רכשה4. עם זאת, עקב ספיגת פיזור של פוטונים, LSFM הוגבלה על דוגמאות או מיקרונים אחדים עבה או שטיחות שקוף1.
המגבלות של LSFM הובילו מחקרים מקיפים של אורגניזמים בעלי רקמות שקופים אופטים, כגון דג זברה. מחקרים שכללו פיתוח לב ובידול נערכות לעיתים קרובות על דג זברה מאז ישנם גנים שנשמרת בין בני האדם לבין דג זברה5,6. למרות מחקרים אלו הובילו ההתקדמות במחקר הלב הקשורים6,cardiomyopathies7, יש עדיין צורך לערוך מחקר דומה על אורגניזמים ברמה גבוהה יותר כגון יונקים.
יונקים ברקמת הלב מהווה אתגר עקב עובי האטימות של הרקמה, קליטתם עקב המוגלובין כדוריות דם אדומות, וכן את פיזור המתרחשת עקב תאורה חד צדדית של הדגימה תחת LSFM מסורתיים שיטות1 , 8. כדי לפצות על מגבלות אלה, הצענו להשתמש תאורה דו-צדדית, גרסה מפושטת של טכניקה בבהירות9 בשילוב עם מקדם שבירה התאמת פתרון (חישוקים). לכן, מערכת זו מאפשרת ההדמיה של מדגם זה גדול מ- 10 x 10 x 10 מ מ3 תוך שמירה על רזולוציה באיכות טובה צירית, לרוחב מטוסים8.
מערכת זו היה מכויל תחילה באמצעות חרוזים פלורסנט מסודרים תצורות שונות בתוך הצנרת זכוכית. לאחר מכן, המערכת שימשה תמונה אחרי לידה ומבוגרים מאתר לבבות. ראשית, בלב העכבר אחרי לידה צולמה ב 7 ימים (P7) כדי לחשוף את חלל חדרית, את עוביו של הקיר חדרית המבנים שסתום, הנוכחות של trabeculation. שנית, נערך מחקר כדי לזהות תאים להתמיין cardiomyocytes באמצעות העכבר אחרי לידה לב ב- 1 יום (P1) עם התווית על-ידי Cre cardiomyocytes, חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP). לבסוף, עכברים בוגרים בגיל 7.5 חודשים היו עם תמונה כדי לבחון את נוכחותם של כליות אשלגן מדולרי החיצוני ערוצים (ROMK) לאחר טיפול גנטי8.

<table><tbody><tr><td>טכנולוגיות לייזר לייזר CW</td><td></td><td>LMM-GBV1-PF3-00300-05</td><td>עירור של פלואורופורים</td></tr><tr><td>מסנן צפיפות ניטרלית</td><td>Thorlabs</td><td>NDC-50C-4M</td><td>שולט בכמות האור הנכנסת למערכת</td></tr><tr><td>מרחיב קרן אכרומטי</td><td>Thorlabs</td><td>GBE05-A</td><td>מרחיב את אלומת האור</td></tr><tr><td>חריץ מכני</td><td>Thorlabs</td><td>VA100C</td><td>שולט ברוחב הקרן</td></tr><tr><td>מפצל קרן</td><td>Thorlabs</td><td>BS013</td><td>צורות קרן תאורה כפולה</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ סטריאו עם עדשת אובייקטיבית 1X</td><td>אולימפוס</td><td>MVX10</td><td>משמש לתצפית על מדגם</td></tr><tr><td>ORCA-Flash4.0 LT מצלמת sCMOS</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>C11440-42U</td><td>משמש לצילום תמונות</td></tr><tr><td>אקרילוניטריל בוטאדיאן סטירן (ABS)</td> <td>Stratasys</td><td>uPrint</td><td>חומר המשמש להדפסת תלת מימד מחזיק מדגם</td></tr><tr><td>חרוזי פוליסטירן פלואורסצנטיים</td><td>Spherotech Inc</td><td>PP-05-10</td><td>משמשים לכיול מערכת הדמיה</td></tr><tr><td>צינורות זכוכית בורוסיליקט</td><td>Corning</td><td>Pyrex 7740</td><td>צינורות להטמעת דגימה</td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP229-4</td><td>מילוי לתא דגימה</td></tr><tr><td>מלח חוצץ פוספט</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP39920</td><td>תמיסת שטיפה ללבבות עכבר</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>RT-15700</td><td>תמיסת הדגירה הראשונה</td></tr><tr><td>Acrylamide</td><td>Wako Chemicals</td><td>AAL-107</td><td>מעורבב עם 2,2'-Azobis dihydrochloride לתמיסת דגירה שנייה ללבבות עכברים</td></tr><tr><td>2,2'-Azobis dihydrochloride</td><td>Wako Chemicals</td><td>VA-044</td><td>מעורבב עם אקרילאמיד לתמיסת דגירה שנייה ללבבות</td></tr> <tr><td>עכבריםנתרן דודציל סולפט&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71725</td><td>מעורבב עם חומצה בורית לתמיסת דגירה שלישית ללבבות עכברים</td></tr><tr><td>חומצה בורית</td><td>Fischer Scientific</td><td>A74-1</td><td>מעורבב עם נתרן דודציל סולפט לתמיסת דגירה שלישית ללבבות עכברים</td></tr><tr><td>Sigma D2158 Sigma Aldrich</td><td></td><td>D2158</td><td>מעורבב עם PB, Tween-20 ונתרן אזיד כתמיסת התאמת מקדם שבירה</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11332465001</td><td>מעורבב עם Sigma D2158, PB ונתרן אזיד כתמיסת התאמת מקדם שבירה</td></tr><tr><td>נתרן אזיד</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2002</td><td>מעורבב עם Sigma D2158, PB ו-Tween-20 כפתרון התאמת מקדם שבירה</td></tr><tr><td>וקטור וירוס הקשור לאדנו 9 עם מקדם טרופונין T ספציפי ללב המתויג עם GFP</td><td>וקטור Biolabs</td><td>VB2045</td><td>מבטא GFP כאשר הוא קשור למפעיל</td></tr><tr><td>מנוע סרוו</td> ROMK DC <td>Thorlabs</td><td>Z825B</td><td>משמש לתנועת דגימה בכיוון צירי בתוך גיליון אור</td></tr><tr><td>בקר מנוע סרוו DC מוברש K-Cube</td><td>Thorlabs</td><td>KDC101</td><td>מתחבר למפעיל המנוע ושולט בתנועה של המפעיל</td></tr><tr><td>Amira</td><td>FEI תוכנה</td><td>N/A</td><td>תוכנת הדמיה להפקת תמונות דו-ממדיות ותלת-ממדיות</td></tr></tbody></table>

מיקרוסקופ אור גיליונות פלורסצנטיות לחקר הלב מאתר

Light-sheet Fluorescence Microscopy for the Study of the Murine Heart

מיקרוסקופ אור גיליונות פלורסצנטיות כבר בשימוש נרחב עבור ייבוא תמונות מהירה עם רזולוציה צירית גבוהה מ מיקרומטר לקנה המידה מילימטר. טכניקות אור גיליונות מסורתיות לערב את השימוש קרן תאורה יחיד orthogonally מכוונת דגימת רקמה. תמונות של דוגמאות גדולות המיוצרים באמצעות קרן תאורה יחיד מכילות פסים או חפצים, סובלים ברזולוציה מופחתת עקב פיזור קליטת האור על ידי הרקמה. מחקר זה משתמש קרן תאורה דו-צדדית, צלילות מפושטת אופטי פינוי טכניקה ללב מאתר. שיטות אלה מאפשר הדמיה עמוק יותר על-ידי הסרת שומנים מהלב ומפיקים תחום רחב של הדמיה, גדול מ- 10 x 10 x 10 מ מ3. כתוצאה מכך, אסטרטגיה זו מאפשרת לנו לכמת את הממדים חדרית, לעקוב אחר שושלת היוחסין לב לשפה את התפוצה המרחבית של חלבונים ספציפיים הלב ושל יון-ערוצים מכל אחרי לידה כדי העכבר למבוגרים לבבות עם חדות מספקת ו רזולוציה.

בטכניקה המתוארת כאן להשתמש קרן דו-צדדית תאורה בשילוב של ניקוי אופטי של דגימות רקמות הלב העכבר כדי להשיג עמוק יותר לעומק הדמיה הדימות נפח גדול יותר עם רזולוציה מספקת הדמיה (איור 1). כדי לכייל את המערכת, חרוזים פלורסנט הונחו בתוך הצנרת זכוכית ובתוך מערכת הדמיה. החרוזים ואז היו עם תמונה, דמיינו במישור x-y, y-z המטוס, ולהפיץ במישור x-z, כדי להשיג את הנקודה פונקציה (PSF) עבור מערכת8. כיול המערכת המיוצר רזולוציה בכיוון לרוחב של ≈ dלרוחב...

מחקר זה משתמש בטכניקה מיקרוסקופ (LSFM) אור גיליונות פלורסצנטיות דו-צדדית תאורה בשילוב עם קרחת אופטי ללמוד את הלב מאתר.

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. ...

היתרון העיקרי של טכנולוגיה זו הוא שהיא מאפשרת הדמיה מהירה של לב העכבר. וזה יכול לשמש כדי לבחון את נוכחותם של ערוצי אוויר לאחר ריפוי גנטי. למרות שיטה זו יכולה לספק תובנה לתוך קרדיולוגיה פיתוח, זה יכול להיות מיושם גם על מערכות אחרות, כגון נוירולוגיה ופולמונולוגיה.בדרך כלל, אנשים יתקשו עם טכניקה זו כי הרכבה הדמיה של לב העכבר הבוגר יכול להיות קשה, וזה שונה טכניקות אחרות, מסורתיות, כגון מיקרוסקופיה קונפוקל הפוכה. מניחים לייזר גל מתמשך עם שלושה אורכי גל של 405 ננומטר, 473 ננומטר, ו 532 ננומטר. לאחר מכן, להדביק לשקף אחד וליישר אותו עם מישור המראה ב 45 מעלות לקורה.פעולה זו תכוון את הלייזר לכיוון מפצל הקרן, המהווה את מערך התאורה הדו-צדדי. לאחר מכן, העבירו את הקרן דרך מסנן צפיפות נייטרלי בקוטר 50 מ"מ, מרחיב קרן וחור סיכה בקוטר 25 מ"מ, כולם ממוקמים במרחק של 150 מילימטרים זה מזה. מעבירים את הקורה דרך מפצל קרן 50-50, ממוקם 150 מילימטרים מהחור.לאחר מכן, מניחים את המראה שני 150 מילימטרים ממפצל הקרן, ב 90 מעלות לקרן הקדמית, וליישר אותו כך מישור המראה שלה הוא בזווית של 45 מעלות לקרן. לאחר מכן, מניחים את המראה שלושה 100 מילימטרים ממראה 2, וליישר אותו כך מישור המראה שלה הוא בזווית של 45 מעלות לקרן משתקף ממראה 2. השתמש בקרן משתקפת זו כדי ליצור צד אחד של יריעת אור התאורה הכפולה.בצד הרחוק של מפצל הקרן, מניחים את המראה חמש כך שמישור המראה שלה הוא ב-45 מעלות לקרן הנפלטת בכיוון קדימה. השתמש בקרן הנפלטת מהמראה חמש כדי ליצור את הצד השני של יריעת אור התאורה הכפולה. לאחר מכן, הגדר את מערכת התאורה הדו-צדדית בצורה מערכתית.מניחים עדשה גלילית שני 150 מילימטרים מן המראה שלוש, ועוד עדשה גלילית זהה 150 מילימטרים מן המראה חמש, בצד השני של הגדרת תאורה כפולה. לאחר מכן, מניחים שתי מראות, כל אחת בתור עם העדשות הגליליות, במרחקים של 50 מילימטרים כדי לשקף את הקרן ב -90 מעלות. משני צידי יריעת האור, יוצרים כפיל אכרומטי מזוג עדשות, כאשר העדשה הראשונה ממוקמת 100 מילימטרים מהמראה הקודמת, וקוטר של סנטימטר אחד ואורך מוקד של 100 מילימטרים.העדשה השנייה צריכה להיות ממוקמת 160 מילימטרים מהעדשה אחת, עם קוטר של סנטימטר אחד, ואורך מוקד של 60 מילימטרים. לאחר מכן, מניחים את מטרות התאורה 1 ו -2 150 מילימטרים מן הכפלות האכרומטיות הקודמות, כך שהם בקו אחד עם הקרן. הקרן הנפלטת מהמטרות יוצרת את יריעת האור להדמיית הדגימות.ראשית, הכינו את דגימת חרוז הפלואורסצנט על ידי דילול תמיסת חרוזים 0.53 מיקרומטר, אחת עד 150,000, בתמיסת התאמת מדד שבירה מחוממת מראש, עם נקודת התכה נמוכה באחוז אחד. לאחר מכן, השתמש חתיכת צינורות זכוכית borosilicate עם קוטר פנימי של 12 מילימטרים, וקוטר חיצוני של 18 מילימטרים, לאורך של 30 מילימטרים. פיפטה תותבת חרוז agarose בצנרת borosilicate ולאפשר אגרוז להתגבש בטמפרטורת החדר.עכשיו, למלא תא ABS מודפס 3-D עם פתרון 99.5 אחוז gylcerol. מניחים את צינורות הזכוכית borosilicate, המכיל את חרוזים, בתוך התא. צרף שלב תרגום ממונע תלת-מיתוני לצנרת הזכוכית הבורוסיליקט כדי לשלוט בתנועה ובכיוון של המדגם בתוך תא ה- ABS.לאחר מכן, השתמש בתוכנה מעוצבת מותאמת אישית כדי להשיג תמונות באמצעות מצלמת sCMOS, בקצב של 30 מסגרות לשנייה. באמצעות בקר המנוע, הזז את הדגימה מילימטר אחד בכיוון הרוחד ורכוש תמונות בכל תוספת של מילימטר אחד, עד להדמיית המדגם כולו. ערמו את התמונות שנרכשו באמצעות תוכנת פריט חזותי, ולמדוד את פונקציית התפשטות הנקודות של המערכת באמצעות תמונות חרוזים אלה.השתמש בפתרון התאמת אינדקס שבירה, עם pH של 7.5, ולהמיס אחוז אחד התעורר לתוך הפתרון התואם. מניחים דגימת לב עכבר בוגרת מנוקה לתוך פתרון התאמת אינדקס שבירה, עם אחוז אחד אגרוז מומס. לאחר מכן, להכניס את המדגם לתוך צינורות זכוכית borosilicate, ולאפשר agarose להתגבש בטמפרטורת החדר.צרף שלב תרגום ממונע תלת-ממד לצנרת הזכוכית הבורוסיליקט כדי לשלוט בתנועה ובכיוון של המדגם בתוך תא ABS מודפס תלת-ממד. מקם את הדגימה כך שהיא נמצאת במרכז הקרן הגאוסית, שנוצרה על ידי מערכת התאורה הכפולה. לאחר מכן, הגדר את קצב הרכישה של מצלמת sCMOS ל- 30 מסגרות לשנייה.עכשיו, באמצעות בקר המנוע, להזיז את המדגם מילימטר אחד בכיוון בית הספר ולרכוש תמונות בכל תוספת מילימטר אחד. המשך עד להדמיית הדגימה כולה. אחסן את התמונות שנרכשו באמצעות תוכנת פריט חזותי.פתח את התמונות תלת-מיות באמצעות ערימות תמונות אלה. כדי לבצע זאת, הפוך את פונקציית כפולת הנקודות שנקבעה קודם לכן, ונצל אותה עבור ערימות התמונות שנרכשו. לבסוף, קבעו ערך עוצמת סף של פיקסלים לצפייה בקווי המתאר של הלב, והוסיפו צבע מדומה לתמונות, בהתאם לעוצמה זו של גווני אפור.ביום אחד לאחר הלידה, אפשר לדמיין את השסתומים, אטריום, חדר, שריר pectinate, ו trabeculation, בין תכונות אחרות. ביום השביעי לאחר הלידה, התכונות מוגדרות עוד יותר. אטריום, חדר, ממדי חלל חדרית, ועובי קיר החדר ניכרים כולם.כדי לחקור התברמות קרדיומיוציטים בתוך הלב, עכברים הטרוזיגיים היו קרויים כדי להראות קרדיומיוציטים. התאים המסווים מוצגים כאן, בכל כיוון מישור. שלושת המטוסים מוזגו, כדי ליצור עיבוד תלת מימדי של הלב.האזור האדום בעיגול בתוך הכניסה מראה שני לבבות עכבר שקופים לאחר שעברו את טכניקת הבהירות והוחדרו לתוך צינורות הזכוכית הבורוסיליקטים. בנוסף ללימוד עכברים לאחר לידה, מערכת ההדמיה יכולה לשמש גם לחקר לב העכבר הבוגר. כאן, GFP מתויג ערוצי ROMK מוצגים ב 7.5 חודשים.אלה נמצאו בעיקר בקיר החדר. לאחר השליטה, טכניקה זו יכולה להיעשות תוך שעה עד שתי דקות. בעת ניסיון הליך זה, חשוב להסיר את כל הבועות סביב המדגם בצינור.שיטות אחרות, כגון פילוח אוטומטי של ערימות התמונה, ניתן לבצע כדי לענות על שאלות נוספות הקשורות לפגיעה לב וכלי דם והתחדשות. לאחר התפתחותה, טכניקה זו שימשה את החוקרים לחקר ארכיטקטורת הלב בשלבים התפתחותיים לאחר לידה ומבוגרים בעכברים.

light-sheet-fluorescence-microscopy-for-the-study-of-the-murine-heart

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

בלב, אירועים מולקולריים לתאם את פונקצית חשמל התכווצות של האיבר. סט של טכניקות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בשדה מקומיות הציגו כאן מאפשר ההקלטה של ​​משתני הסלולר לבבות שלמים. זיהוי מנגנונים בהגדרת תפקוד הלב הוא קריטי להבנה כיצד הלב עובד תחת מצבים פתולוגיים.

בשדה מקומי מיקרוסקופ פלואורסצנטי: הדמיה איתותי הסלולר לבבות שלמים

כאן, אנו מתארים גישה מיקרוסקופית אור גיליון לדמיין את הלב CD45 + ליקוציט לחדור במודל Murine של שריר הלב, שריר הלב, אשר נגרמת על ידי טיפול דיפריה intraracheal intrachecheal של עכברים CD11c.DTR.

ויזואליזציה כמותית של ליקוציטים לחדור במודל Murine של שריר הלב הדוקרני על ידי מיקרוסקופית גיליון אור

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להמחיש פיתוח לבבות דג זברה 4-ממדים (4-D). הדמיה 4-D, באמצעות מיקרוסקופ אור גיליונות קרינה פלואורסצנטית (LSFM), לוקח תמונות תלת-ממדי (3-D) לאורך זמן, לשחזר לבבות המתפתח. אנו מראים איכותית, באופן כמותי שזה גזירה מפעילה חריץ endocardial איתות במהלך הפיתוח קאמרית, המקדם trabeculation הלב.

מיקרוסקופ אור גיליונות זריחה כדי ללכוד תמונות 4-מימדי של השפעות להתכוונן גזירה על הלב דג זברה המתפתח

אנו מתארים כלים ממוטבים לחקר לב דג הזברה ב- vivo עם מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות של יריעת אור. באופן ספציפי, אנו מציעים קווים מהונדסים לב בהיר ולהציג טכניקות הטמעה עדינות חדשות ושתקה להימנע מומים התפתחותיים ולב. צינור איסוף וניתוח נתונים אפשרי המותאם להדמיית לב מסופק גם כן.

מיקרוסקופיה קלה של דינמיקת לב מהירה בעוברי דגי זברה

אנו מדווחים על שיטה לשחזור מזוסקופי של לב העכבר כולו על ידי שילוב של התקדמות חדשה בטרנספורמציה וצביעה של רקמות עם פיתוח של מיקרוסקופ אור סרוק אקסיאלי.

הדמיה אופטית מזוסקופית של לב עכבר שלם

פרוטוקול זה מדגים בידוד מונחה מיקרוסקופיה וצביעה אימונופלואורסצנטית של ורידים ריאתיים מורינים. אנו מכינים דגימות רקמה המכילות את אטריום שמאל, ורידים ריאתיים, ואת הריאות המתאימות ומכתימים אותם עבור טרופונין T לב ו Connexin 43.

מיקרודיסקציה וצביעה אימונופלואורסצנטית של שרוולי שריר הלב בוורידי ריאה מורין

הפרוטוקול משתמש במיקרוסקופ מתקדם של יריעות אור יחד עם שיטות מותאמות לניקוי רקמות כדי לחקור מבנים לבביים מורכבים בלבבות מכרסמים, טומן בחובו פוטנציאל גדול להבנת מורפוגנזה לבבית ועיצוב מחדש.

הדמיית יריעות אור לחשיפת מבנה הלב בלבבות מכרסמים

שחזור תלת מימדי (תלת מימדי) של נזק לבבי באוטם שריר הלב החריף (repAMI) מאפשר כימות נאמן ולוקליזציה משותפת של דפוסים המשפיעים על המחלה הקשורים. כאן, ניתנת גישת הדמיה מונחית יריעת אור אוטומטית למדידה בו-זמנית של נזק לבבי, אזור בסיכון ותגובת תאי חיסון.

ניתוח תלת מימד סימולטני של נזק לבבי ותגובה חיסונית באוטם שריר הלב החריף באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של יריעות אור

Bioreactor לחץ מחזורית מסוגל להעמיד שסתום רקמת לב לתנאי הלחץ פיזיולוגיים ופתולוגיים תוכנן. תוכנית LabVIEW מאפשר למשתמשים לשלוט על גודל הלחץ, משרעת ותדירות. מכשיר זה יכול לשמש כדי לחקור את mechanobiology של רקמת לב שסתום או תאים בודדים.

עיצוב של bioreactor לחץ על מחזורי Ex Vivo מחקר של מסתמי הלב אבי העורקים

המתודולוגיה להערכת אורינטציות סיבי חדרית מתמונות vivo של גיאומטריות לב מטופל לדוגמנות אישית הוא תאר. אימות של המתודולוגיה מבוצעת באמצעות רגיל ונכשל לבבות כלביים להוכיח כי שאין הבדלים משמעותיים בין אומדן ורכשו אורינטציות סיבים ברמה קלינית לצפייה.

דוגמנות מטופל ספציפי של לב: אומדן של אורינטציות סיבי חדרית

חקור מיקרוסקופ פלואורסצנטי בגיליונות אור לחקר הלב בעכברים. שיטה זו מאפשרת הדמיה מהירה של מבנה הלב ושינויים לאחר טיפול גנטי בקרדיולוגיה התפתחותית.

מיקרוסקופ אור גיליונות פלורסצנטיות לחקר הלב מאתר

גלה סרטונים נוספים