מתודולוגיה עבור איתור מדויק של מתילציה DNA מיטוכונדריאלי
20 במאי 2018
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לאפשר כימות מדויק של מיטוכונדריאלי מתילציה DNA (mtDNA). ב פרוטוקול זה, אנו מתארים של עיכול אנזימטי של DNA עם BamHI בשילוב עם צינור ניתוח bioinformatic אשר יכול לשמש כדי למנוע מופרזת של רמות מתילציה mtDNA שנגרם למבנה mtDNA משני.
המטרה הכוללת של פרוטוקול ריצוף ביסולפיט זה וצינור ביואינפורמטי היא להשיג כימות מדויק של מתילציה של DNA מיטוכונדריאלי. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום המיטואפיגנטי כגון האם מתילציה של DNA מיטוכונדריאלי משנה מחלות אנושיות? היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת כימות מדויק של מתילציה של DNA מיטוכונדריאלי.
שלב מכריע בעת חקירת מתילציה של DNA מיטוכונדריאלי הוא ליניאריזציה של ה-DNA המיטוכונדריאלי על ידי עיכול BamH1 לפני טיפול בנתרן ביסולפיט. אתר אנזים ההגבלה BamH1 מוצג במפה זו של הגנום המיטוכונדריאלי האנושי. מוצגים גם חמשת האזורים של הגנום המיטוכונדריאלי שייחקרו על ידי ריצוף ביסולפיט.
לולאת תזוזה, tRNA פנילאלנין, וריבוזום 12S, ריבוזום 16S, NADH דהידרוגנאז 5, גן מקודד mRNA ציטוכרום B. לאחר תכנון הפריימרים לריצוף ביסולפיט, תוך שימוש בכלים מקוונים כמתואר בפרוטוקול הטקסט, ספציפיות הפריימר לגנום המיטוכונדריאלי מאומתת באמצעות BiSearch. רצפי פריימר מתווספים לחיפוש פריימר של פונקציית BiSearch.
תיבת הביסולפיט מסומנת ונבחר גנום ייחוס. תוצאות החיפוש יציגו מוצרי PCR פוטנציאליים שנוצרו בשרשראות חישה ואנטי-סנס. כדי להגביר את אזורי העניין מהגנום המיטוכונדריאלי שהומר בביסולפיט, בצע PCR באמצעות פולימראז Taq Hot-start.
אם משתמשים בפריימרים בנפרד, מערבבים 100 ננוגרם של DNA מומר, 500 מיקרומולר של פריימרים חושים ואנטיסנס, תערובת dNTP אחת של מיקרוליטר ופולימראז ב-7.5 יחידות לתגובה בנפח כולל של 50 מיקרוליטר. הפעל את ה-PCR בתנאים הבאים: חמש דקות ב-95 מעלות צלזיוס, דקה אחת ב-94 מעלות צלזיוס, דקה אחת ב-55 מעלות צלזיוס, דקה אחת ב-72 מעלות צלזיוס למשך 35 מחזורים, ולאחר מכן 10 דקות ב-72 מעלות צלזיוס. עבור ריבוב פריימרים, השתמש ב-200 ננוגרם של DNA מומר בתנאי הרכיבה הבאים: חמש דקות ב-95 מעלות צלזיוס, דקה אחת ב-94 מעלות צלזיוס, 1.5 דקות ב-55 מעלות צלזיוס ו-1.5 דקות ב-72 מעלות צלזיוס למשך 35 מחזורים, ולאחר מכן 10 דקות ב-72 מעלות צלזיוס.
לאחר השלמת ה-PCR, בצע אלקטרופורזה ג'ל על מוצרי ה-PCR, באמצעות אגרוז של 2% ב-100 וולט. מיצוי מוצרי ה-PCR מג'ל האגרוז חייב להיעשות באופן שממזער את החשיפה ל-UV ואת הסיכון לנזק ל-DNA. צלם תמונה של הג'ל תחת אור UV.
לאחר מכן, מהר מאוד, סמנו סביב מוצר ה-PCR בעזרת אזמל וכבו את אור ה-UV. לאחר מכן, חתוך את מוצר ה-PCR לאט ללא חשיפה לאור UV. מניחים את פרוסות הג'ל בצינורות מיקרו-צנטריפוגה ומטהרים את מוצרי ה-PCR באמצעות טיהור ג'ל כמתואר בפרוטוקול הטקסט.
כמת את ה- DNA המטוהר באמצעות פלואורומטריה. אחסן את הדגימות ב-20 מעלות צלזיוס, אם לא המשך מיד להכנת ספריית ריצוף ביסולפיט. התחל בהכנת הספרייה של מוצרי PCR שהומרו בביסולפיט על ידי ביצוע תיקון סופי באמצעות עד 100 ננוגרם של מוצר PCR.
לכל צינור של 0.2 מיליליטר, הוסף 55.5 מיקרוליטר של מוצר PCR, שלושה מיקרוליטר של אנזים הכנה לקצה ו-6.5 מיקרוליטר של מאגר תגובת תיקון קצה פי 10. דגרו את הצינורות בתרמו-סייקלר בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, ולאחר מכן 65 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר מכן, קשרו מתאמי ריצוף על ידי ערבוב ה-DNA המתוקן הסופי עם 15 מיקרוליטר של תערובת ליגאז Blunt/TA, 2.5 מיקרוליטר של מתאם ומיקרוליטר אחד של משפר קשירה.
מניחים את התערובת במחזור תרמי, ודוגרים בחום של 20 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. השהה את התרמו-ציקלר והוסף 3 מיקרוליטר של אנזים USER לכל צינור. מערבבים ומניחים את הצינורות בחזרה לתרמוסייקלר ודוגרים בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
גודל: בחר את ה-DNA הקשור במתאם באמצעות קיבוע הפיך פאזה מוצקה או SPRI. הוסף ל-DNA הקשור במתאם 13.5 מיקרוליטר מים ו-55 מיקרוליטר חרוזי SPRI תלויים. דוגרים בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.
הנח את הצינורות על מעמד מגנטי. כאשר התמיסה צלולה, העבירו את ה-supernatant, שמכיל את הדנ"א הקשור במתאם, לצינור חדש, והשליכו את הצינור שמכיל את החרוזים. הוסף 25 מיקרוליטר של חרוזי SPRI תלויים לסופרנט; מערבבים ודוגרים בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.
הנח את הצינורות על המעמד המגנטי וכאשר התמיסה ברורה, השליך את הסופרנטנט. ה-DNA הקשור במתאם קשור כעת לחרוזים. בזמן שהצינורות נמצאים על המעמד המגנטי, הוסיפו 200 מיקרוליטר של אתנול 80% טרי לכל צינור ודגרו למשך 30 שניות כדי לשטוף את החרוזים.
הסר והשליך את הסופרנטנט. חזור על שלב שטיפת אתנול זה בסך הכל שתי כביסות. הסר את האתנול מהכביסה השנייה וייבש את החרוזים באוויר על ידי השארת הצינורות על המעמד המגנטי, כשהמכסה פתוח, למשך חמש דקות.
לאחר חמש דקות, הסר את הצינורות מהמעמד המגנטי, הוסף 23 מיקרוליטר של מאגר פליטת DNA לחרוזים וערבב. דוגרים בטמפרטורת החדר למשך שתי דקות. הנח את הצינורות על המעמד המגנטי עד שהתמיסה תהיה ברורה.
לאחר מכן, העבירו שני מיקרוליטר של התמיסה לצלחת PCR של 96 באר להגברה לפני ה-PCR. תוך הימנעות זהירה מהחרוזים, העבירו את שאר התמיסה לצינור חדש של 0.2 מיליליטר להגברת PCR. בצע הגברה לפני PCR על ידי RT-qPCR כדי להעריך את מספר המחזורים הדרושים להגברת ה-DNA הקשור במתאם.
הכינו תמהיל מאסטר של הדברים הבאים לכל תגובה בשימוש. 0.4 מיקרוליטר פריימר אינדקס, 0.4 מיקרוליטר פריימר PCR אוניברסלי, 7.2 מיקרוליטר מים ו-10 מיקרוליטר תערובת מאסטר RT-qPCR. לאחר מכן, מערבבים את תערובת המאסטר ומוסיפים 18 מיקרוליטר של תערובת מאסטר לשני המיקרוליטרים של ה-DNA בצלחת ה-PCR של 96 בארות.
הנח את הצלחת במכונת PCR בזמן אמת ובצע ampampבתנאים הבאים:30 שניות ב-98 מעלות צלזיוס, 10 שניות ב-98 מעלות צלזיוס ו-75 שניות ב-65 מעלות צלזיוס למשך 20 מחזורים, ולאחר מכן חמש דקות ב-65 מעלות צלזיוס. לאחר הערכת מספר מחזורי ההגברה הדרושים לכל דגימה, כמתואר בפרוטוקול הטקסט, הגבירו את ה-DNA הקשור במתאם. עבור כל דגימה, מערבבים 21 מיקרוליטר DNA, 25 מיקרוליטר תערובת מאסטר PCR, מיקרוליטר אחד של פריימר אינדקס, מיקרוליטר אחד של פריימר PCR אוניברסלי ושני מיקרוליטר מים.
במחזור התרמו, כפוף כל דגימה לתנאים הבאים:30 שניות ב-98 מעלות צלזיוס, 10 שניות ב-98 מעלות צלזיוס ו-75 שניות ב-65 מעלות צלזיוס עבור מספר המחזורים המחושב, ולאחר מכן חמש דקות ב-65 מעלות צלזיוס. טהר את ה-DNA המוגבר באמצעות חרוזי SPRI, כפי שהודגם קודם לכן ונפלט ב-22 מיקרוליטר של מאגר פליטה. שלוט באיכות הספרייה באמצעות ביואנלייזר.
חפש את גדלי השיא הנכונים של הספרייה. הערך את גודל זוג הבסיס הממוצע של מוצרי הספרייה על ידי ניתוח מריחה. בהגדרות גלובליות מתקדמות, תחת ניתוח מריחה, לחץ פעמיים על טבלה.
מצא את האזור מ-100 עד 1000 זוג בסיסים ולחץ על אישור. תחת טבלת אזור, האזור המוגדר יופיע והגודל הממוצע של הספריה יחושב. כימות הספרייה על ידי פלואורומטריה. אחסן את הספרייה בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס עד שתהיה מוכנה לריצוף ולניתוחים חישוביים של הדור הבא.
על ידי ריצוף ביסולפיט, מתילציה של DNA מיטוכונדריאלי נחקרה ב-DNA כולל לא מעוכל ומעוכל מתאי שריר שלד אנושיים בחמישה אזורים שונים של הגנום המיטוכונדריאלי. ריבוע שלם מייצג אתרי ציטוזין גואנין דינוקלאוטיד. הריבוע הפתוח מייצג אתרי גואנין דינוקלאוטידים שאינם ציטוזין.
עבור DNA מיטוכונדריאלי לא מעוכל, רמות המתילציה נעו בין 0-15.1% בכל האזורים שנחקרו. עם זאת, כאשר ה-DNA עוכל לפני ההמרה של ביסולפיט, שיעור ה-uncoversion ירד למקסימום של 1% בכל האזורים. זה ממחיש את החשיבות של עיכול BamH1 לפני המרת ביסולפיט כדי למנוע הערכת יתר של רמות המתילציה של ה-DNA המיטוכונדריאלי.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע ריצוף ביסולפיט מיטוכונדריאלי, ועל ידי מעקב אחר הצינור הביונואינפורמטי שלנו, תוכל להשיג כימות מדויק של מתילציה של DNA מיטוכונדריאלי.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה
מאמר זה מציג פרוטוקול רצף ביסולפיט וצינור ביואינפורמטיקה לכימות מדויק של מתילציה של DNA מיטוכונדריאלי (mtDNA). השיטה מתייחסת לשאלות מרכזיות בתחום המיטו-אפיגנטיקה, במיוחד בנוגע לשינויים במתילציה של mtDNA הקשורים למחלות אנושיות.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- נוירו-מדע
- אפיגנטיקה
- ביולוגיה של המיטוכונדריה
רקע
- מתילציה של DNA מיטוכונדריאלי ממלאת תפקיד מכריע בתפקוד התא.
- הבנת מתילציה של mtDNA יכולה לספק תובנות למחלות שונות.
- שיטות כימות מדויקות חיוניות לתוצאות מחקר אמינות.
- מבנים משניים של mtDNA יכולים להוביל להערכת יתר של רמות המתילציה.
מטרת המחקר
- לפתח פרוטוקול לכימות מדויק של מתילציה של mtDNA.
- לחקור את ההשפעה של מתילציה של mtDNA על מחלות אנושיות.
- לספק שיטה אמינה לחוקרים בתחום המיטו-אפיגנטיקה.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- עיכול אנזימטי של mtDNA באמצעות BamHI.
- טיפול ב-mtDNA עם נתרן ביסולפיט.
- צינור ניתוח ביואינפורמטי מחשבים לעיבוד נתוני רצף.
- חקירה של אזורים ספציפיים בגנום המיטוכונדריאלי.
תוצאות עיקריות
- הפרוטוקול מאפשר מדידה מדויקת של רמות מתילציה של mtDNA.
- ליניאריזציה של mtDNA היא חיונית לניתוח מדויק.
- הממצאים תורמים להבנת תפקיד המתילציה של mtDNA במחלות.
- השיטה יכולה להיות מיושמת בהקשרים מחקריים שונים במחקרים מיטוכונדריאליים.
מסקנות
- פרוטוקול זה משפר את הדיוק של כימות מתילציה של mtDNA.
- הוא מספק כלי ערך לחוקרים החוקרים מיטו-אפיגנטיקה.
- מחקרים עתידיים יכולים לנצל שיטה זו כדי לחקור את תפקידו של mtDNA בבריאות ובמחלות.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Accurate quantification of mitochondrial DNA methylation is critical for de-risking mitochondrial target validation in drug discovery. This protocol addresses technical artifacts from mtDNA secondary structure that can lead to false-positive methylation signals, thereby improving predictive confidence in mitoepigenetic studies. By enabling reliable measurement of mtDNA methylation changes, the method supports early-stage hypothesis testing and portfolio prioritization in mitochondrial disease research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of mitochondrial epigenetic hypotheses by providing accurate mtDNA methylation quantification.
- Operational Value: Reduces false-positive methylation calls through BamHI linearization prior to bisulfite treatment.
- Predictive Value: Supports target de-risking by distinguishing true epigenetic changes from structural artifacts in mtDNA.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, base-resolution methylation data across five key mtDNA regions for assay standardization.
- Operational Value: Includes bioinformatic pipeline to filter NUMTs and ensure mtDNA-specific signal detection.
- Scalability Value: Compatible with multiplexed primer designs and SPRI-based library preparation for medium-throughput workflows.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Links discovery-stage mtDNA methylation measurements to disease-relevant changes observed in human skeletal muscle.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed methylation shifts are biologically meaningful or technical artifacts.
- Preclinical Continuity: Supports longitudinal tracking of mtDNA epigenetic states in disease models.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery biology workflow, where accurate epigenetic readouts inform target validation and lead identification decisions, particularly in mitochondrial dysfunction pathways.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing around mtDNA methylation changes in disease states through locus-specific quantification.
- Screening: Produces reproducible, quantitative methylation outputs after BamHI digestion and bisulfite conversion, enabling compound effect assessment.
- Analytics: Generates single-base resolution methylation data via bioinformatic pipeline, facilitating cross-condition comparison and statistical modeling.
- Translational Research: Connects in vitro findings to human tissue data, supporting biomarker relevance in mitoepigenetic studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, reusable protocol for mtDNA epigenetic analysis across multiple projects and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves target validation confidence by reducing mechanistic ambiguity from mtDNA structure-related artifacts.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized enzymatic linearization and bioinformatic filtering steps.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions in mitochondrial target programs by providing reliable epigenetic data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement of mitoepigenetic targets based on quantitatively validated methylation changes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mitochondrial DNA isolation, restriction enzyme handling, and bisulfite conversion techniques.
- Dependent on access to thermocyclers, gel electrophoresis, SPRI bead systems, and next-generation sequencing platforms.
- Necessitates cross-team standardization between molecular biology and bioinformatics for consistent data interpretation.
- Must account for mtDNA copy number variability across cell types and disease states when designing experiments.
- Limited by the need to avoid NUMT contamination through primer design and in silico verification using tools like BiSearch.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:35
Restriction Enzyme Treatment, Bisulfite Conversion, and Design of Bisulfite Sequencing Primers
1:54
Bisulfite Converted PCR and Gel Extraction
4:16
Bisulfite Sequencing Library Preparation
10:44
Results: Accurate Quantification of mtDNA Methylation
11:48
Conclusion
