קרינה פלואורסצנטית מולקולה בודדת ב באתרו הכלאה (smFISH) ניתוח הנצה גידול וגטטיבי שמרים, מיוזה

המטרה הכוללת של הכלאה אופטימלית זו של RNA מולקולה בודדת באתר, או smFISH, היא לזהות ולכמת מולקולות RNA בודדות על בסיס תא במהלך הצמיחה הווגטטיבית והמיוזה של שמרים ניצנים. שיטה זו חושפת שונות מתא לתא בביטוי גנים בלוקליזציה של RNA תת-תאי ולכן היא טכניקה רבת עוצמה לחקר ויסות גנים. מלבד המידע הייחודי שיכול להיחשף על ידי smFISH, היתרון העיקרי של הטכניקה הוא שלאחר אופטימיזציה, היא חזקה וניתנת לשחזור מאוד.

תרבית מיוטית תשמש להדגמת פרוטוקול זה. כדי לתקן את התרבות ב -3% פורמלדהיד, הוסף 1840 מיקרוליטר של התרבות ל -160 מיקרוליטר של 37% פורמלדהיד בצינור מיקרו-צנטריפוגה של שני מיליליטר. הופכים כחמש פעמים לערבוב.

הניחו את הצינור על תוף רולר בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. לאחר 20 דקות, המשך לתקן בארבע מעלות צלזיוס עם סיבוב למשך הלילה. למחרת, התכוננו לעיכול על ידי הפשרה תחילה של קומפלקסים ריבונוקלאוזידים של 200 מילי-מולארי, או VRC, בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לפחות.

להכנת תערובת מאסטר העיכול, תחילה פיפטה 2125 מיקרוליטר של מאגר B לתוך צינור של 15 מיליליטר. לאחר מכן מערבב את ה-VRC החם למשך חמש שניות כדי להשעות אותו לחלוטין ולהוסיף 200 מיקרוליטר של VRC לשפופרת ה-15 מיליליטר. התערובת צריכה להיראות בצבע ירוק חום בהיר.

צנטריפוגה את הדגימה המיוטית ב 21, 000 x גרם למשך דקה וחצי בטמפרטורת החדר. שאפו את הסופרנטנט בזהירות, והניחו את קצה הוואקום בצד הנגדי של הגלולה כדי למנוע הפרעה לגלולה. השעו מחדש את התאים במיליליטר וחצי של מאגר קר B על ידי פיפטינג למעלה ולמטה לערבוב.

צנטריפוגה ב 21, 000 x גרם למשך דקה וחצי. הסר את עיקר הנוזל על ידי שאיבת ואקום, והשאיר אחריו כ -100 מיקרוליטר. השעו מחדש את התאים במיליליטר וחצי של מאגר קר B.צנטריפוגה את הדגימות, הסירו את הנוזל והשעו מחדש את התאים במיליליטר וחצי של מאגר קר B.

צנטריפוגה ב 21, 000 x גרם למשך דקה וחצי. שאפו את הנוזל לחלוטין על ידי פיפטינג. השעו מחדש את התאים ב-425 מיקרוליטר של תערובת מאסטר לעיכול ומערבולת לזמן קצר.

הוסף חמישה מיקרוליטרים של זימוליאז לצינור ולמערבולת למשך שתיים-שלוש שניות לערבוב. הניחו את הצינור על תוף רולר ועכלו בחום של 30 מעלות צלזיוס למשך 15 עד 30 דקות. לאחר 15 דקות יש לבדוק את התאים במיקרוסקופיה כל חמש דקות ולהפסיק את העיכול כאשר כ-80% מהתאים נראים לא שקופים ולא שבורים.

צנטריפוגה את הצינור ב 376 x גרם למשך שלוש דקות. הסר את הסופרנטנט לחלוטין. השעו בעדינות את התאים עם מיליליטר אחד של מאגר B על ידי פיפטינג למעלה ולמטה פעם עד פעמיים כדי לערבב.

צנטריפוגה את הצינור והסר את המאגר. השעו בעדינות את התאים במיליליטר אחד של אתנול 70% ודגרו בטמפרטורת החדר למשך שלוש וחצי עד ארבע שעות. כדי להתחיל בהליך ההכלאה, צנטריפוגה את צינור התאים ב-376 x g למשך שלוש דקות.

הסר 500 מיקרוליטר מהאתנול 70% מהצינור. פיפטה בעדינות למעלה ולמטה כדי להשעות מחדש את התאים הנותרים ולהעביר את התאים לצינור הידבקות נמוך. העברת הדגימה לצינור הידבקות נמוך היא קריטית למניעת אובדן עודף תאים במהלך שטיפות הפורממיד הבאות.

צנטריפוגה את צינור ההדבקה הנמוך והסר את כל האתנול. הוסף מיליליטר אחד של מאגר שטיפת פורממיד 10% לשפופרת ופיפטה בעדינות למעלה ולמטה פעמיים עד שלוש כדי להשהות מחדש את התאים. אפשר לתאים להתייצב בטמפרטורת החדר למשך כ-20 דקות בזמן הכנת פתרונות ההכלאה, כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

צנטריפוגה את הדגימה והסר את הסופרנטנט לפסולת מסוכנת. הוסף לפחות 50 מיקרוליטר מכל תמיסת הכלאה לצינור והעביר את הצינור לערבוב. דגירה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס על תוף רולר למשך 16 שעות לפחות בחושך.

לאחר השלמת ההכלאה, הנח את צינור התאים לתוך קופסה מכוסה נייר כסף כדי להגן מפני אור. צנטריפוגה את הדגימה ב-376 x גרם למשך שלוש דקות. הסר את הסופרנטנט לפסולת מסוכנת על ידי פיפטינג.

השעו מחדש את הדגימה במיליליטר אחד של מאגר שטיפת פורממיד 10% על ידי פיפטינג בעדינות למעלה ולמטה פעמיים עד שלוש. הכניסו את צינור התאים בחזרה לקופסה מכוסה בנייר כסף כדי להגן מפני אור ודגרו בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר 30 דקות, צנטריפוגה את הדגימה.

הסר את הסופרנטנט לפסולת מסוכנת על ידי פיפטינג, והשאיר כ-50 מיקרוליטר. השעו מחדש את הדגימה במיליליטר אחד של תמיסת DAPI על ידי פיפטינג בעדינות למעלה ולמטה פעמיים עד שלוש. שוב, הכניסו את צינור התאים לקופסה המכוסה בנייר כסף ודגרו בחום של 30 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.

צנטריפוגה את הדגימה והסר את הסופרנטנט לחלוטין על ידי פיפטינג. עבור דגימות שלא יצולמו מיד, השעו מחדש את הגלולה ב-50 מיקרוליטר של מאגר GLOX ללא אנזימים. פיפטה למעלה ולמטה שלוש עד ארבע פעמים לערבוב.

שומרים בקופסה המכוסה בנייר כסף בארבע מעלות צלזיוס עד שיהיה מוכן לצילום. להדמיה מיידית של דגימות יש להוסיף 15 עד 20 מיקרוליטר של מאגר GLOX עם אנזימים. פיפטה חמישה מיקרוליטר על החלקת כיסוי והנח את פתק הכיסוי על שקופית.

הנח מגבון מעבדה על גבי המגלשה שבה מונחת החלקת הכיסוי. לחץ בעדינות על המגבון כדי להגדיר את השקופית. הנח את השקופית בקופסה מכוסה בנייר אלומיניום להעברה לחדר המיקרוסקופ.

פרוטוקול זה שימש לבחינת הביטוי של הגן NDC80, המבטא שני איזופורמים של mRNA. לאיזופורם התעתיק הארוך והלא מפוענח יש 400 זוגות בסיסים חמש הרחבות ראשוניות בהשוואה לאיזופורם הקצר. תוכננו שתי קבוצות של בדיקות.

קבוצת CF 590 נקשרת לאזור הייחודי של חמשת הראשוניים של האיזופורם הארוך, וקבוצת Q 670 נקשרת לאזור המשותף של שני האיזופורמים. בתנאים אופטימליים, זוהו בבירור כתמי smFISH מובהקים עבור שתי קבוצות הבדיקות. שתי ערכות הבדיקה שימשו לחקר ביטוי NDC80 במהלך גדילה וגטטיבית ומיוזה.

בתאים וגטטיביים זוהה אות חזק ממערך הבדיקה Q 670, אך לא ממערך הבדיקה CF 590. לעומת זאת, אות חזק משתי קבוצות הבדיקה זוהה בפרופאזה מיוטית, ולרוב הכתמים היה אות משותף. ניתוח הכתם הצפוני אישר כי האיזופורם הארוך התבטא במיוחד במיוזה.

נמצא כי לתאים וגטטיביים יש חציון של חמישה תעתיקים איזופורמיים קצרים לתא, בעוד שבתאי פרופאזה מיוטיים, החציון ירד משמעותית לארבעה תעתיקים לתא. בפרופאזה מיוטית, המספר החציוני של תעתיקי איזופורמים ארוכים לתא היה 21 ו-100% מהתאים ביטאו את התעתיק. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך 72 שעות אם היא מבוצעת כראוי.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב תחילה לייעל את משך העיכול וריכוז בדיקות smFISH הנדרשות כדי להשיג את יחס האות לרעש האופטימלי. נוסף על כך, זכרו להוסיף VRC במהלך העיכול והכלאה במהלך הלילה כדי למנוע פעילות נוקלאז. עם התפתחות זו, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים לחקור ויסות גנים דינמי ולוקליזציה של RNA תת-תאי.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד לבצע RNA FISH מולקולרי יחיד במיוזה שמרים ניצנים.