זיהוי נוגדנים המנטרלים את קליטת סלולר הנובעים מהשימוש בתחליפי האנזים עם Assay מבוססת-תא

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום החיסוני והביואנליטי לגבי ההשפעה של נוגדנים מנטרלים על בטיחות התרופות, יעילותן ופרופילים פרמקוקינטיים ופרמקודינמיים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת שיטה תאית רגישה ורלוונטית מבחינה ביולוגית למדידת נוגדנים מנטרלים ספציפיים לתרופה באופן חצי כמותני. בטכניקה זו, אנזימים המסומנים בפלואורופור נכנסים לתאי ג'ורקט באמצעות קשירה של שאריות מנוז-6-פוספט לקולטן מנוז-6-פוספט בלתי תלוי בקטיון או CI-M6PR.

נוגדנים מנטרלים המונעים אינטראקציה של קולטן האנזים גורמים לירידה בקרינה כפי שנמדד על ידי ציטומטריית זרימה. כדי להתחיל, זרע 7.5 כפול 10 לתאי ג'ורקאט הרביעיים ב-100 מיקרוליטר של מדיום גידול תאים לכל באר בצלחת תרבית תאים תחתונה עגולה של 96 בארות לדגירה של 14 עד 20 שעות ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני עם 95% לחות. יש לדלל תחילה את דגימות הבדיקה במדיום נטול סרום ביחס של 1 ל-2.5.

לאחר מכן הוסף 60 מיקרוליטר מכל דגימה לבארות המתאימות של צלחת פוליפרופילן תחתונה עגולה לבנה בת 96 בארות. זו תהיה צלחת הדגירה לדוגמה. עבור דגימות שנמצאו חיוביות ויש לאשר אותן, מערבל בקבוקון של טיפול בהחלפת אנזים או חרוזי ERT והוסף את המספר המתאים של חרוזים לצינור חרוטי של 15 מיליליטר למערבולת נוספת.

לאחר מכן הניחו את הצינור במתלה צינור מגנטי למשך שתי דקות והסירו בזהירות את הנוזל העליון. לאחר הכביסה הרביעית, הוסיפו 100 מיקרוליטר חרוזים לבארות המתאימות של צלחת פוליפרופילן תחתונה עגולה חדשה עם 96 בארות. כאשר כל החרוזים מצופים, הניחו את הצלחת על מגנט עם חצאית צד של 96 בארות ואפשרו לחרוזים ליצור כדור לפני שתסיר בזהירות את הסופרנטנט השקוף.

לאחר מכן, הוסיפו 140 מיקרוליטר מכל דגימה לבארות המתאימות ואטמו את הצלחת בניילון פלסטיק לניעור למשך 60 דקות לפחות על שייקר סיבובי בכ-800 סל"ד בטמפרטורת החדר. לאחר מכן הנח את לוחית האישור על המגנט בעל החצאית הצדדית של 96 בארות כדי לאפשר לחרוזים ליצור גלולה נוספת ולהוסיף 60 מיקרוליטר של דגימה לבארות המתאימות של צלחת דגירה של דגימת פוליפרופילן תחתונה עגולה לבנה בת 96 בארות. עבור דגימות שנבדקו ואושרו כחיוביות, ניתן לבצע סדרת טיטר.

כדי להכין סדרת טיטר, יש לדלל באופן סדרתי את הדגימה במטריצה המאוגדת מספר מספיק פעמים כדי לחצות את נקודת החיתוך שנקבעה מראש ולהוסיף 60 מיקרוליטר מכל דגימה מדוללת לבארות המתאימות של לוחית הדגירה של הדגימה ו-60 מיקרוליטר מהריכוזים המתאימים של ERT המסומן בפלואורופור לבארות המתאימות של צלחת פוליפרופילן חדשה עם תחתית עגולה לבנה בת 96 בארות שאינה מחייבת בהתאם לפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן פיפטה את תמיסת הדגימה של פלואורופור ERT מספר פעמים כדי לערבב ולעטוף את הצלחות בנייר כסף למשך 14 עד 20 שעות דגירה בשתיים עד שמונה מעלות צלזיוס. למחרת בבוקר, חממו את צלחות הדגימה באמבט חרוזים של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 עד 15 דקות ובדקו את התאים המצופים במיקרוסקופ הפוך כדי לוודא שהתאים בריאים ומפוזרים באופן שווה על פני הבארות.

כאשר הצלחות התחממו, הוסף 100 מיקרוליטר של דגימה ותערובת ERT עם תווית פלואורופור לצלחת התא על פי מפת לוחות הניסוי והחזיר את התאים לחממת תרבית התאים למשך שלוש שעות ו-15 דקות נוספות. בתום הדגירה, גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ואשר נוכחות של כדור בתחתית כל באר. החזק את הצלחת בזווית של 30 עד 45 מעלות, הסר בזהירות את הסופרנטנט בכל באר מבלי להפריע לכדורים ושטוף את התאים שלוש פעמים ב-200 מיקרוליטר DPBS לבאר לכל צנטריפוגה.

לאחר הכביסה האחרונה, הוסיפו 100 מיקרוליטר כתם מת חי לכל באר למשך 15 דקות דגירה בטמפרטורת החדר בחושך. בתום הדגירה יש לגלול את התאים על ידי צנטריפוגה ולשטוף את התאים ב-200 מיקרוליטר DPBS לבאר. השעו מחדש את הכדורים השטופים ב-100 מיקרוליטר של שתיים עד שמונה מעלות צלזיוס 1% פרפורמלדהיד לבאר ואטמו את הצלחת למערבולת דופק עדינה.

לאחר מכן עוטפים את הצלחת בנייר כסף לקיבוע של 10 דקות בשתיים עד שמונה מעלות צלזיוס. כדי לנתח את כדאיות התא על ידי ציטומטריית זרימה, מערבבים את התאים עם 50 מיקרוליטר DPBS לבאר כדי להשיג תרחיף תא בודד ולקרוא את התאים על ציטומטר זרימה על פי פרוטוקולי ציטומטריית זרימה סטנדרטיים. לאחר מכן ניתן להעריך את ספיגת ה-ERT המצומדת של פלואורופור על פי עוצמת הקרינה החציונית או MFI של התאים הבודדים החיים.

לפני הבדיקה בבדיקה, נקודת חיתוך סינון ניסיונית מחושבת כסף לקביעת הדגימות החיוביות והשליליות. בדוגמה זו, מוצגות בקרות איכות עם כמויות גבוהות או נמוכות של נוגדנים מנטרלים. לאחר מכן נבדקות דגימות חיוביות בבדיקה מאשרת באמצעות חרוזים מגנטיים מצומדים לתרופה כדי לרוקן את הנוגדן הספציפי לתרופה מהדגימות.

דגימות עם יחס התאוששות גדול מנקודת החיתוך המאשרת נחשבות לחיוביות. דגימות שנבדקו ואושרו חיוביות מדוללות באופן סדרתי ונבדקות בבדיקת הטיטר כדי לקבוע את הטיטר היחסי של הנוגדנים המנטרלים בכל דגימה. טיטר הוא הערך האינטרפולציה בין שני דילולים החוצים את נקודת החיתוך של הטיטר.

מוצג כאן, ה-MFI החי של תא בודד העריך את ספיגת ה-ERT המצומדת של פלואורופור. לדוגמה, בניסוי זה, המטריצה עם נוגדן הבקרה החיובי עיכבה את ספיגת ה-ERT המצומד של פלואורופור וכתוצאה מכך עוצמת הקרינה החציונית נמוכה. לעומת זאת, תאים שהודגרו עם המטריצה בהיעדר נוגדן בקרה חיובי הראו עוצמת פלואורסצנטיות חציונית גבוהה יותר המדגימה קליטה של ה-ERT המצומד פלואורופור.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשמור על חלונות דגירה קפדניים כדי להשיג תוצאות אמינות ועקביות. חשוב גם לייעל את הבדיקה עבור כל טיפול בתחליפי אנזימים. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך למדענים אימונוגניים וביואנליטיים בפיתוח תרופות לחקור את ההשפעה של נוגדנים מנטרלי ספיגת תאים על בטיחות ויעילות ERT.

אל תשכח שעבודה עם דגימות אנושיות עלולה להיות מסוכנת ביותר וכי יש להתייחס לכל הדגימות כאילו הן עלולות להיות מדבקות בזמן ביצוע הליך זה.