הערכה של התנגדות מעכבי טירוזין קינאז על ידי חקירה של האות התמרה חושית מסלולים על-ידי מערכים נוגדן

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח על הפרעה ברשתות איתות שיכול לגרום לצמיחה סרטן או התפתחות של עמידות לטיפולים ספציפיים. היתרון העיקרי של טכניקה זו היא שהיא יכולה לספק משוב מהיר ואמין על מצב זרחון של רשתות מרובות כי הם לעתים קרובות deregulated בסרטן. המשמעות של טכניקה זו משתרעת לכיוון טיפול של סרטן עמידים לתרופות כי זיהוי של שינויים ושינויים שלאחר התרגום יכול להבהר שינויים בפעילות מסלול התמרת אותות.

בעוד טכניקה זו משמשת על זרחון, זה יכול לשמש גם כדי להסתכל על שינויים אחרים שלאחר התרגום כגון גליקוזילציה בכל מקום. התחל על ידי שטיפה יסודית של תאים מתורבתים לילה שלוש פעמים עם 10 מיליליטר של PBS דואג להסיר את כל PBS לאחר הכביסה האחרונה. לאחר מכן, הוסיפו את הנפח המתאים של מאגר תיזה מערכת בדיקה של חלבונים ולהשתמש מגרד תאים כדי לנתק את התאים.

טרייטוראט פתרון התא וכתוצאה מכך כ 10 פעמים לפני העברת לפחות פעם אחת 10 לתאים השביעיים לצינור 1.5 מיליליטר. דגירה התאים במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס עם רעידות. לאחר מכן לטעון את lysate לתוך מזרק מצויד מחט מד 27 ולוותר ולחלק את המדגם 10 פעמים כדי לגנווט את קרום התא.

כאשר קרום התא שובש לחלוטין, צנטריפוגה lysate ולהעביר את supernatant לצינור חדש 1.5 מיליליטר לכמות החלבון הכולל הבאים על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. כדי לבצע בדיקת פוספוקינאז אנושית, השתמש תחילה בציוצים שטוחים כדי למקם קרום מערך אחד בכל באר של מגש רב-תכליתי בן ארבע בארות המכיל שני מיליליטר של מאגר מערך טרי אחד ל הבאר עם מספרי הממברנות הפונים כלפי מעלה. עם הטביעה, הצבע על הממברנה ייעלם.

מכסים את המגש במכסה ודורגים את הממברנות על שייקר פלטפורמת נדנדה במשך 60 דקות בטמפרטורת החדר. במהלך דגירה זו חסימה, לדלל כל מדגם lysate ל 50 עד 100 מיקרוגרם של ריכוז חלבון בנפח מרבי של 334 microliters של חיץ תזה ולהביא את הנפח הסופי של דגימת חלבון שחולצו עד 1.5 מיליליטר עם חיץ מערך טרי. לאחר מכן, שאפו בזהירות את חיץ המערך מכל באר של המגשים הרב-מגשיים והדגירה את הממברנות עם 1.5 מיליליטר של דגימת חלבון למשך לילה בשתיים עד שמונה מעלות צלזיוס על שייקר פלטפורמת נדנדה.

למחרת בבוקר, להעביר בזהירות כל מערך לתוך מיכלי פלסטיק בודדים המכילים 20 מיליליטר של חיץ לשטוף במשך שלוש 10 דקות לשטוף על פלטפורמת נדנדה בטמפרטורת החדר. לאחר הכביסה האחרונה, הוסיפו 20 מיקרוליטרים של קוקטייל הנוגדנים המוסכם המתאים לשני מיליליטר של חיץ מערך, שניים ל הבאר, ונפחו בזהירות את הקצה התחתון של כל קרום על מגבת נייר כדי להסיר כל חיץ שטיפה עודף. לאחר מכן מניחים כל מערך בחזרה לתוך הבאר המתאימה של מגש הנוגדנים ומכסים את המגש עבור דגירה של שעתיים בטמפרטורת החדר על פלטפורמת נדנדה.

בסוף הדגירה, מעבירים בזהירות כל מערך למיכל פלסטיק חדש באורך שמונה על 11 ס"מ המכיל 20 מיליליטר של חיץ שטיפה במשך שלוש שטיפות של 10 דקות כפי שהודגם זה בלבד. לאחר הכביסה האחרונה, מוסיפים מיליליטר אחד של פתרון צנון סוס סטרפטוודין מתאים לכל באר של המגש רב הבאר ולהחזיר את הממברנות ל הבאר המתאימה שלהם עבור דגירה של 30 דקות בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, מניחים כל קרום בין שתי חתיכות של נייר מסנן חמישה מילימטר כדי להסיר כל חיץ עודף דגירה קרום מיובש עם פתרון זיהוי peroxidase צנון סוס המתאים במשך שלוש דקות.

לאחר מכן מניחים את הממברנות לתוך מגיני יריעות פלסטיק ברורים בודדים להדמיה עוקבת. כדי להעריך את ביטוי הקולטן טירוזין קינאז בכל דגימה, פתח את התמונות בתוכנית עיבוד תמונה מתאימה כגון Image J ובחר ערוך והתהפך מהתפריטים הנפתחים המתאימים כדי להפוך את הכתמים השחורים על הרקע הלבן של התמונה לנקודות לבנות על רקע שחור. לאחר מכן, השתמש בכלי אליפסה כדי להקיף זוג אחד של נקודות לבנות על כתם הנקודה ובחר נתח ולמדוד כדי לפתוח באופן אוטומטי חלון חדש המציג את הערכים עבור האזור שנבחר.

לאחר מכן מקם את הנקודה של חץ העכבר למרכז האליפסה וגרור את האזור המעגלי סביב אזור הנקודה הבא עד שכל נקודות העניין נמדדו. בניסוי מייצג זה, ההשפעות של עמידות מעכבי טירוזין קינאז על מסלולי ההטלה אות נותחו בבקרה אחת בשלושה קווי תאים עמידים מעכבי טירוזין קינאז. שישה חלבוני פוספו עם פעילות דיפרנציאלית נבחרו והעוצמה היחסית נקבעה עבור מספר חלבונים מועמדים בכל קו תא.

כפי שהודגם על ידי מפת החום, קריאה כמותית למחצה על השינויים בזרחון החלבון של חלבונים חשובים להעתקת אותות יכולה להיווצר לאחר מכן. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להתחיל עם תאים בריאים ומפרידים באופן פעיל כמו לחצים עלול לגרום לשינויים בפעילות מסלול התמרה אות. בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש בשיטות אחרות כגון PCR דיגיטלי ואימונובלוטציה כדי לענות על שאלות נוספות כגון האם שינויים בזרחון מובילים להפעלת גורמי שעתוק?

לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בביולוגיה של סרטן לחקור שינויים יסודיים בשינוי שלאחר התרגום של חלבונים המובילים ל הופעתה של רפואה מותאמת אישית לחולים עם סרטן. אל תשכח כי עבודה עם קווי תאים סרטניים הוא מסוכן מאוד כדי להיות בטוח להשתמש בטכניקות aseptic, זהירות בעת סילוק חדים ללבוש חלוק מעבדה בכל עת.