Optogenetics זיהוי של סוג עצביים עם Optrode זכוכית בעכברים ער

שיטה זו יכולה לסייע לענות על שאלות מפתח בתחום מדעי המוח, כמו למשל התפקודים של סוגים שונים של נוירונים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת לזהות באופן אמין את סוגי הנוירונים השונים in vivo עם חומרים זולים ונגישים. אני אדגים את ההליך יחד עם שינג'י מורמוטו, הטכנאי שלנו, ולאנלן מא, עוזר הפרופסור שלנו מהמעבדה שלנו.

כדי להתחיל בהליך זה, משוך בעדינות את צינור הפלדה לבקרת לחץ מהקנה של המחזיק. הרחב את החור של צד מושב הסיכה בקנה של המחזיק על ידי קידוח. לאחר מכן, הניחו צינור נירוסטה בחור.

לאחר מכן, הכנס לתוך החור שרוול הזדווגות מפוצל קרמי לקוטר 2.5 מילימטר. צרו חור בארנב בצורת L והצמידו את הקנה של מחזיק האלקטרודה לארנב בעזרת דבק אפוקסי. לאחר מכן, חבר אותו למניפולטור עם ברגים.

הכן עמוד ראש שנבנה בהתאמה אישית על ידי הפיכת מרווח המעגל העמודי לצורה קובואידית עם חותך כרסום, וחתוך אותו לשני עמודי ראש בעזרת מסור. לאחר מכן, משטחים את החלק התחתון של עמוד הראש בעזרת חותך כרסום. לפני הניתוח יש לחטא את כל מכשירי הניתוח ועמוד ראש עם חיטוי.

נקה את המסגרת הסטריאוטקסית ואת כרית החימום עם 70 אחוז אלכוהול. לאחר מכן, הרדמו את העכבר והניחו אותו במסגרת הסטריאוטקסית על כרית חימום. בניסוי זה נעשה שימוש בעכבר טרנסגני בו נעשה שימוש בנוירונים המעכבים המבטאים channelrhodopsin-II.

הנח את השיניים בחור של מוט הנשיכה והדק קלות את האף clamp. לאחר מכן, תקן את שני צידי הראש באמצעות מוטות אוזניים. כאשר הראש מקובע כהלכה על ידי מוטות האוזניים, הדק את האף clamp.

מרחו משחה עיניים על העיניים. חתוך את השיער מעל הראש עם מספריים קטנים ונקה את הקרקפת בעזרת צמר גפן של כלורהקסידין גלוקונאט. לאחר מכן, חותכים את הקרקפת לאורך קו האמצע ודוחפים אותה הצידה.

הסר את הפריאוסטאום בעזרת צמר גפן טבול ב -70 אחוז אלכוהול ותן לגולגולת להתייבש. לאחר מכן, חבר את עמוד הראש למניפולטור. מקם את מוט הראש שטוח על הגולגולת סביב הברגמה באמצעות המניפולטור.

מערבבים ארבע טיפות מהמונומר, טיפה אחת של זרז וכף קטנה אחת של פולימר על צלחת קטנה שצוננת במקרר. מרחו מלט דנטלי על העצם הקדמית והקודקודית וקבעו את עמוד הראש לגולגולת. לאחר שהמלט הדנטלי התקשה, הסר את העכבר מהמסגרת הסטריאוטקסית.

מרחו משחה אנטיביוטית על העור החשוף והזריקו קוקטייל של אנטגוניסט ואנטיביוטיקה של מדטומידין. לאחר מכן, הניחו את העכבר על כרית החום בכלוב עד שהוא מתעורר והחזירו אותו לכלוב דיור עם העשרה. כדי לבצע קרניוטומיה על אזור מוח היעד לצורך רישום, נקו את הגולגולת בעזרת צמר גפן ספוג בכלורהקסידין גלוקונאט ו-70 אחוז אלכוהול.

מגרדים בזהירות את הגולגולת מעל אתר ההקלטה בעזרת מקדחה דנטלית. כשהעצם דקה מספיק, חותכים אותה בקצה האזמל ומסירים אותה. לאחר מכן מרחו מלט דנטלי סביב האזור החשוף על מנת לחזק את הגולגולת.

כסו את אזור המוח החשוף בדבק סיליקון לאחר שהמלט הדנטלי התקשה. לאחר מכן, הניחו את החיה על כרית החום בכלוב עד שהיא מתעוררת, והחזירו אותה לכלוב דיור. אפשר לבעל החיים להתאושש לפחות יום אחד לאחר כריתת הגולגולת, לפני ביצוע הרישום האלקטרופיזיולוגי.

לפני ביצוע ההקלטה האלקטרופיזיולוגית, הכינו כמה פיפטות זכוכית מנימי זכוכית בורוסיליקט באמצעות מושך אלקטרודות. מלאו את הפיפטות ב -10 מילימולר PBS. בחלק מההקלטות, שני אחוזים נוירוביוטין מתווספים ל-PBS של 10 מילי-מולאר.

לאחר מכן, הנח את החיה בתא ההקלטה. חבר פיפטה מזכוכית מלאה למחזיק האופטרוד בהתאמה אישית. הכנס חוט מצופה כלוריד כסף לתוך פיפטת הזכוכית.

לאחר מכן, חבר את הסיכה לראש stage של מגבר ההקלטה. לאחר מכן, חבר את כבל תיקון הסיבים האופטיים עם טבעת זירקוניה לשרוול ההזדווגות המפוצל על מחזיק האופטרודה. דחף את כבל התיקון לתוך השרוול עד שקצה הטבעת יוצר קשר עם החלק האחורי של פיפטת הזכוכית.

כבל התיקון מספק את האור מ-LED, הנשלט על ידי דרייבר LED חד-ערוצי. לאחר מכן, הסר את דבק הסיליקון מעל הגולגולת. מרחו מי מלח חמים על פני המוח מעת לעת כדי למנוע התייבשות של פני המוח במהלך ההקלטה.

במידת הצורך, הסר את הדורה בעזרת פינצטה חדה. כאן, תגובות הספייק תועדו בקוליקולוס התחתון של עכברי VGAT channelrhodopsin-II ערים. בקוליקולוס התחתון של עכברי VGAT channelrhodopsin-II, נוירוני GABAergic מבטאים באופן ספציפי channelrhodopsin-II.

בעכברים ערים, גם הנוירונים GABAergic וגם הנוירונים הגלוטמטרגיים התרגשו או דוכאו בהתאמה כאשר ניתנו להם גירויים קלים. כאשר גירוי האור מועבר דרך אלקטרודת הזכוכית, הוא מעורר תגובות ספייק בחלק מהנוירונים. לעומת זאת, בתאי עצב אחרים, גירוי האור דיכא את תגובות הספייק שעוררו גירויי קול.

תוצאות אלה מראות כי אופטרוד זכוכית יכול לתעד את פעילות היחידה הבודדת המבודדת היטב ולעורר באופן אמין את הנוירונים המוקלטים על ידי אור. לאחר הפיתוח, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום מדעי המוח לחקור כיצד סוגים שונים של נוירונים פועלים בשקע העצבי של אזורי מוח שונים.