Name: Optogenetics זיהוי של סוג עצביים עם Optrode זכוכית בעכברים ער (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-28T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: למדו שיטת אופטוגנטיקה לזיהוי סוגי נוירונים בעכברים ערים באמצעות אופטרוד זכוכית מותאם אישית. טכניקה זו מאפשרת הקלטת פעילות יחידתית מבודדת היטב ומספקת כלים לחקר תפקודי נוירונים שונים במוח החי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים נתמכו על ידי החברה יפן 17H 02223 של קידום המדע KAKENHI גרנט JP16K11200, המענק לחקר מ קנאזאווה רפואי באוניברסיטת S2016-8 ו- C2017-3. אנו מודים Yuhichi מלון התמיכה שלו לקחת את התמונות.

כל ההליכים נעשים על פי העקרונות המנחים של החברה פיזיולוגיים של יפן, באישור של בעלי חיים אכפת הוועדה של קנאזאווה רפואי האוניברסיטה.
1. בנייה של בעל Optrode זכוכית
הערה: כדי לבנות בעל optrode זכוכית, בעל אלקטרודה מסחרי משמש (איור 1 א').
<ol><li>משוך בעדינות החוצה את צינור פלדה לבקרת לחץ מתוך לוע של המחזיק.</li>
	<li>על ידי קידוח, להרחיב את החור של הצד המושב סיכה בקנה של בעל. להפוך את החור 3 מ מ בקוטר של 12 מ מ עומק.</li>
	<li>לשים צינור פלדה אל חלד (3 מ מ בקוטר של 0.5 מ מ עובי, 8 מ"מ אורך; איור 1A 2) בתוך החור.</li>
	<li>הכנס קרמיקה לפצל שרוול ההזדווגות עבור ⌀2.5 ferrules מ מ (איור 1 א'1) לתוך החור.</li>
	<li>לתקן את החבית של בעל אלקטרודה rabbet בצורת L עם דבק אפוקסי.</li>
	<li>להפוך את החורים (3 מ מ קוטר) rabbet ולחבר אותו תחמן עם ברגים.</li>
</ol>2. ראש פוסט התקנה
<ol><li>להכין פוסט ראש לפי הזמנה של כרווח המעגל. להפוך את מרווח טורי המעגל לצורה cuboidal בחותך הטחינה, לחתוך אותו ל 2 פוסטים בראש עם מסור (איור 1B). לשטח בתחתית העמוד הראשי בחותך הטחינה.</li>
	<li>הכנת החיה מהונדס שבו מתבטאת אופסין רגישים לאור סוג של תא עצב מסוים לצורך המחקר. בעבודה זו, נעשה שימוש בעכבר הטרנסגניים (VGAT-ChR2 עכברים) שבו הנוירונים מעכבות אקספרס channelrhodopsin-2 (ChR2)11 .</li>
	<li>עזים ומתנגד החיה עם תערובת של 0.3 מ"ג/ק"ג של medetomidine, 4.0 מ"ג/ק"ג של midazolam ו- 5.0 מ"ג/ק"ג של butorphanol על ידי מינהל בקרום הבטן. כדי לוודא כי החיה. הוא מורדם לחלוטין, בדיקת התגובות שלה אל הזנב צובט.</li>
	<li>הנח את העכבר בתוך מסגרת stereotaxic על כרית החימום. נקי את המסגרת stereotaxic וחימום פאד עם אלכוהול 70% מראש. למקם את השיניים בתוך החור של שורת ביס, והדק בקלילות את המלחציים האף. לתקן את שני צידי הראש באמצעות האוזן ברים. כאשר הראש כראוי קבוע בסורגים האוזן, להדק את המלחציים האף. משחה אופטלמולוגיות חלות על העיניים.</li>
	<li>לגלח את העור ראש עם מספריים קטנות, לנקות את הקרקפת באמצעות מקלון צמר גפן של chlorhexidine gluconate. לפני הניתוח, לעקר את כל שמכשירי הניתוח וראש פוסט עם החיטוי (121 מעלות, 15 דקות).</li>
	<li>לחתוך את הקרקפת לאורך הקו האמצעי עם מספריים ודחף אותו הצידה. לבצע את החתך מהחלק האחורי של הראש לעיניים (כ 20 מ מ). הסרת קרום העצם באמצעות מקלון צמר גפן טבול באלכוהול 70% ויבש את הגולגולת.</li>
	<li>לצרף את ההודעה לראש manipulator. מקם את ההודעה ראש שטוח על הגולגולת סביב bregma באמצעות manipulator.</li>
	<li>מערבבים את מונומר (4 טיפות), זרז (טיפה 1) ופולימר (1 כף קטנה) של מלט שיניים בצלחת קטנה זה הוא מקורר במקרר מראש. לשים את הבטון שיניים (להלן 1 g) על המצח ועל עצם הקודקוד של הגולגולת כדי לתקן את ההודעה לראש בגולגולת.</li>
	<li>לאחר הבטון שיניים נעשה קשה להסיר את העכבר המסגרת stereotaxic. לשים משחה לאנטיביוטיקה על העור החשוף. להזריק את medetomidine אנטגוניסט (0.3 מ"ג/ק"ג), האנטיביוטיקה (oxytetracycline; 20 מ"ג/ק"ג). מקום לנטר את העכבר על משטח חום בתוך כלוב עד התעורר ו להחזיר אותו לכלוב דיור.</li>
	<li>בית החיה בכלוב למגורים נפרדים עם איזה מכשיר העשרה. לשנות את הנייר בעלי חיים מצעים כל יום כדי לשמור על ניקיון הכלוב ולמנוע זיהום. בזהירות לפקח אם החיה מראה סימנים של אי נוחות. להחיל לידוקאין הפצע אם חשוד בשום כאב. מנהל meloxicam או carprofen פעם אחת בכל 24 שעות במשך 48 שעות אחרי שני בראש פוסט ניתוחי התקנה של גולגולת. הלידוקאין המקומי יכול להינתן בנוסף אם NSAID אינה מספיקה.
</li>
</ol>3. להתאקלמות
<ol><li>שני ימים (לפחות) לאחר ההתאוששות מן ההרדמה, להתאקלם החיות למצב שבו הראש-קבוע בבית הבליעה הקלטה. לבצע את ההפעלות להתאקלמות למשך 5 ימים לפחות.</li>
	<li>במהלך המפגשים והפיזיולוגי, להכניס החיה בבית הבליעה הקלטה עם הדואר ראש קבוע כדי מלחציים לפי הזמנה. במהלך ההפעלה, כדי להגביל את התנועה, כיסוי הגוף בעזרת צינור חצי שרף בהזמנה אישית (איור 1C), עשה שימוש במדפסת תלת-ממד. הערה: ביום 1, הפעלת להתאקלמות צריך להיות ארוך 5 דקות. זה ואז גדל מדי יום כדי 10, 20, 40 ו- 60 דקות ימים 2, 3, 4 ו-5, בהתאמה.</li>
	<li>בסוף כל מפגש, תן החיה לפרס של אוכל. אם החיה נאבק באופן רציף במהלך להתאקלמות, להפסיק את ההפעלה.</li>
</ol>4. גולגולת
הערה: לאחר והפיזיולוגי, גולגולת נעשית השתלטה על האזור במוח להקלטה. הניתוח מבוצע במסגרת stereotaxic תחת הרדמה, כמו עם הראש פוסט ההתקנה. ההליך פעולה-מאוחרת זה אותו הדבר כמו הראש פוסט התקנה
<ol><li>לפני הניתוח, ינקה את הגולגולת באמצעות מקלון צמר גפן עם chlorhexidine gluconate ו- 70% אלכוהול.</li>
	<li>בזהירות לגרד את הגולגולת מעל האתר הקלטה עם מקדח שיניים. כאשר העצם הופכת מספיק דק, חותכים את זה עם קצה האזמל ולהסיר אותו.</li>
	<li>לשים מלט שיניים באזור חשוף על מנת לחזק את הגולגולת.</li>
	<li>לכסות את האזור במוח חשוף עם דבק סיליקון לאחר הבטון שיניים נעשה קשה. הנוהל לאחר הניתוח הוא כפי שמתואר בשלב 2.8.</li>
</ol>5. אלקטרופיזיולוגיות הקלטה
<ol><li>לאפשר את החיה להתאושש במשך לפחות יום אחד לאחר הניתוח לפני ביצוע ההקלטה אלקטרופיזיולוגיות. למקם את החיה בבית הבליעה הקלטה באותה דרך שזה נעשה במהלך המפגשים להתאקלמות מתי התחלת הקלטת.</li>
	<li>להפוך פיפטות זכוכית של נימים זכוכית בורוסיליקט (OD = 1.5 מ מ, ID = 0.9 מ מ, 90.0 מ"מ) של פולר אלקטרודה. קוטר עצה שלהם היא 3-2 מיקרומטר, ההתנגדות שלהם הוא 4-6 MΩ כאשר הם מלאים 10 מ ל- PBS. האורך של האלקטרודה הוא 40 – 50 מ מ. בכמה הקלטות, 2% neurobiotin נוסף של 10 מ ל- PBS.</li>
	<li>לצרף את פיפטה מזכוכית מלא בעל optrode בהזמנה אישית.</li>
	<li>מכניסים את החוט כסף Ag-Cl מצופה (0.2 מ"מ קוטר) פיפטה מזכוכית. לחבר את החוט כסף מספר הזיהוי האישי שלך באמצעות חוט חשמל דק מצופה. לחבר את ה-pin headstage של המגבר הקלטה.</li>
	<li>חבר את כבל סיבים אופטיים תיקון (הליבה = 960 מיקרומטר, חיפוי = 1,000 מיקרומטר, NA = 0.63) עם ferrule זרקוניה (OD = 2.5 מ מ) כדי הפיצול ההזדווגות שרוול על בעל optrode. דחוף את תיקון כבל לתוך השרוול עד קצה ferrule הקשר האחורי של פיפטה מזכוכית. תיקון כבל מספק את האור (אורך גל = 465 nm) מ LED. נורית ה-LED נשלטת על ידי נהג LED ערוץ אחד.</li>
	<li>הסר את דבק סיליקון מעל הניתוח. במקום ומחוממת תמיסת מלח (38 ° C) על פני המוח מעת לעת כדי למנוע את פני השטח של המוח ייבוש במהלך להקלטות. במידת הצורך, הסר את השכבה הקשה של המוח עם פינצטה חדה.</li>
	<li>הכנס את אלקטרודת זכוכית רקמת המוח עם תחמן. נטר את ההתנגדות אלקטרודה הוספתו. החלף את האלקטרודה כאשר ההתנגדות היא נמוכים מהמצופה כי קצה האלקטרודה עלולים להינזק. בעומק של עניין, חיפוש ולבודד את הקוצים יחידה על-ידי התאמת העומק בשלבים 2-5 מיקרומטר.</li>
	<li>לאחר היחידה מבודדת, לספק נורית ה-LED ולבחון את התגובה לגירויים קלים.</li>
	<li>להקליט את פעילות עצבית לאחר הזיהוי של סוגי תאים. לבצע ההקלטות עבור 2-3 h. אם ההקלטה מתבצעת על ימים רצופים (מקסימום של 2 ימים), לכסות את הניתוח עם דבק סיליקון. בעת ההקלטה הסתיימה, החיה הוא הקריב, לאחזר את ההודעה לראש ושם אותו בתוך אצטון לשטוף ולהשתמש מחדש זה.</li>
</ol>

<ol><li>Rajasethupathy, P., Ferenczi, E., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Targeting neural circuits.</a> Cell. 165 (3), 524-534 (2016).</li>
<li>Gore, F., Schwartz, E. C., Salzman, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulating+neural+activity+in+physiologically+classified+neurons%3A+triumphs+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+B%2C+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Manipulating neural activity in physiologically classified neurons: triumphs and challenges.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 370 (1677), 20140216(2015).</li>
<li>Ono, M., Bishop, D. C., Oliver, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identified+GABAergic+and+glutamatergic+neurons+in+the+mouse+inferior+colliculus+share+similar+response+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Identified GABAergic and glutamatergic neurons in the mouse inferior colliculus share similar response properties.</a> Journal of Neuroscience. 37 (37), 8952-8964 (2017).</li>
<li>Ono, M., Bishop, D. C., Oliver, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lasting+sound-evoked+afterdischarge+in+the+auditory+midbrain%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Long-lasting sound-evoked afterdischarge in the auditory midbrain.</a> Scientific Reports. 6, 20757(2016).</li>
<li>Munoz, W., Tremblay, R., Rudy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-assisted+patching%3A+in+vivo+recording+of+genetically+and+morphologically+identified+neurons+throughout+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-assisted patching: in vivo recording of genetically and morphologically identified neurons throughout the brain.</a> Cell Reports. 9 (6), 2304-2316 (2014).</li>
<li>Lima, S. Q., Hromadka, T., Znamenskiy, P., Zador, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINP%3A+a+new+method+of+tagging+neuronal+populations+for+identification+during+in+vivo+electrophysiological+recording%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">PINP: a new method of tagging neuronal populations for identification during in vivo electrophysiological recording.</a> PLoS One. 4 (7), e6099(2009).</li>
<li>Kuwada, S., Batra, R., Stanford, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monaural+and+binaural+response+properties+of+neurons+in+the+inferior+colliculus+of+the+rabbit%3A+effects+of+sodium+pentobarbital%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Monaural and binaural response properties of neurons in the inferior colliculus of the rabbit: effects of sodium pentobarbital.</a> Journal of Neurophysiology. 61 (2), 269-282 (1989).</li>
<li>Populin, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anesthetics+change+the+excitation%2Finhibition+balance+that+governs+sensory+processing+in+the+cat+superior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Anesthetics change the excitation/inhibition balance that governs sensory processing in the cat superior colliculus.</a> Journal of Neuroscience. 25 (25), 5903-5914 (2005).</li>
<li>Duque, D., Malmierca, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulus-specific+adaptation+in+the+inferior+colliculus+of+the+mouse%3A+anesthesia+and+spontaneous+activity+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Structure+and+Function%22%5BJournal%5D)">Stimulus-specific adaptation in the inferior colliculus of the mouse: anesthesia and spontaneous activity effects.</a> Brain Structure and Function. 220 (6), 3385-3398 (2015).</li>
<li>Cai, R., Richardson, B. D., Caspary, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+to+predictable+versus+random+temporally+complex+stimuli+from+single+units+in+auditory+thalamus%3A+impact+of+aging+and+anesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Responses to predictable versus random temporally complex stimuli from single units in auditory thalamus: impact of aging and anesthesia.</a> Journal of Neuroscience. 36 (41), 10696-10706 (2016).</li>
<li>Zhao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+channelrhodopsin-2+transgenic+mice+for+optogenetic+dissection+of+neural+circuitry+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function.</a> Nature Methods. 8 (9), 745-752 (2011).</li>
<li>Ito, T., Bishop, D. C., Oliver, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+classes+of+GABAergic+neurons+in+the+inferior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Two classes of GABAergic neurons in the inferior colliculus.</a> Journal of Neuroscience. 29 (44), 13860-13869 (2009).</li>
<li>Ono, M., Yanagawa, Y., Koyano, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAergic+neurons+in+inferior+colliculus+of+the+GAD67-GFP+knock-in+mouse%3A+electrophysiological+and+morphological+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">GABAergic neurons in inferior colliculus of the GAD67-GFP knock-in mouse: electrophysiological and morphological properties.</a> Neuroscience Research. 51 (4), 475-492 (2005).</li>
<li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+using+Thy1-GCaMP+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity using Thy1-GCaMP transgenic mice.</a> Neuron. 76 (2), 297-308 (2012).</li>
<li>Hirai, Y., Nishino, E., Ohmori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+recording+of+fluorescence+and+electrical+signals+by+photometric+patch+electrode+in+deep+brain+regions+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Simultaneous recording of fluorescence and electrical signals by photometric patch electrode in deep brain regions in vivo.</a> Journal of Neurophysiology. 113 (10), 3930-3942 (2015).</li>
<li>LeChasseur, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microprobe+for+parallel+optical+and+electrical+recordings+from+single+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A microprobe for parallel optical and electrical recordings from single neurons in vivo.</a> Nature Methods. 8 (4), 319-325 (2011).</li>
<li>Abaya, T. V., Blair, S., Tathireddy, P., Rieth, L., Solzbacher, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+glass+optrode+array+for+optical+neural+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">A 3D glass optrode array for optical neural stimulation.</a> Biomedical Optics Express. 3 (12), 3087-3104 (2012).</li>
<li>Bittner, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conjunctive+input+processing+drives+feature+selectivity+in+hippocampal+CA1+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Conjunctive input processing drives feature selectivity in hippocampal CA1 neurons.</a> Nature Neuroscience. 18 (8), 1133-1142 (2015).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

Optogenetics הפך להיות כלי רב עוצמה במדעי המוח. היא ניצלה זיהוי נוירון מסוים סוגי ויוו , כמו גם מניפולציה הפעילות של מסלולים עצביים מסוימים. ההבהרה של הפעילות העצבית של סוגים עצביים שונים מקדם את ההבנה של המנגנון של מעגלים עצביים. כאן, אנחנו הפגינו שיטה להעברת האור לאתר הקלטה דרך אלקטרודת זכוכית ב IC של עכברים VGAT-ChR2 ער.
ישנם מספר שלבים קריטיים השיטה המתוארת. ראשית, זו דרישה לשימוש בבעלי חיים עם ביטוי מספיק וספציפיות של opsins של הנוירונים היעד. כדי לזהות את התגובות אור עם הקלטות ח...

מערכת העצבים המרכזית מורכבת מסוגים שונים של נוירונים, אשר יש פונקציות שונות. איך עובדים אלה סוגים שונים של נוירונים בתוך המעגל העצבי הוא אחד החששות העיקריים במדעי המוח. עם זאת, באזורים במוח רבים, עבר בלתי. אפשרי להבחין את סוגי עצביים ויוו בהקלטות של פעילויות חשמל כי אין הבדל ברור בתוך האות החשמלי ספייק עצמו, עם מספר חריגים. התפתחויות אחרונות optogenetics הפכו את פריצת הדרך1,2. באמצעות בעלי חיים מהונדס שבו רגישים לאור אופסין (למשל, channelrhodopsin-2) מתבטא בסוגי עצביים מסוימים, ניתן היה להבחין את סוגי עצביים יעיל בויוו הקלטות3, 45,,6. החיות הללו, הנוירונים עם רגישים לאור אופסין שמחים על ידי מתן גירויים קלים במהלך הקלטות חשמל, אך נוירונים אחרים אינם. הנוירונים אופסין-חיוביים, ולכן בקלות נבדלים סוגים אחרים נוירון על ידי תשובותיהן לאור.
בניסויים optogenetics, חיוני כדי לספק את האור אל אתר הקלטה. כמו שיטה לא פולשנית, האור מכוונת בדרך כלל מפני השטח של המוח. עם זאת, כי כוחו של האור מפחית כמו זה עובר דרך רקמת המוח, קשה לעורר את האזורים מוחי עמוק ממשטח של המוח. במיוחד, קשה לאור גירוי להגיע אל האזורים מוחי עמוק כאשר שקיפות אופטית של המשטח המוח נמוך, כפי שקורה לעיתים קרובות עם הקלטות חיות ער. ניסויים אלקטרופיזיולוגיות לעיתים קרובות בוצעו על חיות מורדם בגלל תנועת הגוף גורם רעש בהקלטות. כפי מתועד היטב, עם זאת, הרדמה ידוע כדי לשנות את תגובות עצביות7,8,9,10. לפיכך, יש צורך להשתמש בבעלי חיים ער ללימוד תגובות עצביות ללא השפעת הרדמה מלאכותי. בניגוד הניסויים בחיות מרדימים, ההקלטות אלקטרופיזיולוגיות מבוצעות לאחר ההחלמה מניתוח בניסויים בחיות ער. במהלך מרווח בין הניתוח ובין ההקלטות, תפליט רקמת לעיתים קרובות מצטבר על פני המוח והופכת את שקיפות אופטית של המשטח המוח נמוך.
כאן, אנו מתארים שיטה כדי להקליט הקלטות יחיד-יחידה העכבר ער באמצעות optrode של זכוכית בהזמנה אישית. בשיטה זו, האור מועברת באמצעות אלקטרודת זכוכית ההקלטה כך ניתן לעורר בצורה אמינה נוירון שהוקלט עם אור באזורים עמוקים במוח. מערכת optrode לפי הזמנה זו כוללת חומרים נגיש וזול והוא קל להרכיב.

<table><tbody><tr><td>מחזיק אלקטרודה</td><td>מכשיר מולקולרי</td><td>1-HL-U</td><td>מחזיק פיפטה למגבר מיקרואלקטרודה</td></tr><tr><td>שרוול הזדווגות מפוצל קרמי</td><td>Thorlabs</td><td>ADAF1</td><td>f2.5 מ"מ טבעת</td></tr><tr><td>מעגלים מרווח</td><td>Teishin Denki</td><td>SPA-320</td><td>f8.0 מ"מ, אורך 20.0 מ"מ</td></tr><tr><td>מסגרת סטריאוטקסית לעכברים</td><td>Narishige</td><td>SR-6M-HT</td><td>מכשירים סטריאוטקסיים לעכברים</td></tr><tr><td>מניפולטור</td><td>Narishige</td><td>NA</td><td>מניפולטור ידני</td></tr><tr><td>Superbond</td><td>Sun Medical</td><td>M: 204610557</td><td>צמנט שרף דבק דנטלי</td></tr><tr><td>Form2</td><td>Formlabs</td><td>NA</td><td>מדפסת תלת מימד</td></tr><tr><td>Kwik-Sil</td><td>WPI</td><td>KWIK-SIL</td><td>דבק סיליקון בעל רעילות נמוכה</td></tr><tr><td>נימי זכוכית בורוסיליקט</td><td>Narishige</td><td>GD-1.5</td><td>OD 1.5 מ"מ, ID 0.9 מ"מ, אורך 90.0 מ"מ</td></tr><tr><td>כבל תיקון סיבים אופטיים</td><td>עדשות דוריות</td><td>MFP_960/1000/2200-0.63_1m_FCM-ZF2.5</td><td>כבל תיקון מונופיבראופטי, OD, 2.5 מ"מ, ליבה = 960 מ"מ, חיפוי = 1000 מ"מ, NA = 0.63</td></tr><tr><td>עדשות LED דוריות</td><td>מחוברות</td><td>LEDC-1B_FC</td><td>אורך גל מרכזי = 465 ננומטר, הספק פלט = 45 mW (ליבה 960 מ"מ 0.63 NA)</td></tr> <tr><td>דרייבר LED</td><td>עדשות דוריות</td><td>LEDRV_1CH_1000</td><td>דרייבר LED 1 ערוצים, תפוקה מקסימלית = 1000 mA</td></tr><tr><td>מושך אלקטרודות</td><td>Narishige</td><td>PB-7</td><td>דו-שלבי זכוכית micropipette חולץ</td></tr><tr><td>בורוסיליקט זכוכית נימי</td><td>Narishige</td><td>GD-1.5</td><td>נימי זכוכית בולוסיליקט, OD, 1.5 מ"מ, ID, 0.9 מ"מ, 90.0 מ"מ אורך</td></tr><tr><td>GENTACIN</td><td>MSD CO., Ltd</td><td>185711173</td><td>משחה אנטיביוטית</td></tr><tr><td>Terramycin&reg;-LA</td><td>Zoetis</td><td>G 333</td><td>Oxytetracycline</td></tr><tr><td>Tg(Slc32a1- COP4*H134R/EYFP)8Gfng/J</td><td>Jackson Labs</td><td>#14548</td><td>עכברי VGAT-ChR2</td></tr><tr><td>Multiclamp 700B</td><td>התקנים מולקולריים</td><td>2500-0157</td><td>מגבר מיקרואלקטרודה</td></tr></tbody></table>

optogenetics זיהוי של סוג עצביים עם optrode זכוכית בעכברים ער

Optogenetics Identification of a Neuronal Type with a Glass Optrode in Awake Mice

זה הדאגה העיקרית במדעי המוח שונה סוגי נוירונים עובדים את המעגלים העצביים. התפתחויות אחרונות optogenetics אפשרו את הזיהוי של הסוג עצביים בניסויים ויוו אלקטרופיזיולוגיות באזורים במוח רחבה. בניסויים optogenetics, חיוני כדי לספק את האור אל אתר הקלטה. עם זאת, קשה לעתים קרובות לספק את האור גירוי לאזורים מוחי עמוק ממשטח של המוח. במיוחד, קשה לאור גירוי להגיע אל האזורים מוחי עמוק כאשר שקיפות אופטית של המשטח המוח נמוך, כפי שקורה לעיתים קרובות עם הקלטות חיות ער. כאן, אנו מתארים שיטה כדי להקליט את ספייק אל האור של תגובות העכבר ער באמצעות optrode של זכוכית בהזמנה אישית. בשיטה זו, האור מועברת באמצעות אלקטרודת זכוכית ההקלטה כך ניתן לעורר בצורה אמינה נוירון שהוקלט עם אור באזורים מוחי עמוק. מערכת optrode לפי הזמנה זו כוללת חומרים נגיש וזול והוא קל להרכיב.

איור 2, בדקנו את ההשפעות של גודל הטיפ ואורך פיפטות זכוכית על כוח האור בקצה מדי סוכר (איור 2 א-ב'). אור החשמל נמדדה על ידי מד הכוח האופטי להציב 1 מ"מ מן הקצה. אורך מלא הוגדר 50 ± 2 מ מ כאשר גודל קצה מגוונים, ואילו גודל קצה הוגדר 2.5 מיקרומטר כאשר אורך מלא מגוונות. הדוקרן של פיפטה מזכוכית הוגדר 8 מ מ. הכוח אור בקצה נע בין 3-5 מגוואט (זאת אומרת ± SD; איור 2A: 3.77 ± 0.29 mW, n ...

עבודה זו מציגה שיטה לבצע optogenetic יחיד-יחידת הקלטה אמינה מכל עכבר ער באמצעות optrode של זכוכית בהזמנה אישית.

Optogenetics זיהוי של סוג עצביים עם Optrode זכוכית בעכברים ער

It is a major concern in neuroscience how different types of neurons work in neural circuits. Recent advances in optogenetics have enabled the ...

שיטה זו יכולה לסייע לענות על שאלות מפתח בתחום מדעי המוח, כמו למשל התפקודים של סוגים שונים של נוירונים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת לזהות באופן אמין את סוגי הנוירונים השונים in vivo עם חומרים זולים ונגישים. אני אדגים את ההליך יחד עם שינג'י מורמוטו, הטכנאי שלנו, ולאנלן מא, עוזר הפרופסור שלנו מהמעבדה שלנו.כדי להתחיל בהליך זה, משוך בעדינות את צינור הפלדה לבקרת לחץ מהקנה של המחזיק. הרחב את החור של צד מושב הסיכה בקנה של המחזיק על ידי קידוח. לאחר מכן, הניחו צינור נירוסטה בחור.לאחר מכן, הכנס לתוך החור שרוול הזדווגות מפוצל קרמי לקוטר 2.5 מילימטר. צרו חור בארנב בצורת L והצמידו את הקנה של מחזיק האלקטרודה לארנב בעזרת דבק אפוקסי. לאחר מכן, חבר אותו למניפולטור עם ברגים.הכן עמוד ראש שנבנה בהתאמה אישית על ידי הפיכת מרווח המעגל העמודי לצורה קובואידית עם חותך כרסום, וחתוך אותו לשני עמודי ראש בעזרת מסור. לאחר מכן, משטחים את החלק התחתון של עמוד הראש בעזרת חותך כרסום. לפני הניתוח יש לחטא את כל מכשירי הניתוח ועמוד ראש עם חיטוי.נקה את המסגרת הסטריאוטקסית ואת כרית החימום עם 70 אחוז אלכוהול. לאחר מכן, הרדמו את העכבר והניחו אותו במסגרת הסטריאוטקסית על כרית חימום. בניסוי זה נעשה שימוש בעכבר טרנסגני בו נעשה שימוש בנוירונים המעכבים המבטאים channelrhodopsin-II.הנח את השיניים בחור של מוט הנשיכה והדק קלות את האף clamp. לאחר מכן, תקן את שני צידי הראש באמצעות מוטות אוזניים. כאשר הראש מקובע כהלכה על ידי מוטות האוזניים, הדק את האף clamp.מרחו משחה עיניים על העיניים. חתוך את השיער מעל הראש עם מספריים קטנים ונקה את הקרקפת בעזרת צמר גפן של כלורהקסידין גלוקונאט. לאחר מכן, חותכים את הקרקפת לאורך קו האמצע ודוחפים אותה הצידה.הסר את הפריאוסטאום בעזרת צמר גפן טבול ב -70 אחוז אלכוהול ותן לגולגולת להתייבש. לאחר מכן, חבר את עמוד הראש למניפולטור. מקם את מוט הראש שטוח על הגולגולת סביב הברגמה באמצעות המניפולטור.מערבבים ארבע טיפות מהמונומר, טיפה אחת של זרז וכף קטנה אחת של פולימר על צלחת קטנה שצוננת במקרר. מרחו מלט דנטלי על העצם הקדמית והקודקודית וקבעו את עמוד הראש לגולגולת. לאחר שהמלט הדנטלי התקשה, הסר את העכבר מהמסגרת הסטריאוטקסית.מרחו משחה אנטיביוטית על העור החשוף והזריקו קוקטייל של אנטגוניסט ואנטיביוטיקה של מדטומידין. לאחר מכן, הניחו את העכבר על כרית החום בכלוב עד שהוא מתעורר והחזירו אותו לכלוב דיור עם העשרה. כדי לבצע קרניוטומיה על אזור מוח היעד לצורך רישום, נקו את הגולגולת בעזרת צמר גפן ספוג בכלורהקסידין גלוקונאט ו-70 אחוז אלכוהול.מגרדים בזהירות את הגולגולת מעל אתר ההקלטה בעזרת מקדחה דנטלית. כשהעצם דקה מספיק, חותכים אותה בקצה האזמל ומסירים אותה. לאחר מכן מרחו מלט דנטלי סביב האזור החשוף על מנת לחזק את הגולגולת.כסו את אזור המוח החשוף בדבק סיליקון לאחר שהמלט הדנטלי התקשה. לאחר מכן, הניחו את החיה על כרית החום בכלוב עד שהיא מתעוררת, והחזירו אותה לכלוב דיור. אפשר לבעל החיים להתאושש לפחות יום אחד לאחר כריתת הגולגולת, לפני ביצוע הרישום האלקטרופיזיולוגי.לפני ביצוע ההקלטה האלקטרופיזיולוגית, הכינו כמה פיפטות זכוכית מנימי זכוכית בורוסיליקט באמצעות מושך אלקטרודות. מלאו את הפיפטות ב -10 מילימולר PBS. בחלק מההקלטות, שני אחוזים נוירוביוטין מתווספים ל-PBS של 10 מילי-מולאר.לאחר מכן, הנח את החיה בתא ההקלטה. חבר פיפטה מזכוכית מלאה למחזיק האופטרוד בהתאמה אישית. הכנס חוט מצופה כלוריד כסף לתוך פיפטת הזכוכית.לאחר מכן, חבר את הסיכה לראש stage של מגבר ההקלטה. לאחר מכן, חבר את כבל תיקון הסיבים האופטיים עם טבעת זירקוניה לשרוול ההזדווגות המפוצל על מחזיק האופטרודה. דחף את כבל התיקון לתוך השרוול עד שקצה הטבעת יוצר קשר עם החלק האחורי של פיפטת הזכוכית.כבל התיקון מספק את האור מ-LED, הנשלט על ידי דרייבר LED חד-ערוצי. לאחר מכן, הסר את דבק הסיליקון מעל הגולגולת. מרחו מי מלח חמים על פני המוח מעת לעת כדי למנוע התייבשות של פני המוח במהלך ההקלטה.במידת הצורך, הסר את הדורה בעזרת פינצטה חדה. כאן, תגובות הספייק תועדו בקוליקולוס התחתון של עכברי VGAT channelrhodopsin-II ערים. בקוליקולוס התחתון של עכברי VGAT channelrhodopsin-II, נוירוני GABAergic מבטאים באופן ספציפי channelrhodopsin-II.בעכברים ערים, גם הנוירונים GABAergic וגם הנוירונים הגלוטמטרגיים התרגשו או דוכאו בהתאמה כאשר ניתנו להם גירויים קלים. כאשר גירוי האור מועבר דרך אלקטרודת הזכוכית, הוא מעורר תגובות ספייק בחלק מהנוירונים. לעומת זאת, בתאי עצב אחרים, גירוי האור דיכא את תגובות הספייק שעוררו גירויי קול.תוצאות אלה מראות כי אופטרוד זכוכית יכול לתעד את פעילות היחידה הבודדת המבודדת היטב ולעורר באופן אמין את הנוירונים המוקלטים על ידי אור. לאחר הפיתוח, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום מדעי המוח לחקור כיצד סוגים שונים של נוירונים פועלים בשקע העצבי של אזורי מוח שונים.

optogenetics-identification-neuronal-type-with-glass-optrode-awake

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

מאמר זה מתאר את ההקלטה של ​​תאים בודדים מאוכלוסיות העצבית מתויג fluorescently ברשתית עכבר ללא פגע. באמצעות שני הפוטונים עירור בתאי אינפרא אדום שכותרתו transgenetically היו מטרה הקלטה תיקון-clamp ללמוד לאור התגובות שלהם, מאפייני שדה פתוח, ומורפולוגיה.

אפיון אלקטרו של ה-GFP, הבעת אוכלוסיות תאים ברשתית אינטקט

מקור: Kodani, S., et.al. מניפולציה אופטוגנטית של מעגלים עצביים במהלך ניטור מצבי שינה/ערות בעכברים. J. Vis. Exp. (2019)סרטון זה מדגים את המניפולציה האופטוגנטית של מעגלים עצביים המעורבים במעבר משינה לערות בעכברים. ההליך כולל השתלה כירורגית של סיב אופטי ואלקטרודות במוח ובשרירים כדי לאפשר גירוי אור ורישום אלקטרופיזיולוגי. על ידי אספקת אור להפעלת תעלות קטיון רגישות לאור בגרעין המיטה של הסטריה טרמינליס (BNST), הפעילות העצבית מווסתת, ומאפשרת לחוקרים לנתח אותות מוחיים ושרירים הקשורים לאינדוקציה של ערות.

מניפולציה אופטוגנטית של מעגלים עצביים למעבר משינה לערות בעכברים

סרטון זה מדגים את רישום הפעילות העצבית של המוח דרך חלון אופטי בעכברים טרנסגניים. העכברים מבטאים חלבון פלואורסצנטי המאפשר זיהוי פעילויות עצביות. חלק קטן מהגולגולת מוסר בזהירות כדי להתקין חלון אופטי, ולאחר מכן הגולגולת מכוסה במלט שחור כדי לחסום אור לפני ההדמיה.

התקנת חלונות אופטיים במוחם של עכברים טרנסגניים כדי לדמות פעילויות עצביות

מקור: Laboissonniere, et. al. רצף RNA של תא בודד של תת-קבוצות מוגדרות של תאי גנגליון ברשתית. J. Vis. exp.{{}} (2017).  }סרטון זה מדגים טכניקת מעקב פלואורסצנטית לזיהוי תת-סוגים של תאי גנגליון ברשתית (RGC) ברשתית של עכבר טרנסגני. התהליך כולל אבטחת הרשתית המבודדת בתא הקלטה, שמירה על כדאיות התא עם זלוף מחומצן, והתמקדות ב-RGCs עם תווית פלואורסצנטית באמצעות פיפטה עם עוקב. על ידי ניתוח מורפולוגיה וריבוד דנדריטי, השיטה מאפשרת סיווג של תת-סוגים מובהקים של RGC.

זיהוי תת-סוגים של תאי גנגליון ברשתית עכבר באמצעות מעקב פלואורסצנטי

אנו מתארים שיטה לאפיון הטופוגרפיה התפקודית והתכונות הסינפטיות של מעגלי המוח הקדמי באמצעות גישה אופטוגנטית לגירוי אוכלוסיות עצביות במבחנה.

Photostimulation לייזר לסריקת של מעגלים מוח קדמי ממוקדים Optogenetically

אופטוגנטיקה הפכה לכלי רב עוצמה לשימוש בניסויים במדעי המוח ההתנהגותיים. פרוטוקול זה מציע מדריך שלב אחר שלב לתכנון והקמה של מערכות לייזר, ומספק פרוטוקול מלא לביצוע גירויים אופטוגנטיים מרובים ובו זמנית התואמים לרוב פרדיגמות הבדיקות ההתנהגותיות של מכרסמים.

בoptogenetic גירוי vivo של מערכת העצבים המרכזית מכרסם

כאן אנו מתארים את האסטרטגיה שלנו להשגת הקלטות יציבות ומבודדות היטב של יחידה אחת מאינטרנוירונים מעכבים שזוהו בקליפת המוח של העכבר המורדם. תאי עצב המבטאים ChR2 מזוהים על ידי תגובתם לאור כחול. השיטה משתמשת בציוד הקלטה חוץ-תאי סטנדרטי, ומשמשת כחלופה זולה להדמיית סידן או תיקון מונחה חזותית.

מדריך ל בשנת vivo הקלטה חד-יחידה מקליפת המוח המעכבת interneurons המזוהות Optogenetically

כאן, אנו מתארים שיטות של מניפולציה אלקטרואופטיקה של סוגים מסוימים של נוירונים במהלך ניטור של שינה/ערנות מדינות בעכברים, הצגת העבודה האחרונה שלנו על גרעין המיטה של מסוף הניסטריה כדוגמה.

מניפולציה אלקטרואופטיקה של מעגלים עצביים בזמן ניטור שינה/ערות מדינות עכברים

עם מניפולציה אופטוגנטית של אוכלוסיות עצביות ספציפיות או אזורים במוח, התנהגות ניתן לשנות עם רזולוציה זמנית ומרחבית גבוהה בבעלי חיים נעים בחופשיות. באמצעות כלים אופטוגנטיים שונים בשילוב עם סיבים אופטיים מושתלים כרונית, ניתן לבצע מגוון של אפנון עצבי ובדיקות התנהגותיות.

מניפולציה אופטוגנטית של פעילות עצבית לווסת את ההתנהגות בעכברים נעים בחופשיות

כאן אנו מציגים את שיטת הייצור של מערכת אופטרודה עם סיבים אופטיים להעברת אור ומערך אלקטרודות להקלטה עצבית. ניסויי In vivo עם עכברים מהונדסים המבטאים את channelrhodopsin-2 מראים את ההיתכנות של המערכת לגירוי אופטוגנטי סימולטני ורישום אלקטרופיזיולוגי.

מערך Optrode לאפנון אופטוגנטי סימולטני והקלטה עצבית חשמלית

למדו שיטת אופטוגנטיקה לזיהוי סוגי נוירונים בעכברים ערים באמצעות אופטרוד זכוכית מותאם אישית. טכניקה זו מאפשרת הקלטת פעילות יחידתית מבודדת היטב ומספקת כלים לחקר תפקודי נוירונים שונים במוח החי.

Optogenetics זיהוי של סוג עצביים עם Optrode זכוכית בעכברים ער

גלה סרטונים נוספים