Name: אינדוקציה ואימות של הזדקנות ביולוגית הסלולר העיקרי בתאי אדם (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-20T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: למדו אינדוקציה ואימות של הזדקנות תאית בתרביות תאי פיברובלסטים אנושיים. שיטות אלו מאפשרות הערכת תסמיני זיקנה ותרומה למחקר ביולוגיית הזדקנות וסרטן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים חברי המעבדה Demaria דיונים פוריים, ואת Thijmen van Vliet לשיתוף נתונים, פרוטוקול על הזדקנות ביולוגית UV-induced.

<ol><li>Hayflick, L., Moorhead, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+serial+cultivation+of+human+diploid+cell+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">The serial cultivation of human diploid cell strains.</a> Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).</li>
<li>Muñoz-Espín, D., Serrano, M. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/nrm3823">Cellular senescence: from physiology to pathology. Nature reviews.</a> Molecular cell biology. 15, 482-496 (2014).</li>
<li>Sharpless, N. E., Sherr, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forging+a+signature+of+in+vivo+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Forging a signature of in vivo senescence.</a> Nature Reviews Cancer. 15 (7), 397-408 (2015).</li>
<li>Correia-Melo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+are+required+for+pro-ageing+features+of+the+senescent+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Mitochondria are required for pro-ageing features of the senescent phenotype.</a> The EMBO Journal. 10, e201592862(2016).</li>
<li>Loaiza, N., Demaria, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+senescence+and+tumor+promotion%3A+Is+aging+the+key%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Reviews+on+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cellular senescence and tumor promotion: Is aging the key?</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Cancer. , (2016).</li>
<li>Coppe, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-associated+secretory+phenotypes+reveal+cell-nonautonomous+functions+of+oncogenic+RAS+and+the+p53+tumor+suppressor%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor.</a> PLoS Biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).</li>
<li>Baker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+occurring+p16%28Ink4a%29-positive+cells+shorten+healthy+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Naturally occurring p16(Ink4a)-positive cells shorten healthy lifespan.</a> Nature. 530 (7589), 184-189 (2016).</li>
<li>Xu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+senescent+cells+enhances+adipogenesis+and+metabolic+function+in+old+age%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Targeting senescent cells enhances adipogenesis and metabolic function in old age.</a> Elife. 4, e12997(2015).</li>
<li>Baker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+p16Ink4a-positive+senescent+cells+delays+ageing-associated+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders.</a> Nature. 479 (7372), 232-236 (2011).</li>
<li>Jeon, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+clearance+of+senescent+cells+attenuates+the+development+of+post-traumatic+osteoarthritis+and+creates+a+pro-regenerative+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Local clearance of senescent cells attenuates the development of post-traumatic osteoarthritis and creates a pro-regenerative environment.</a> Nature Medicine. 23 (6), 775-781 (2017).</li>
<li>Demaria, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+Senescence+Promotes+Adverse+Effects+of+Chemotherapy+and+Cancer+Relapse%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Cellular Senescence Promotes Adverse Effects of Chemotherapy and Cancer Relapse.</a> Cancer Discovery. 7 (2), 165-176 (2017).</li>
<li>Chang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+senescent+cells+by+ABT263+rejuvenates+aged+hematopoietic+stem+cells+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Clearance of senescent cells by ABT263 rejuvenates aged hematopoietic stem cells in mice.</a> Nature Medicine. 22 (1), 78-83 (2016).</li>
<li>Soto-Gamez, A., Demaria, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+interventions+for+aging%3A+the+case+of+cellular+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%22%5BJournal%5D)">Therapeutic interventions for aging: the case of cellular senescence.</a> Drug Discov Today. 22 (5), 786-795 (2017).</li>
<li>Childs, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescent+cells%3A+an+emerging+target+for+diseases+of+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Senescent cells: an emerging target for diseases of ageing.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16 (10), 718-735 (2017).</li>
<li>Marthandan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+genes+and+pathways+in+primary+human+fibroblast+strains+undergoing+replicative+and+radiation+induced+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Research%22%5BJournal%5D)">Conserved genes and pathways in primary human fibroblast strains undergoing replicative and radiation induced senescence.</a> Biological Research. 49, 34(2016).</li>
<li>Marthandan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+Senescence+Associated+Genes+and+Pathways+in+Primary+Human+Fibroblasts+Detected+by+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Conserved Senescence Associated Genes and Pathways in Primary Human Fibroblasts Detected by RNA-Seq.</a> PLoS One. 11 (5), e0154531(2016).</li>
<li>Hernandez-Segura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unmasking+Transcriptional+Heterogeneity+in+Senescent+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Unmasking Transcriptional Heterogeneity in Senescent Cells.</a> Current Biology. 27 (17), 2652-2660 (2017).</li>
<li>Le, O. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionizing+radiation-induced+long-term+expression+of+senescence+markers+in+mice+is+independent+of+p53+and+immune+status%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Ionizing radiation-induced long-term expression of senescence markers in mice is independent of p53 and immune status.</a> Aging Cell. 9 (3), 398-409 (2010).</li>
<li>Hall, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C%2FEBPalpha+regulates+CRL4%28Cdt2%29-mediated+degradation+of+p21+in+response+to+UVB-induced+DNA+damage+to+control+the+G1%2FS+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">C/EBPalpha regulates CRL4(Cdt2)-mediated degradation of p21 in response to UVB-induced DNA damage to control the G1/S checkpoint.</a> Cell Cycle. 13 (22), 3602-3610 (2014).</li>
<li>Nitiss, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+DNA+topoisomerase+II+in+cancer+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Targeting DNA topoisomerase II in cancer chemotherapy.</a> Nature Reviews Cancer. 9 (5), 338-350 (2009).</li>
<li>Pazolli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+remodeling+underlies+the+senescence-+associated+secretory+phenotype+of+tumor+stromal+fibroblasts+that+supports+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Chromatin remodeling underlies the senescence- associated secretory phenotype of tumor stromal fibroblasts that supports cancer progression.</a> Cancer Research. 72, 2251-2261 (2012).</li>
<li>Venturelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+induction+of+apoptosis+and+senescence+by+the+DNA+methyltransferase+inhibitors+5-azacytidine+and+5-aza-2%27-deoxycytidine+in+solid+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Differential induction of apoptosis and senescence by the DNA methyltransferase inhibitors 5-azacytidine and 5-aza-2'-deoxycytidine in solid tumor cells.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 12, 2226-2236 (2013).</li>
<li>Tennant, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+Trypan+Blue+Technique+for+Determination+of+Cell+Viability%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the Trypan Blue Technique for Determination of Cell Viability.</a> Transplantation. 2, 685-694 (1964).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li>
<li>Lee, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-associated+%CE%B2-galactosidase+is+lysosomal+%CE%B2-galactosidase%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Senescence-associated β-galactosidase is lysosomal β-galactosidase.</a> Aging Cell. 5, 187-195 (2006).</li>
<li>Kopp, H. G., Hooper, A. T., Shmelkov, S. V., Rafii, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-galactosidase+staining+on+bone+marrow.+The+osteoclast+pitfall%5BTitle%5D)+AND+%22Histology+and+Histopathology%22%5BJournal%5D)">Beta-galactosidase staining on bone marrow. The osteoclast pitfall.</a> Histology and Histopathology. 22 (9), 971-976 (2007).</li>
<li>Dimri, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biomarker+that+identifies+senescent+human+cells+in+culture+and+in+aging+skin+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (20), 9363-9367 (1995).</li>
<li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (7), 2415-2420 (2008).</li>
<li>Sherr, C. J., McCormick, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RB+and+p53+pathways+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">The RB and p53 pathways in cancer.</a> Cancer Cell. 2 (2), 103-112 (2002).</li>
<li>Bunz, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+p53+and+p21+to+sustain+G2+arrest+after+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Requirement for p53 and p21 to sustain G2 arrest after DNA damage.</a> Science. 282 (5393), 1497-1501 (1998).</li>
<li>Severino, J., Allen, R. G., Balin, S., Balin, A., Cristofalo, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+beta-galactosidase+staining+a+marker+of+senescence+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Is beta-galactosidase staining a marker of senescence in vitro and in vivo.</a> Experimental Cell Research. 257 (1), 162-171 (2000).</li>
<li>Stolzing, A., Coleman, N., Scutt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose-induced+replicative+senescence+in+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Rejuvenation+Research%22%5BJournal%5D)">Glucose-induced replicative senescence in mesenchymal stem cells.</a> Rejuvenation Research. 9 (1), 31-35 (2006).</li>
<li>Blazer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+glucose-induced+replicative+senescence%3A+point+of+no+return+and+effect+of+telomerase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">High glucose-induced replicative senescence: point of no return and effect of telomerase.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 296 (1), 93-101 (2002).</li>
<li>Wiley, C. D., Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+Ancient+Pathways+to+Aging+Cells-Connecting+Metabolism+and+Cellular+Senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">From Ancient Pathways to Aging Cells-Connecting Metabolism and Cellular Senescence.</a> Cell Metabolism. 23 (6), 1013-1021 (2016).</li>
<li>Kumar, R., Gont, A., Perkins, T. J., Hanson, J. E. L., Lorimer, I. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+senescence+in+primary+glioblastoma+cells+by+serum+and+TGFbeta%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Induction of senescence in primary glioblastoma cells by serum and TGFbeta.</a> Scientific Reports. 7 (1), 2156(2017).</li>
<li>Hypoxia Blagosklonny, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MTOR+and+autophagy%3A+converging+on+senescence+or+quiescence%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">MTOR and autophagy: converging on senescence or quiescence.</a> Autophagy. 9 (2), 260-262 (2013).</li>
<li>Meuter, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Markers+of+cellular+senescence+are+elevated+in+murine+blastocysts+cultured+in+vitro%3A+molecular+consequences+of+culture+in+atmospheric+oxygen%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Assisted+Reproduction+and+Genetics%22%5BJournal%5D)">Markers of cellular senescence are elevated in murine blastocysts cultured in vitro: molecular consequences of culture in atmospheric oxygen.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 31 (10), 1259-1267 (2014).</li>
<li>Coppe, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human-like+senescence-associated+secretory+phenotype+is+conserved+in+mouse+cells+dependent+on+physiological+oxygen%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A human-like senescence-associated secretory phenotype is conserved in mouse cells dependent on physiological oxygen.</a> PLoS One. 5 (2), e9188(2010).</li>
<li>van Deursen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+senescent+cells+in+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The role of senescent cells in ageing.</a> Nature. 509 (7501), 439-446 (2014).</li>
<li>Kim, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implications+of+time-series+gene+expression+profiles+of+replicative+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Implications of time-series gene expression profiles of replicative senescence.</a> Aging Cell. 12, 622-634 (2013).</li>
</ol>

הפרוטוקולים המוסברת אופטימציה להצגה fibroblasts העיקרי אנושית, במיוחד BJ ותאי WI-38. הפרוטוקולים עבור הזדקנות ביולוגית replicative, קרינה מייננת, דוקסורוביצין, הוחלו בהצלחה על סוגים אחרים של fibroblasts (HCA2 ו- IMR90), סוגי תאים אחרים (כלומר neonatal מלנוציטים ו keratinocytes או cardiomyocytes נגזר iPSC) במעבדה שלנו. עם זאת, ניתן למטב עיבודים סוגי תאים נוספים על-ידי התאמת כמה פרטים כגון מספר תאים הזריעה, שיטות כימיקלים כדי לסייע תאים עבור חיבור/ניתוק כדי תומך פלסטיק, את המינון של הטיפול כדי למנוע רעילות.
<p class="j...

ב-1961, Hayflick ולמורהד דיווחו כי ראשי fibroblasts בתרבות לאבד את הפוטנציאל המקדימות שלהם לאחר מעברים רצופים1. תהליך זה נגרמת על ידי לקיצור רציפים של טלומרים לאחר כל חלוקת התא. כאשר טלומרים מגיעים באורך ביקורתי קצר, הם מזוהים התגובה נזק לדנ א (DDR) שמפעיל מעצר בלתי הפיך של התפשטות — כהגדרתו גם הזדקנות ביולוגית replicative. הזדקנות ביולוגית replicative נחשב כיום לאחד גירויים רבים ידועים כדי לגרום למצב של קבע מחזור מעצר התא שמעבדת תאים חסרי רגישות mitogens וגם אפופטוטיים להיפגע אותות2,3. התוכנית הזדקנות ביולוגית מאופיין בדרך כלל על-ידי תכונות נוספות כולל פעילות lysosomal גבוהה, תפקוד מיטוכונדריאלי, שינויים גרעינית, rearrangements כרומטין, רשתית תוך-פלזמית מתח, נזק לדנ א, הזדקנות ביולוגית-הקשורים הפרשה פנוטיפ (SASP)3,4. תאים senescent יש תפקידים רבים בגוף: פיתוח, פצע ריפוי ו הגידול דיכוי2. באותה מידה, הם ידועים לשחק תפקיד חשוב הזדקנות ו, באופן פרדוקסלי, ב התקדמות הגידול5. לעיתים קרובות מיוחסות השפעות שליליות, סותרים באופן חלקי, הזדקנות ביולוגית SASP6.
. לאחרונה, זה הוצג כי חיסול של תאים senescent מן העכברים מוביל להארכת תוחלת החיים וכדי חיסול של רבים של הזדקנות תכונות7,8,9,10,11, 12. באותה דרך, בסמים מרובים פותחו לחסל גם את תאי senescent (senolytics) או למקד SASP13,14. הפוטנציאל הטיפולי של אנטי אייג'ינג משכה לאחרונה יותר תשומת לב השדה.
חקר מנגנוני משויך הזדקנות ביולוגית הסלולר, ההקרנות עבור התערבויות תרופתי בכבדות להסתמך על דגמי ex-vivo , במיוחד על אנושי fibroblasts העיקרי. אמנם יש כמה תכונות נפוצות מופעל על ידי inducers הזדקנות ביולוגית מגוונים, השתנות גדולה בפנוטיפ הזדקנות ביולוגית היא נצפתה ותלויים בגורמים שונים, כולל תא סוג, גירוי וזמן נקודה3,15, 16,17. זה הכרחי כדי לשקול את הטרוגניות עבור הלומדים והיעדים תאים senescent. לכן, פרוטוקול זה שואפת לספק סדרה של שיטות השתמשו כדי לגרום הזדקנות ביולוגית ב fibroblasts הראשי באמצעות טיפולים שונים. כמו זה תהיה מנומקת, השיטות בקלות ניתן להתאים סוגי תאים אחרים.
מלבד הזדקנות ביולוגית replicative, נתאר חמישה טיפולים בתדר הזדקנות ביולוגית אחרים: מייננת קרינה, קרינה אולטרה סגולה (UV), דוקסורוביצין, סטרס חמצוני, שינויים epigenetic (כלומר קידום של היסטון acetylation או דנ א demethylation) . גם, קרינה מייננת וגם קרינת UV לגרום נזק לדנ א ישיר ויפעיל, במינון המתאים, הזדקנות ביולוגית18,19. דוקסורוביצין גם גורם הזדקנות ביולוגית בעיקר באמצעות נזק לדנ א מאת intercalating לתוך ה-DNA, שיבוש טופואיזומראז II פונקציה, ובכך עצירת DNA תיקון מנגנונים20. הביטוי של גנים חיוניים עבור הזדקנות ביולוגית נשלטת בדרך כלל על-ידי acetylation היסטון מתילציה DNA. כתוצאה מכך, מעכבי deacetylase היסטון (למשל, butyrate נתרן, סאהה) וסוכני דנ א demethylating (למשל, 5-עזה) לעורר הזדקנות ביולוגית תאים נורמליים אחרת21,22.
בסופו של דבר, ארבעה סמנים הנפוצים ביותר קשורים לתאים senescent תהיה מנומקת: הפעילות של הזדקנות ביולוגית הקשורים-β-galactosidase (SA-β-גל), שיעור לסינתזת DNA על ידי עידו התאגדות assay, ביטוי של הרגולטורים מחזור התא, p16 מעכבי קינאז תלוי-cyclin p21, ואת ביטוי, הפרשת חברי SASP.

<table><tbody><tr><td>מדיה DMEM - GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>31966-047</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>היקלון</td><td>SV30160.03</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין (P/S; 10,000 יחידות יחידה/מ"ל)</td><td>Lonza</td><td>DE17-602E</td><td></td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SC-202581</td><td></td></tr><tr><td>מים ללא נוקלאז'ים (לא מטופלים ב-DEPC)</td><td>אמביון</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>בקבוק T75</td><td>Sarstedt</td><td>833911002</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA Solution</td><td>Lonza</td><td>CC-5012</td><td></td></tr><tr><td>PBS טבליות</td><td>Gibco</td><td>18912-014</td><td></td></tr><tr><td>צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9661-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>Corning&nbsp; צינורות צנטריפוגה 15 מ"ל</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>CLS430791</td><td></td></tr><tr><td>צלחת 6 בארות</td><td>Sarstedt</td><td>83.3920</td><td></td></tr><tr><td>צלחת 24 בארות</td><td>Sarstedt</td><td>83.3922</td><td></td></tr><tr><td>13 מ"מ כיסויים עגולים</td><td>Sarstedt</td><td>83.1840.002</td><td></td></tr><tr><td>Steriflip</td><td>Merck Chemicals</td><td>SCGP00525</td><td></td></tr><tr><td>Cesium137-source</td><td></td><td></td><td>IBL 637 Cesium-137&gamma;-ray</td></tr><tr>מכונת <td></td><td></td><td>תא קרינת UV</td><td>Opsytec, Dr. G&ouml; bel BS-02</td></tr><tr><td>דוקסורוביצין דיהידרוכלוריד&nbsp;</td><td>BioAustralis Fine Chemicals</td><td>BIA-D1202-1</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מי חמצן</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7722-84-1</td><td></td></tr><tr><td>5-aza-2'-deoxycytidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3656</td><td></td></tr><tr><td>SAHA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0061</td><td></td></tr><tr><td>נתרן בוטיראט&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5887</td><td></td></tr><tr><td>X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-&beta;-D-galactopyranoside)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>7240-90-6</td><td></td></tr><tr><td>חומצת לימון מונוהידראט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5949-29-1</td><td></td></tr><tr><td>נתרן דו-בסיסי פוספט</td><td>Acros אורגני</td><td>7782-85-6</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן פרוציאניד&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>14459-95-1</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן פריציאניד</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>13746-66-2</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>Merck Millipore</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד</td><td>פישר כימיקלים</td><td>7791-18-6</td><td></td></tr><tr><td>25% גלוטראלדהיד</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>111-30-8,7732-18-5</td><td></td></tr><tr><td>16% פורמלדהיד (w/v)</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine)</td><td>Lumiprobe</td><td>10540</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-Cyanine3 azide (Sulfo-Cy3-Azide)</td><td>Lumiprobe</td><td>D1330</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אסקורבט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A4034</td><td></td></tr><tr><td>נחושת (II) סולפט פנטהידראט (Cu(II)SO4.5H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>209198</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Acros אורגני</td><td>215682500</td><td></td></tr><tr><td>בסיס TRIS</td><td>Roche</td><td>11814273001</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 Multiwell Plate 384, לבן&nbsp;</td><td>Roche</td><td>4729749001</td><td></td></tr><tr><td>Lightcycler 480 רדיד איטום&nbsp;</td><td>ערכת Roche</td><td>4729757001</td><td></td></tr><tr><td>Sensifast Probe Lo-ROX&nbsp;</td><td>Bioline</td><td>BIO-84020</td><td></td></tr><tr><td>UPL ספריית בדיקה</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>שונים אנושיים IL-6 DuoSet ELISA</td><td>R& D</td><td>D6050</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad TC20</td><td>Bio-Rad</td> Counting Slides Bio-Rad <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>145-0017</td><td></td></tr><tr><td>חממה יבשה</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>Heratherm</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylformamide</td><td>Merck Millipore</td><td>1.10983</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm 'M' סרט מעבדה</td><td>Bemis&nbsp;</td><td></td><td></td>#PM992</tr><tr><td>מחטי</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>פינצטה</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

אינדוקציה ואימות של הזדקנות ביולוגית הסלולר העיקרי בתאי אדם

Induction and Validation of Cellular Senescence in Primary Human Cells

הזדקנות ביולוגית הסלולר היא מצב של מחזור התא קבוע מעצר מופעלת בתגובה לגירויים מזיקים שונים. הפעלה של הזדקנות ביולוגית הסלולר מהווה סימן היכר של תנאים pathophysiological שונים, כולל הגידול דיכוי, רקמות שיפוץ והתיישנות. Inducers של הזדקנות ביולוגית הסלולר ויוו מאופיינים עדיין לקוי. עם זאת, מספר של גירויים יכול לשמש כדי לקדם את הזדקנות ביולוגית הסלולר ex-vivo. ביניהם, הזדקנות ביולוגית-inducers הנפוצים ביותר הם תשישות replicative, מייננת ולא מייננת, genotoxic סמים, סטרס חמצוני, demethylating, acetylating סוכנים. כאן, אנו נספק הוראות מפורטות על איך להשתמש גירוי לזירוז fibroblasts לתוך הזדקנות ביולוגית. פרוטוקול זה בקלות ניתן להתאים עבור סוגים שונים של תאים ראשי שורות תאים, כולל תאים סרטניים. אנו מתארים גם שיטות שונות עבור האימות של הזדקנות ביולוגית אינדוקציה. בפרט, אנו מתמקדים מדידת הפעילות של האנזים lysosomal הזדקנות ביולוגית-הקשורים β-galactosidase (SA-β-גל), הקצב לסינתזת DNA באמצעות 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (אדו) התאגדות assay, רמות הביטוי של מחזור התא p16 מעכבי p21, ואת הביטוי ואת הפרשת חברים פנוטיפ הפרשה Senescence-Associated (SASP). לבסוף, אנו מספקים תוצאות דוגמה, לדון בהמשך יישומים של פרוטוקולים אלה.

העשרה של SA-β-גל מכתים ב senescent fibroblasts
Β-galactosidase (β-גל) הוא אנזים lysosomal זה מתבטא כל התאים וזה של ה-pH האופטימלי של25,4.026. עם זאת, במהלך הזדקנות ביולוגית, lysosomes להגביר את גודל ולצבור, כתוצאה מכך, תאי senescent β-גל. הכמויות מוגברת של אנזים זה מאפשרים לזהות את פעילותה אפילו ב- 6.025,pH שיוצרת27...

כאן, אנו נדון סדרה של פרוטוקולים עבור אינדוקציה ואימות של הזדקנות ביולוגית התאית בתאים בתרבית. אנחנו מתמקדים גירויים שונים בתדר הזדקנות ביולוגית. ומתארות כימות של סמנים משותפים הקשורים הזדקנות ביולוגית. אנו מספקים פרטים טכניים באמצעות fibroblasts כמודל, אך ניתן להתאים את הפרוטוקולים השונים דגמי הסלולר.

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום ההזדקנות והסרטן, כגון כיצד לבצע טכניקות נפוצות לגרימת הזדקנות תאית וכיצד להעריך את פנוטיפ ההזדקנות. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שהיא קלה לביצוע, ניתנת לשחזור רב, אינה דורשת ציוד מיוחד או יקר, והיא מביאה לזירוז הזדקנות אצל לפחות 50% מאוכלוסיית התאים. תדגים את ההליך הזה אלחנדרה הרננדז-סגורה, סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלנו.כדי להתחיל, זרע שבע פעמים 10 עד החמישי פיברובלסטים ראשוניים ברי קיימא עם הכפלת אוכלוסייה נמוכה או PD בבקבוק T75 המכיל 10 מיליליטר D10. דגרו את התאים בחממת תרבית תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני ו-5% חמצן למשך הלילה. יש לדלל 11 מיקרוליטר מתמיסת מלאי הדוקסורוביצין 1,000X ב-11 מיליליטר של D10 לריכוז סופי של 250 ננו-מולר.לאחר מכן שאפו את המדיום מהתאים והחליפו אותו ב -10 מיליליטר D10 בתוספת דוקסורוביצין. דגרו את התאים בחממת תרבית תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני ו-5% חמצן למשך 24 שעות בדיוק. לאחר מכן שאפו את המדיום והשתמשו ב -10 מיליליטר D10 כדי לשטוף בזהירות את התאים פעם אחת.דגרו על התאים ב-10 מיליליטר D10 למשך שישה ימים נוספים, והחליפו את המדיום באופן קבוע בערך כל שלושה ימים. כדי לבצע צביעת בטא-גלקטוזידאז, עבור כל זרע דגימה אחד כפול 10 עד הרביעי תאים בבאר אחת לפחות של צלחת של 24 בארות המכילה 500 מיקרוליטר של D10 כך שהתאים דלילים. דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני ו-5% חמצן למשך הלילה.למחרת, השתמש ב -500 מיקרוליטר PBS כדי לשטוף את התאים פעמיים. לאחר מכן הוסיפו 500 מיקרוליטר לבאר של 2% פורמלדהיד בתוספת 0.2% גלוטרלדהיד ב-PBS ודגרו על התאים בטמפרטורת החדר למשך שלוש עד חמש דקות כדי לתקן אותם. לאחר מכן השתמש ב -500 מיקרוליטר של PBS כדי לשטוף את התאים פעמיים.לאחר מכן, לאחר הכנת תמיסת צביעה טרייה, הוסיפו 500 מיקרוליטר לבאר והשתמשו בפרפילם כדי לאטום את הצלחת כדי למנוע אידוי שעלול לגרום להיווצרות גבישים. דגרו את התאים בחושך בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור יבש ללא פחמן דו חמצני למשך 12 עד 16 שעות. לאחר מכן השתמש ב -500 מיקרוליטר של PBS כדי לשטוף את התאים פעמיים.בדוק את התאים תחת מיקרוסקופ אור רגיל כדי להעריך את התוצאות היכן יופיעו תאים חיוביים עם צביעה פרה-גרעינית כחולה. כדי להקל על הדמיה וכימות של תאים בודדים, השתמש ב-DAPI ככתם נגד. לאחר מכן, באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, קבע את אחוז התאים החיוביים לעומת המספר הכולל של תאים המצלמים מספר תמונות של אותה דגימה כדי להעריך לפחות 100 תאים בודדים.עבור כל דגימה או מצב, הנח כיסוי אחד לכל באר בצלחת של 24 בארות. זרע פעם אחת 10 לתאים הרביעיים עם 500 מיקרוליטר של D10 לבאר כך שהתאים דלילים. דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני ו-5% חמצן למשך הלילה.הכינו מספיק מתמיסת EdU של 20 מיקרו-מולרית ו-D10 כך שכל דגימה תקבל 250 מיקרוליטר. הסר מחצית מהמדיום מכל באר מטופלת והחלף אותו בתמיסת EdU D10. ריכוז ה-EdU הסופי הוא 10 מיקרומולר.דגרו את הדגימות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני ו-5% חמצן למשך 18 עד 24 שעות. השתמש באותו זמן דגירה עבור תאי בקרה ותאי הזדקנות. לאחר הדגירה, השתמש ב -500 מיקרוליטר PBS כדי לשטוף את התאים פעמיים.לאחר מכן הוסף 500 מיקרוליטר של 4% פורמלדהיד ב- PBS ודגר את התאים למשך 10 דקות כדי לתקן אותם. לאחר הקיבוע, הוסף 500 מיקרוליטר של 100 מילי-מולרי Tris pH 7.6 לדגימות ודגר אותן למשך חמש דקות. לאחר מכן, הוסף לתאים 500 מיקרוליטר של 0.1% Triton X-100 ב-PBS וחלחל אותם למשך 10 דקות.לאחר מכן השתמש ב-PBS כדי לשטוף את הדגימות שלוש פעמים. הכן 50 מיקרוליטר של תערובת תוויות לכל כיסוי, הוסף את הרכיבים בסדר הבא, 44.45 מיקרוליטר PBS, 0.5 מיקרוליטר נחושת (II) סולפט, 0.05 מיקרוליטר סולפו-cy3-אזיד וחמישה מיקרוליטר נתרן אסקורבט. פיפטה 50 מיקרוליטר של התווית מערבבים על פיסת פרפילם.לאחר מכן בעזרת פינצטה ומחט, הרם את הכיסוי והנח אותו עם צד התא כלפי מטה על גבי תערובת התוויות. ודא שאין בועות ושכל פני השטח של הכיסוי נוגעים בתערובת התווית. דגרו את הדגימה בחושך למשך 30 דקות.החזירו את התאים לבארות של צלחת 24 הבארות והשתמשו ב-PBS כדי לשטוף אותם שלוש פעמים. לאחר מכן השתמש במדיום הרכבה עם DAPI כדי להרכיב את הדגימות ולתת להן להתייבש למשך הלילה. כדי להתחיל, זרע שבע פעמים 10 לחמישי פיברובלסטים ראשוניים ברי קיימא עם הכפלת אוכלוסייה נמוכה או.תמונה של לפחות 100 תאים לכל תנאי. לבסוף, כמת את אחוז התאים ששילבו את EdU באמצעות הנוסחה הבאה. לבצע מחקרי ביטוי גנים וחלבונים על פי פרוטוקול הטקסט.מוצגות כאן תמונות מייצגות של צביעת SA-beta-gal בפיברובלסטים ראשוניים מתרבים לעומת מזדקנים. תאים מזדקנים נראים מוגדלים בתוך גוף תא רגיל. כאמור, זה יכול להיות קשה להבחין בין תאים בודדים.לכן, צביעה משותפת עם DAPI מקלה על הדמיה וספירת תאים. בניסוי זה, נעשה שימוש ב-suflo-cy3-azide לביצוע תוספת ציקלו-אזיד אזיד-אלקין מזורזת נחושת לאוכלוסייה. אם הצימוד של האזיד לאלקין התרחש, התאים יציגו פלואורסצנטיות תחת מסנן cy3 המבדיל בין תאים מתרבים לתאים שאינם מתרבים.לאחר שליטה, טכניקה זו יכולה להיעשות תוך 36 שעות אם היא מבוצעת כראוי. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להיות מהירים ככל האפשר בזמן הטיפול בתאים מחוץ לאינקובטור מכיוון שתנודות בריכוז החמצן עלולות להשפיע על תוצאותיהם. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו מערך ציטוקינים או כתם מערבי על מנת לענות על שאלות נוספות כמו רמות החלבונים המופרשים או הבנת מסלולי איתות ספציפיים.לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום ההזדקנות והסרטן לחקור כיצד תאים מזדקנים מעורבים במצבים פיזיולוגיים ופתולוגיים ביונקים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לגרום לשחזור הזדקנות בתאים ראשוניים וכיצד להעריך את מצב ההזדקנות שלהם.

induction-and-validation-of-cellular-senescence-in-primary-human-cells

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

אם מונעת הזדקנות או מקדמת tumorigenesis נותר שנוי במחלוקת. מאז תרופות chemotherapeutical יכולות לגרום לתאים סרטניים להזדקן, לומד הזדקנות הוא חיוני למציעים טיפולים חדשים. עם זאת, assay β-גלקטוזידאז הסטנדרטי ומשמש באופן נרחב מציג חסרונות עיקריים. אנו מציעים כאן assay מבוסס זרימת cytometry מהירה ורגיש לכמת הזדקנות.

שיטה רגישה לכמת תאי סרטן senescent

הזדקנות תאית, המדינה ההפיכה של מעצר מחזור התא, יכולה להיגרם על ידי מדגיש הסלולר שונה. כאן, אנו מתארים פרוטוקולים לגרום הזדקנות תאית שיטות להערכת סמנים של הזדקנות.

טכניקות כדי להשרות ולכמת סלולר הזדקנות

כאן אנו מציגים פרוטוקול מפורט כדי לזהות את שניהם senescent, גזע pluripotent בשריר השלד על פגיעה תוך גרימת ויוו התכנות. שיטה זו מתאימה להעריך את התפקיד של הזדקנות ביולוגית הסלולר במהלך התחדשות רקמות, התכנות ויוו.

הערכה של פציעה-induced הזדקנות ביולוגית, In Vivo התכנות בשריר השלד

ROS תאיים הוכח לשחק תפקיד חשוב אינדוקציה של הזדקנות ביולוגית הסלולר. כאן, אנו מתארים וזמינותו רגיש לכימות תנועת ROS רמות במהלך הזדקנות ביולוגית הסלולר. אנו מספקים גם פרוטוקולים להערכת את הזדקנות ביולוגית-הקשורים הפרשה פנוטיפ, אשר תורמת הדיווחים תפקוד שונות הקשורות לגיל.

מדידה כמותית של מינים חמצן תגובתי, הזדקנות ביולוגית-הקשורים פנוטיפ הפרשה ב Fibroblasts אנושי נורמלי במהלך אונקוגן-induced הזדקנות ביולוגית

הזדקנות תאית היא הגורם העיקרי בפיתוח של הפתווגיות הקשורות לגיל כרונית. זיהוי של הtherapeutics שתאי היעד מציגים הבטחה להרחבת הזדקנות בריאה. כאן, אנו מציגים את הבקשה הרומן על המסך לזיהוי של senotherapeutics מבוסס על מדידה של פעילות ביולוגית β-גלטוסידאז הקשורים בתאים בודדים.

א-β-גלטוסידאז-מבוסס על הקרנת ההקרנה לזיהוי תרופות הסאותרפיה

אימונופלואורסצנציה מרובה מאפשרת תיוג רציף של מספר סמני נוגדנים בתוך חתך רקמה אחד כדי לתמוך בניתוח מרחבי של ארכיטקטורת הרקמה ואוכלוסיות התאים. כאן מוצגת זרימת עבודה לזיהוי מולטיפלקס של סמנים מבניים וחיסוניים הקשורים להזדקנות, הכוללת הכנת שקופיות ידנית ואוטומטית, הדמיה איטרטיבית וניתוח תאים בודדים באמצעות תוכנת פתולוגיה דיגיטלית.

מבחן אימונופלואורסצנציה מרובה לצורך הערכה מרחבית של סמני הזדקנות ב-vivo

פרוטוקול זה מציג מיקרוסקופיה קונפוקלית מוחזרת באור לזיהוי אובייקטיבי של פעילות בטא-גלקטוזידאז (SA-β-gal) הקשורה להזדקנות בחלק הווסקולרי סטרומלי שבודד מרקמת שומן אנושית. השיטה תואמת לאימונוציטוכימיה, משלבת בקרות pH להערכה כמותית, ומספקת גם חלופה רגישה ופחות סובייקטיבית לצביעת SA-β-gal המסורתית.

זיהוי הזדקנות באמצעות אור מוחזר בחלק הווסקולרי סטרומלי שומני

פרוטוקול סטנדרטי להשראת הזדקנות מוקדמת ב-HNM באמצעות tBHP, פרוטוקולים סטנדרטיים לניתוח סמנים מרכזיים של הזדקנות, כולל עצירת גדילה, פעילות SA-β-גלקטוזידאז וגורמי SASP.

פרוטוקול סטנדרטי להשראת הזדקנות מוקדמת הנגרמת מלחץ במלנוציטים ראשוניים בבני אדם באמצעות טרט-בוטיל הידרופרוקסיד

מאמר זה מציג פרוטוקול LysoTracker של תאים חיים למדידת שיקום ליזוזומי במהלך הזדקנות בפיברובלסטים אנושיים מסוג IMR-90.

פרופילינג ליזוזומי באמצעות LysoTracker להערכה כמותית של הזדקנות תאית בפיברובלסטים אנושיים

שיטה זו חוקרת כיצד פיברובלסטים של עור מזדקנים משפיעים על הבריאים. הזדקנות מושרה מחשיפה ל-UVB, והמדיום המותאם מיושם על פיברובלסטים רגילים. היא מסייעת להעריך תרכובות ביואקטיביות המיועדות לשינוי בתקשורת תא לתא בהזדקנות העור.

שילוב חדש של נוגדי חמצון לשיקום תקשורת בין-תאית בריאה במודל חוץ גופי באמצעות מדיום מותנה מתאים זקנים

למדו אינדוקציה ואימות של הזדקנות תאית בתרביות תאי פיברובלסטים אנושיים. שיטות אלו מאפשרות הערכת תסמיני זיקנה ותרומה למחקר ביולוגיית הזדקנות וסרטן.

אינדוקציה ואימות של הזדקנות ביולוגית הסלולר העיקרי בתאי אדם

גלה סרטונים נוספים