ממברנה שיפוץ של שלפוחית ענקית בתגובה מעברי צבע יון סידן לשפות אחרות
16 ביולי 2018
אנו מציגים טכניקה עבור המיקרומניפולציה ללא מגע של שלפוחית, באמצעות מעברי צבע יון סידן לשפות אחרות. Microinjection של פתרון יון סידן, באזור שלפוחית השומנים ענק, מנוצל כדי לשפץ ממברנה השומנים, וכתוצאה מכך הייצור של בליטות צינורי ממברנה.
אנו מציגים טכניקה למניפולציה של שלפוחיות ענק באמצעות שיפועי יוני סידן מקומיים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא גירוי ללא מגע לחלוטין של פני השלפוחית והדמיה ישירה של עיצוב מחדש של קרום השומנים באינטראקציה עם יוני סידן. הגישה שלנו מציגה אמצעי להתייחס לפרטים של אינטראקציות ממברנת יוני סידן, ומספקת דרכים חדשות לחקור את המנגנונים של קרום התא המעצב מחדש עם שינויים במיקרו-סביבת התא.
כדי להתחיל בהליך זה, הכינו תמיסה של שומנים בכלורופורם. הריכוז הסופי של שומנים בכלורופורם הוא מיליגרם אחד למיליליטר, והמסה הסופית היא 0.6 מיליגרם. עטפו את בקבוקון הזכוכית המכיל את תערובת השומנים בנייר כסף כדי להגן על התכולה מפני אור הסביבה.
הנח את בקבוקון הדגימה העטוף בנייר כסף בתוך זכוכית. כדי להסיר את הכלורופורם, אידוי הממס במאייד סיבובי למשך שלוש שעות כשהלחץ מגיע לשבעה קילופסקל ואקום ב-80 סל"ד. סרט שומנים יבש נוצר בתחתית בקבוקון הזכוכית לאחר האידוי.
הוסף לאט 600 מיקרוליטר של תמיסת מלח חוצצת פוספט על גבי סרט השומנים המיובש. לאחר הוספת המאגר, הוסף בעדינות שישה מיקרוליטרים של גליצרול כדי להגן על הדגימה מפני התייבשות מוחלטת במהלך היווצרות שלפוחית חד-שכמתית ענקית המחוברת לשלפוחית רב-שכבתית, או GUV-MLV. אטום את בקבוקון הזכוכית באמצעות Parafilm.
ומכסים בנייר כסף להגנה מפני אור הסביבה. אחסן את הבקבוקון בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת, סוניקציה של בקבוקון הזכוכית המכיל את התמיסה למשך דקה אחת באמצעות אמבט אולטרה-סוניקציה בטמפרטורת החדר.
הסר את הפרפילם, ופיפטה עד שנוצרת תמיסה אחידה מבחינה ויזואלית של שלפוחיות שומנים קטנות. יש לשים 30 מיקרוליטר מתמיסת שלפוחית השומן הקטנה שהתקבלה לצינורות פלסטיק בודדים של 0.5 מיליליטר. הפשירו צינור פלסטיק המכיל כמות של תרחיף קפוא של שלפוחיות שומן קטנות בטמפרטורת החדר.
מערבולת את הצינור ארבע פעמים למשך שנייה עד שתיים באמצעות מערבל מערבולת במהירות מרבית. הנח חמישה מיקרוליטר של מתלה שלפוחית השומן הקטן על פני החלקה של כיסוי זכוכית ליצירת טיפה קטנה ועגולה. השתמש בכיסוי זכוכית ללא שלבי ניקוי מוקדם.
כעת, הנח את כיסוי הזכוכית במייבש ואקום למשך 20 דקות. אחסן את סרט השומנים המיובש בטמפרטורת החדר למשך ארבע דקות. לאחר מכן, פיפטה איטית של 50 מיקרוליטר של 10 מילי-מולרי HEPES על גבי שכבת השומנים היבשה להחזרת נוזלים.
המתן חמש דקות כדי ליצור את מתחמי GUV-MLV. מרכז כיסוי זכוכית על במת המיקרוסקופ. לאחר מכן, פיפטה 300 מיקרוליטר של חוצץ HEPES עליה ומקם את מרכז הטיפה מעל המטרה.
העבר את 50 המיקרוליטר של תמיסת GUV-MLV מוכנה מראש לתמיסת HEPES. המתן 25 דקות כדי לאפשר למתחמי GUV-MLV שנוצרו בדלילות להיצמד היטב למשטח כיסוי הזכוכית. עגול את הקצוות של נימי זכוכית הבורוסיליקט על ידי הנחת קצוות הנימים בעדינות לתוך להבת הנר כדי למנוע את שבירת המיקרופיפטה תוך הצמדתה למחזיק המיקרופיפטה.
משוך לפחות שלושה נימי זכוכית באמצעות מושך לייזר אוטומטי. השתמש בנימי זכוכית הבורוסיליקט המוזכרים בטקסט כדי להשיג מיקרופיפטה עם פתח קצה בקוטר של כ-0.3 מיקרון. כדי למנוע סתימת קצה הפיפטה, סנן תמיסת סידן כלוריד של חמישה מילי-מולרית בתמיסת חיץ HEPES באמצעות מסנן מזרק של 0.2 עד 0.5 מיקרון לפני השימוש.
לאחר מכן, מלאו מחדש כל מיקרופיפטה בשמונה מיקרוליטרים של תמיסת הסידן הכלורי באמצעות מיקרו-מעמיס. חבר מחזיק מיקרופיפטה למיקרומניפולטור. התקן את המיקרופיפטה לתוך מחזיק המיקרופיפטה בחוזקה.
לאחר מכן חבר את משאבת ההזרקה ומחזיק הנימים באמצעות צינור האספקה. לאחר הפעלת משאבת ההזרקה, התאם את ההגדרות במשאבת ההזרקה ללחץ הזרקה של 20 הקטופסקאל. הגדר גם לחץ פיצוי של חמישה הקטופסקאל.
הגדר את המיקרוסקופ למצב שדה בהיר. הגדר אותו לניגודיות הפרעות דיפרנציאליות. השתמש במיקרומניפולטור הגס כדי למקם את המיקרו-פיפטה מעל הטיפה המכילה את קומפלקסי GUV-MLV.
אתר את קצה המיקרופיפטה מעל המטרה והורד את הפיפטה אל הטיפה באמצעות המיקרומניפולטור הגס. הגדר את המיקרוסקופ למצב פלואורסצנטי. מקם את קצה המיקרופיפטה במרחק של שלושה מיקרון משטח הממברנה תוך הזרקת תמיסת הסידן כלורי מהמיקרופיפטה כדי לאפשר היווצרות MTPs.
כדי לתרגם את ה-MTPS לאורך משטח ה-GUV, הזז לאט את קצה הפיפטה סביב משטח ה-GUV באמצעות המיקרומניפולטור העדין. שמור על אותו מרחק בערך בין משטח ה-GUV לקצה המיקרו-פיפטה תוך המשך הזרקת יוני הסידן. כדי לעצור את המיקרו-הזרקה, כבה את משאבת ההזרקה.
תמונת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מייצגת של קומפלקס GUV-MLV המשותק על פני כיסוי זכוכית מוצגת כאן. ניתן לראות בתמונות אלה את הבליטות הצינוריות של הממברנה שנוצרו עם הזרקה מקומית של יוני סידן על פני השטח של ה-GUV. תרגום של קצה המיקרופיפטה סביב פני הממברנה כפי שמצוין על ידי החץ מפעיל תנועה של בליטות צינוריות הממברנה לכיוון מקור יוני הסידן.
לסיכום, אנו מציעים טכניקה המאפשרת שיפוץ ממברנה ללא מגע של שלפוחיות שומנים ענקיות שהביאה להיווצרות בליטות צינוריות ממברנה עם גירוי מקומי עם יוני סידן. יישומים עתידיים של שיטה זו כוללים מעבר משלפוחיות שומן סינתטיות לממברנות ביולוגיות מקומיות או יישום גישה זו על מערכות פולימריות במטרה לפתח פלטפורמות מיקרומניפולציה ללא מגע.
סקירה כללית
מחקר זה מציג טכניקה ללא מגע למיקרו-מניפולציה של וזיקולות ליפידיות ענקיות באמצעות מדרגי ריכוז מקומיים של יוני סידן. השיטה מאפשרת ויזואליזציה ישירה של עיצוב מחדש של ממברנת הליפידים, המובילה להיווצרותם של בליטות טובולריות בממברנה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביופיזיקה
- ביולוגיה של התא
רקע
- שלפוחיות יחיד-שכבתיות ענקיות (GUVs) הן מודלים חשובים לחקר ממברנות של תאים.
- ליוני סידן תפקיד מכריע בדינמיקה ובשינוי מבנה של ממברנות.
- טכניקות מניפולציה ללא מגע יכולות לשפר את הדיוק הניסויי.
- הבנת אינטראקציות של ממברנות יכולה להשפיח על הבנת תהליכים תאיים.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה למניפולציה ללא מגע של וסיקולות.
- חקירת ההשפעות של מדרגי יוני סידן מקומיים על ממברנות ליפידיות.
- אספקת תובנות לגבי מנגנוני עיצוב מחדש של ממברנות.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- הכנת תמיסות ליפידים ויצירת קומפלקסים של GUV-MLV.
- שימוש במיקרופיפטים להזרקה מקומית של יוני סידן.
- מיקרוסקופיה פלואורסצנטית להדמיית שינויים בממברנה.
- בקרת פרמטרי ההזרקה להבטחת מניפולציה יעילה.
תוצאות עיקריות
- הזרקה מקומית של יוני סידן השריעה בהצלחה בליטות טובולריות של הממברנה.
- הטכניקה הדגימה מניפולציה אפקטיבית ללא מגע של וסיקולות.
- דימוי פלואורסצנטי חשף שינויים דינמיים במורפולוגיה של הממברנה.
- התוצאות מרמזות על יישומים פוטנציאליים בחקר ממברנות ביולוגיות.
מסקנות
- הטכניקה המוצעת מאפשרת גישות חדשניות למחקרי ממברנות.
- יישומים עתידיים עשויים להתרחב לממברנות ביולוגיות טבעיות ולמערכות פולימריות.
- שיטה זו פותחת נתיבים חדשים למחקר בדינמיקה של ממברנת התא.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
טכניקה זו לעיצוב מחדש של ממברנות ללא מגע מאפשרת חקירה מדויקת של דינמיקת ליפידים המתווכת על ידי יוני סידן, מנגנון מפתח בתעבורת ממברנות ובאפופטוזיס הרלוונטי להסרת סיכונים מטרות (target de-risking). על ידי אספקת מערכת ביומימטית לבידוד השפעות מפל הסידן על מורפולוגיית הממברנה, היא תומכת בהבנה מנגנונית של אינטראקציות ליפיד-חלבון במסלולי מחלה. הגישה מציעה פלטפורמה ניתנת להרחבה ולשחזור לבחינת ביופיזיקה של ממברנות בשלבים מוקדמים של הגילוי, ובכך מסייעת בתכנון בדיקות ובמידול חזוי של השפעות תרכובות על שלמות הממברנה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של עיצוב מחדש של ממברנות התלוי בסידן כקריאה פונקציונלית לאישור מטרות במסלולי אותיות.
- ערך תפעולי: מספק מערכת נשלטת וללא מגע לבידוד השפעות של יוני סידן ללא מורכבות תאית, ובכך מפחית משתנים מתבלבלים במחקרים מכניסטיים.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- ערך מדעי: יוצר היווצרות מדידה של בליטות טובולריות בממברנה כפלט של בדיקה מבוססת דימוי דינמי לסריקת תרכובות.
- ערך תפעולי: משתמש בקומפלקסי GUV-MLV סטנדרטיים ובמיקרוסקופיה פלואורסצנטית לקבלת תוצאות הניתנות לשחזור ולהרחבה על פני ספריות של תרכובות.
מחקר תרגומי ופריקליני
- ערך מדעי: מקשר בין מודלים של ממברנות סינתטיות לביולוגיה טבעית באמצעות חקר תגובות ליפידים למדרגי סידן רלוונטיים פיזיולוגית.
- ערך תפעולי: תומך ברצף שבין גילוי מכניסטי לתיקוף פרה-קליני על ידי ביסוס קשרי סיבה-תוצאה בעיצוב מחדש של הממברנה.
שילוב תהליכים וזרימת עבודה
השיטה משתלבת בתהליכי גילוי מוקדמים שבהם הפחתת סיכונים מכניסטיים של מטרות הקשורות לממברנה היא קריטית, במיוחד בתחומי טיפול הכוללים איתות של סידן כגון מדעי העצבים ואונקולוגיה.
- ביולוגיה של תגליות: תומך בבדיקת היפותזות של מטרות הרגישות לסידן באמצעות ויזואליזציה ישירה של עיצוב מחדש של ממברנת הליפידים בעקבות חשיפה למדרג ריכוזים.
- סריקה: מאפשר מוכנות של הבדיקה באמצעות יצירת וסיקולות סטנדרטית ומדדי בליטות מדידים לצורך זיהוי פגיעות (hits).
- אנליטיקה: מספק נתוני מורפולוגיה מרחביים וזמניים של הממברנה באמצעות דימוי פלואורסצנציה להשוואה בין תרכובות או תנאי מדרג ריכוזים.
- מחקר תרגומי: תואם למערכות הרלוונטיות למחלה על ידי חיקוי תנודות סידן מקומיות הנצפות בסביבות מיקרו-תאיות.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה ביו-מימטית ניתנת לשימוש חוזר, הניתנת להתאמה להרכבי ליפידים ופרדיגמות גירוי שונות לאורך פרויקטים שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי בתיקוף מטרה על ידי הפחתת סיכונים הנובעים מעמימות מכניסטית סביב אינטראקציות של סידן וממברנה.
- ערך תפעולי: מבטיח הדירות באמצעות הכנה סטנדרטית של ליפידים, מיקרו-הזרקה מבוקרת ופרוטוקולי דימות.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות ה-go/no-go באמצעות אספקת תובנות מוקדמות, מבוססות-מכניזם, לגבי השפעות התרכובות על יציבות הממברנה.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף של מטרות מותאם-סיכון, בהתבסס על פנוטיפים מאומתים של עיצוב מחדש של הממברנה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בהכנת וזיקולות ליפידיות, מיקרו-מניפולציה ומיקרוסקופיית פלואורסצנציה.
- תלוי בקפילרות זכוכית שנמשכו באמצעות לייזר, מסנני מזרק ומערכות הזרקה מדויקות תחת בקרת לחץ.
- מחייב סטנדרטיזציה של הרכב הליפידים, גודל הוזיקולות וריכוז הסידן לצורך עקביות בין ניסויים.
- התאמה לממברנות טבעיות או למערכות פולימריות עשויה לדרוש אופטימיזציה של תנאי הבאפר ופרמטרי העירור.
- מגבלות מעשיות כוללות את יציבות הוזיקולות לאורך זמן ושונות פוטנציאלית ביעילות היווצרות הבליטות.
שאלות נפוצות בתחום הביו-פארמה
Chapters in this video
0:04
Title
0:41
Preparation of Small Lipid Vesicles
2:38
Preparation of GUV-MLV Complexes
4:12
Micropipette Preparation and Microinjection
6:09
Formation and Translation of Membrane Tubular Protrusions (MTPs) using the Calcium Ion Source
6:57
Results: Formation of Membrane Tubular Protrusions in Giant Vesicles Upon Localized Application of Calcium Ion Gradients
7:37
Conclusion
