Name: פרוסות המוח, יותרת המוח בריא לחקירות אלקטרופיזיולוגיות של תאים יותרת המוח בדגים Teleost (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: חקור תקשורת תאית בנוירואנדוקרינולוגיה באמצעות פרוסות מוח-יותרת המוח מדגי מדקה Oryzias latipes. השיטה משלבת patch-clamp perforated לרישום פעילות חשמלית של תאי יותרת המוח בסביבה פיזיולוגית שלמה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים גב' LourdesCarreon G טאן עזרה שמירה על המתקן medaka, אנתוני Peltier עבור נתוני המחשה. עבודה זו מומן על-ידי NMBU ועל -ידי מועצת המחקר של נורבגיה, המספרים גרנט 244461 (חקלאות ימית תוכנית) ו 248828 (תכנית החיים הדיגיטליים נורבגיה).

לטיפול בבעלי חיים כל בוצעה על-פי המלצות טיפול ולרווחתם של בעלי חיים מחקר ב אוניברסיטת הנורבגית למדעי החיים, ותחת פיקוחו של חוקרים מורשים.
1. הכנת כלים ופתרונות
הערה: כל הפתרונות צריכים להיות סטרילי. תשומת לב תינתן ועד ה-pH של osmolality (osmol/kg מים) של כל הפתרונות, אשר צריך להיות בזהירות מותאם הסביבה חוץ-תאי המין למד. pH ו osmolality צריך להיות מותאם עם ציוד אלקטרוני מדויק, כגון ph ו- osmometer נקודת הקיפאון בהתאמה.
<ol><li>
להפוך 500 מ"ל של פתרון במיוחד הסלולר ללא Ca2 + (Ca2 + חינם EC): 150 מ מ NaCl, 5 מ מ אשלגן כלורי, 1.3 מ'מ MgCl2, גלוקוז 4 מ מ, 10 מ מ Hepes.
	<ol>
<li>להמיס 4.38 g של NaCl, 186.37 מ"ג אשלגן כלורי, 61.89 מ"ג של MgCl2, 360.32 מ"ג של גלוקוז ו- g 1.19 של HEPES ב 450 מ של הנדסה גנטית (0.055 ארה ב / ס מ 25 ° c, את resistivity של שלום כהן 18.2) H2O בתוך זכוכית באמצעות מסית מגנטי.</li>
		<li>להתאים את ה-pH ל 7.75 עם NaOH.</li>
		<li>להעביר את הפתרון לתוך בקבוקון נפח 500 מ"ל. למלא את סטריליות הנדסה גנטית H2O עד 500 מ"ל.</li>
		<li>מערבבים את הפתרון לפני מדידה את osmolality. התאם ל 290-300 mOsm עם מניטול. מסנן לעקר את הפתרון באמצעות מערכת ואקום מים ו- 0.2 µm מסנן.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
להפוך 500 מ"ל של פתרון במיוחד הסלולר (EC): 150 מ מ NaCl, 5 מ מ אשלגן כלורי, 2 מ מ CaCl2, 1.3 מ'מ MgCl2, גלוקוז 4 מ מ, 10 מ מ Hepes.
	<ol>
<li>להמיס 4.38 גר' NaCl, 186.37 מ"ג אשלגן כלורי, 147.01 מ"ג CaCl2, 61.89 מ"ג של MgCl2, 360.32 מ"ג גלוקוז ו- g 1.19 של HEPES ב 450 מ של הנדסה גנטית H2O בתוך זכוכית באמצעות מסית מגנטי.</li>
		<li>להתאים את ה-pH ל 7.75 עם NaOH.</li>
		<li>להעביר את הפתרון לתוך בקבוקון נפח 500 מ"ל. למלא את סטריליות הנדסה גנטית H2O עד 500 מ"ל.</li>
		<li>מערבבים את הפתרון לפני מדידה את osmolality. התאם ל 290-300 mOsm עם מניטול. מסנן לעקר את הפתרון באמצעות מערכת ואקום מים ו- 0.2 µm מסנן.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
להפוך 500 מ"ל של פתרון במיוחד הסלולר עם 0.1% אלבומין שור (EC עם BSA): 150 מ מ NaCl, 5 מ מ אשלגן כלורי, 2 מ מ CaCl2, 1.3 מ'מ MgCl2, גלוקוז 4 מ מ, 10 מ מ Hepes.
	<ol>
<li>להמיס 4.38 גר' NaCl, 186.37 מ"ג אשלגן כלורי, 147.01 מ"ג CaCl2, 61.89 מ"ג של MgCl2, 360.32 מ"ג גלוקוז ו- g 1.19 של HEPES ב 450 מ של הנדסה גנטית H2O בתוך זכוכית באמצעות מסית מגנטי.</li>
		<li>להתאים את ה-pH ל 7.75 עם NaOH.</li>
		<li>להעביר את הפתרון לתוך בקבוקון נפח 500 מ"ל. למלא את סטריליות הנדסה גנטית H2O עד 500 מ"ל.</li>
		<li>מערבבים את הפתרון לפני מדידה את osmolality. התאם ל 290-300 mOsm עם מניטול. מסנן לעקר את הפתרון באמצעות מערכת ואקום מים ו- 0.2 µm מסנן. להוסיף 50 מ"ג BSA.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
להפוך 250 מ של פתרון תאיים (IC): 110 מ מ KOH, 20 מ מ אשלגן כלורי, 10 מ מ Hepes, סוכרוז 20 מ מ.
	<ol>
<li>להמיס 1.54 g KOH, 327.75 מ"ג אשלגן כלורי, 595.75 מ"ג של HEPES ו 1.712 גר' סוכרוז ב 450 מ של הנדסה גנטית H2O בתוך זכוכית באמצעות מסית מגנטי.</li>
		<li>להתאים את ה-pH ל 7.2 (N-מורפולינו) אתאן. חומצה sulfonic (MES).</li>
		<li>להעביר את הפתרון לתוך בקבוקון הנפחי 250 מ. למלא את סטריליות הנדסה גנטית H2O עד 250 מ.</li>
		<li>מערבבים את הפתרון לפני מדידה את osmolality. התאם ל 280 – 290 mOsm (10 mOsm נמוך יותר EC) עם סוכרוז. מסנן לעקר את הפתרון באמצעות מערכת ואקום מים ו- 0.2 µm מסנן.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לעשות 100 מ של פתרון 2% נמוך agarose נמס ב Ca2 + ו- BSA חינם EC (2 גר' agarose ההיתוך נמוכה ב- 100 מ של Ca2 + חינם EC). לפזר בעזרת מיקרוגל ולמקם את agarose נמס בתוך אמבט מים ב- 40 מעלות צלזיוס. תן לזה להתקרר עד 40 ° צלזיוס לפני השימוש על הרקמות. הערה: EC, Ca2 + EC חינם ניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס במשך מספר שבועות אם סטרילי ופתרונות IC ב-20 ° C, במשך מספר חודשים. Agarose ניתן לאחסן במשך שבוע ב 4 ° C, ניתן לבצע שימוש חוזר 3 – 5 פעמים לזמן קצר במיקרוגל. שימוש חוזר מופרז יוביל אידוי ושינוי של agarose, ריכוז המלחים ואיכות.</li>
	<li>
לבצע גשר אגר:
	<ol>
<li>מחממים 7.5 מ מ נימים זכוכית בורוסיליקט ארוך עם מחוץ בקוטר 2 מ מ (יתר) והצבע בתוך קוטר (ז) מ מ טאו 1.16 בעזרת מבער בונזן מוקד כ 1/3 מקצה אחד עד הזכוכית יתחיל להתכופף. הסר את הזכוכית של הלהבה ולאפשר הזכוכית לכופף עם זווית של כ 120 מעלות (איור 2א).</li>
		<li>ממיסים 2% אגר ב- EC רגילה ללא גלוקוז באמצעות מיקרוגל, ובעוד agarose זה מילוי נוזלי הזכוכית מוכנות מראש נימי באמצעות קפילריות כוחות על ידי לשים באחד הקצוות של הזכוכית לתוך הנוזל ומחכים כמה דקות. לאחסן גשרים עד השימוש ב 4 ° C ב- EC ללא גלוקוז.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכינו זכוכית בורוסיליקט עם נימה תיקון פיפטות באמצעות של פולר פיפטה מתאימים. עיין במדריך פולר פיפטה כדי לקבל את ההתנגדות הרצויה אלקטרודה. הערה: לנר של פיפטה צריך להיות קצר ככל האפשר. להתחדד קצר פיפטה מושגת באמצעות צעדים מושך 4-6. ההתנגדות אלקטרודה צריך להיות בין 2 ו 6 MΩ בהתאם לגודל התא.</li>
	<li>
כדי למנוע תנועה של רקמות במהלך הניסויים תיקון-קלאמפ מעיל פני השטח של התא הקלטה עם 0.1% של polyethylenimine (פיי) במאגר בוראט.
	<ol>
<li>הכנת 500 מ"ל של בוראט מאגר (25 מ מ):<ol>
<li>להמיס g 4.768 של נה2B4O710 H2O ב- 450 מ של הנדסה גנטית H2O בתוך זכוכית באמצעות מסית מגנטי.</li>
			<li>להתאים את ה-pH ל 8.4 עם HCl.</li>
			<li>להעביר את הפתרון לתוך בקבוקון נפח 500 מ"ל. למלא את סטריליות הנדסה גנטית H2O עד 500 מ"ל ו- 0.2 µm מסנן לעקר את הפתרון באמצעות מערכת ואקום מים.</li>
		</ol>
</li>
		<li>להכין פתרון 1% מניות של פיי (50% 1 מ"ל פיי למאגר בוראט 25 מ מ מ ל 49) ו- 0.1% פיי לדילול מאת המדללת 10 µL של 1% פתרון מניות µL 100 בוראט מאגר לשימוש האחרון.</li>
		<li>להוסיף 2 מ של 0.1% פיי על הזכוכית של בעל פרוסה ולתת את ציפוי תקופת דגירה של 1 דקה. אז בקצרה לשטוף את הזכוכית. פעמיים עם 5 מ של הנדסה גנטית H2O ותני אוויר יבש עד השימוש.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
להכין את הפתרונות המפוטריצין.
	<ol>
<li>להפוך 60 מ"ג/מ"ל פתרון מניות על ידי המסת 3 מ ג של אבקת המפוטריצין µL 50 דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד), צינור 1 מ"ל מוגן מפני אור. מערבולת במהירות המרבית עבור 30 s ו sonicate למשך 15 דקות homogenize. חנות aliquots לתוך צינורות 3 – 5 ב-20 ° C, להשתמש aliquot אחת ליום. הערה: אם הפתרון מניות B שהוא גוסס אינה ברורה וחד צהוב צבע אבל חלבי (עדיין צהוב) לאחר 15-20 דקות sonication להפוך פתרון מלאי חדש.</li>
		<li>להפוך IC פתרון עם המפוטריצין על ידי pipetting 2 מ ל IC גביע זכוכית נקי עם יותר מ- 10 מיליליטר. להוסיף 8 µL של פתרון מניות B שהוא גוסס הפתרון פיפטה ומערבבים על ידי pipetting. לעטוף את. הספל עם רדיד אלומיניום והמקום על הקרח עד לשימוש, לחדש אותו כל 3 שעות.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. ניתוח וחלוקת עם Vibratome
<ol><li>להכין כלי ניתוח לפני לנתח, כולל חדה אחת, מלקחיים חזק אחת עם מספריים. לנקות את הכלים (קופסת הטישיו, מברשת, מלקחיים) עם אתנול ולוודא כי הם משמשים למטרות ניתוח בלבד, לא ליצור קשר עם רקמות קבוע. לשמור אותם בקופסה נפרדת כדי למנוע זיהום.</li>
	<li>המתת חסד הדג במי קרח קר עבור 1 דקות.</li>
	<li>
בצע את השלבים הבאים לנתח במהירות medaka המוח ואת יותרת המוח עם מלקחיים חדה (השתמש לא יותר מ 3 דקות).
	<ol>
<li>בעוד מחזיק את הדג עם המלקחיים חזקה חמור העצבים האופטים שני מאחורי העיניים עם מספריים או מלקחיים חדים.</li>
		<li>פתח את החלק הגבי של הגולגולת מן הצד האחורי בצד הקדמי על ידי שבירת עצמות הגולגולת צעד אחר צעד עם מלקחיים חזקה.</li>
		<li>לקלף את הגולגולת בצד אחד עם מלקחיים חזקה.</li>
		<li>חמור חוט השדרה עם מספריים או מלקחיים חדה.</li>
		<li>. בעדינות, קח חוט השדרה עם המלקחיים, להפוך את המוח האחורי כדי הקדמי ולמקם אותו לתוך תבשיל עם קר כקרח Ca2 + חינם לכלכלת</li>
	</ol>
</li>
	<li>ממלאים תבנית מתכת3 1.5-2 ס מ עם agarose נוזלי ומניחים אותו על הקרח.</li>
	<li>בדיוק לפני agarose מתמצק (ב בסביבות 25-30 מעלות צלזיוס), בעדינות לתפוס את המוח על ידי חוט השדרה עם המלקחיים, יבש המלקחיים עם חתיכה של נייר איכותי, מכניסים agarose הרקמה. מערבבים במהירות את agarose לדלל את העקבות של EC הותירו מסביב לרקמת, להתמצא הרקמה ולתת את התבנית על קרח לכמה שניות עד agarose מתקשה. הערה: הכרחי בשלב זה יהיה מהיר. Agarose עפור במהירות כפי כייר מתכת מקורר של קרח.</li>
	<li>חיתוך בלוק מרובע של agarose המכילה הרקמות עם להב סכין והדבק אותה על המחזיק הדגימה vibratome באמצעות דבק ניתוח (רעיל).</li>
	<li>למלא את cuvette של vibratome קבלת המחזיק (יותרת-המוח) הדגימה עם קרח Ca2 + חינם לכלכלת</li>
	<li>למקם את המחזיק הדגימה vibratome וחותכים את הבלוק agarose כדי להפוך parasagittal מקטעים של 150 מיקרומטר, באמצעות תדר גבוה ומהירות נמוכה עבור חלוקתה. לאסוף את המקטעים הנבחרים ולמקם אותם אל החדר הקלטה תיקון-קלאמפ עם 3 מ"ל של קרח Ca2 + חינם לכלכלת</li>
	<li>במקום הנבל הרשת (איור 2B) על סעיף הרקמה. הערה: הנבל יחד עם הציפוי לייצב את הרקמות ולמנוע ממנו לזוז במהלך ההקלטות תיקון-קלאמפ.</li>
	<li>לאחר בנבל במקום, לשנות Ca2 + חינם EC המדיום EC נורמלי עם Ca2 + ו- BSA. תן לשאר רקמות למשך 10 דקות.</li>
</ol>3. תיקון-קלאמפ והקלטות אלקטרופיזיולוגיות מחורר
<ol><li>לפני תחילת הניסוי, כלוריד הכסף תיל אלקטרודות על ידי הפעולות הבאות: ראשית, להשתמש עם נייר זכוכית עדין (p180 מיוצר מאלומיניום) כדי לנקות את האלקטרודות חוט כסף. שנית, לשטוף עם 2 מ"ל, 70% אתנול. שלישית, לטבול את החוטים ב mL 2, 2 – 5% כלור למשך 10 דקות. לבסוף, לשטוף עם 2 מ"ל, הנדסה גנטית H2O.</li>
	<li>מקום תא הקלטה עם הפרוסה יותרת המוח בשלב מיקרוסקופ לאתר אזור היעד (יותרת המוח) באמצעות המטרה X 10, לבדוק את התאים באמצעות המטרה X 40. הערה: אם ההכנה הוא מוצלח, צריך תאים עגולים ומעט מאוד להיות גלוי. תאים עגולים אלה הם תאים פגומים בדרך כלל כי הן ניתוק מן הרקמה.</li>
	<li>מקם את אלקטרודת הארקה דרך הגשר 2% אגר לאמבטיה EC.</li>
	<li>אתר תא בריא באמצעות המטרה X 40. הערה: תא בריא צריך להיות בחוזקה המצורפת הפרוסה רקמות לא מעוגל למעלה, מנותקת הפרוסה.</li>
	<li>להגדיר את המגבר מתח-קלאמפ (VC; מצב הצבע 4A איור 1). פתח החותם לבדוק תצורת האמבט החלון ולחץ (איור 4B נקודה 1 ו- 2. השתמש דופק 5-mV כדי לפקח על פיפטה ההתנגדות (איור 4B נקודת 3).</li>
	<li>מילוי בקצה פיפטה תיקון עם הפתרון IC חינם פטריות לפני הוספת הפתרון IC עם המפוטריצין באמצעות מזרק מיקרו-המילוי (ראה איור 3).</li>
	<li>להוסיף לחץ אוויר חיובי מעט פיפטה תיקון באמצעות מזרק 1 מ"ל. הערה: זה הופך זרם נוזלי קטן מ פיפטה תיקון זה למנוע זיהום של הקצה.</li>
	<li>פעם אחת באמבטיה, להעריך את ההתנגדות פיפטה תיקון וודא כי אין חלקיקי מחוברים בקצה פיפטה (איור 4C). הערה: חתיכה קטנה של קלטת מחובר על גבי הצג הצגת הטופס הקלטת וידאו שדה הראייה. זה הופך את מיקום פיפטה תיקון ביחס תא קל יותר כאשר המטרה לא מתמקד התא.</li>
	<li>מדריך על פיפטה תיקון אל התא באמצעות micromanipulators. הערה: ודא כי פיפטה נקי על-ידי חיפוש חלקיקים קטנים יש לצרף עד לקצה פיפטה. שינויים פתאומיים התנגדות עשוי גם להיות תוצאה של חלקיקים תקוע בקצה פיפטה.</li>
	<li>להתאים מחדש את פיפטה כאשר מספר מיקרונים שמעל לתא כך קצה פיפטה יגע התא 1/3 מהאמצע של התא, כמוצג באיור5. כאשר נוגעים התא, לשחרר את הלחץ ולהחיל היניקה עדין עד שנגרום לכלב-ים. הערה: הזמן פיפטה תיקון נכנס לאמבטיה כדי מוצלחת חותם ולמורה קצר ככל האפשר. לא יותר מ 1 – 1.5 דקות כדי להימנע המפוטריצין להגיע בקצה של פיפטה, דליפה לתוך האמבט.</li>
	<li>מיד, מעבר לחלון טלאי תיקון-קלאמפ לתוכנה (איור 4 D נקודה 1) ויש פוטנציאל מחזיק בין-50 ו-60 mV (נקודת4D איור 2). רפד קיבול מהר מורכב על-ידי פיפטה מזכוכית (נקודת4D איור 3).</li>
	<li>מעבר לחלון התא . מלחציים צולבים תיקון תוכנה (איור 4E נקודה 1 ו- 2) ולהתחיל ניטור הגישה התנגדות, Ra, מוצג בחלון. אפס החוצה קיבול הממברנה בתוכנה מגבר (איור 4E נקודת 3) לאחר ושברשותך הרשאת גישה מתאימה. הערה: גישה מספיקות עשוי להימשך 10-30 דקות (איור 4E הצבע 2). גישה טובה להקלטות קלאמפ הנוכחי צריך להיות מתחת 20 מ'.</li>
	<li>לעבור קלאמפ הנוכחי, IC, בחלון התוכנה מגבר (איור 4F נקודה 1). התאם את הזרמים מהיר-קיבולי בחלון קלאמפ של התוכנה מגבר (איור 4F הצבע 2 ו- 3) אותו ערך כמו 3.12. בדוק פוטנציאל ממברנה (איור 4F נקודה 1). הערה: חשוב, אם קרום פוטנציאלי הוא רדוד (אופייני מעל-35 mV) התא עלול להינזק. בטל את ההקלטה, למצוא תא חדש.</li>
	<li>לאחר מציאת תא בריא (מחובר היטב אל הרקמות עם קרומית אפשרית מתחת-40 mV), להתחיל ההקלטות ניסיוני כמפורט של היצרן-פרוטוקול- 33,-34.</li>
</ol>

<ol><li>Stojilkovic, S. S., Tabak, J., Bertram, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+channels+and+signaling+in+the+pituitary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr+Rev%22%5BJournal%5D)">Ion channels and signaling in the pituitary gland.</a> Endocr Rev. 31 (6), 845-915 (2010).</li>
<li>Stojilkovic, S. S., Zemkova, H., Van Goor, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+basis+of+pituitary+cell+type-specific+Ca2%2B+signaling-secretion+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Biophysical basis of pituitary cell type-specific Ca2+ signaling-secretion coupling.</a> Trends Endocrinol Metab. 16 (4), 152-159 (2005).</li>
<li>Van Goor, F., Goldberg, J. I., Chang, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine-D2+actions+on+voltage-dependent+calcium+current+and+gonadotropin-II+secretion+in+cultured+goldfish+gonadotrophs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroendocrinol%22%5BJournal%5D)">Dopamine-D2 actions on voltage-dependent calcium current and gonadotropin-II secretion in cultured goldfish gonadotrophs.</a> J Neuroendocrinol. 10 (3), 175-186 (1998).</li>
<li>Chang, J. P., Pemberton, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+aspects+of+GnRH-Stimulated+signal+transduction+in+the+vertebrate+pituitary+-+Contributions+from+teleost+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Comparative aspects of GnRH-Stimulated signal transduction in the vertebrate pituitary - Contributions from teleost model systems.</a> Mol Cell Endocrinol. , (2017).</li>
<li>Heyward, P. M., Chen, C., Clarke, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inward+membrane+currents+and+electrophysiological+responses+to+GnRH+in+ovine+gonadotropes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroendocrinology%22%5BJournal%5D)">Inward membrane currents and electrophysiological responses to GnRH in ovine gonadotropes.</a> Neuroendocrinology. 61 (6), 609-621 (1995).</li>
<li>Ben-Jonathan, N., Hnasko, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+as+a+Prolactin+%28PRL%29+Inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">Dopamine as a Prolactin (PRL) Inhibitor.</a> Endocrine Reviews. 22 (6), 724-763 (2001).</li>
<li>Sanchez-Cardenas, C., Hernandez-Cruz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GnRH-Induced+%5BCa2%2B%5Di-signalling+patterns+in+mouse+gonadotrophs+recorded+from+acute+pituitary+slices+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroendocrinology%22%5BJournal%5D)">GnRH-Induced [Ca2+]i-signalling patterns in mouse gonadotrophs recorded from acute pituitary slices in vitro.</a> Neuroendocrinology. 91 (3), 239-255 (2010).</li>
<li>Neher, E., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-channel+currents+recorded+from+membrane+of+denervated+frog+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres.</a> Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).</li>
<li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).</li>
<li>Neher, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNeher%2C+E+%22Techniques+in+cellular+physiology%22">Techniques in cellular physiology</a>. Baker, P. F. , Elsevier/North. Holland. 4-19 (1981).</li>
<li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflugers Arch. 391 (2), 85-100 (1981).</li>
<li>Cahalan, M., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+techniques%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Patch clamp techniques: an overview.</a> Methods Enzymol. 207, 3-14 (1992).</li>
<li>Marty, A., Neher, E. <a target="_blank" href="NULL">Single Channel Recording</a>. Sakmann, B., Neher, E. , Plenum Press. 113-114 (1983).</li>
<li>Lindau, M., Fernandez, J. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2417125">IgE-mediated degranulation of mast cells does not require opening of ion channels.</a> Nature. 319 (6049), 150-153 (1986).</li>
<li>Horn, R., Marty, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscarinic+activation+of+ionic+currents+measured+by+a+new+whole-cell+recording+method%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Muscarinic activation of ionic currents measured by a new whole-cell recording method.</a> J Gen Physiol. 92 (2), 145-159 (1988).</li>
<li>Rae, J., Cooper, K., Gates, P., Watsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+access+resistance+perforated+patch+recordings+using+amphotericin+B%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Low access resistance perforated patch recordings using amphotericin B.</a> J Neurosci Methods. 37 (1), 15-26 (1991).</li>
<li>Fan, J. S., Palade, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9799421">Perforated patch recording with beta-escin.</a> Pflugers Arch. 436 (6), 1021-1023 (1998).</li>
<li>Hodne, K., von Krogh, K., Weltzien, F. A., Sand, O., Haug, T. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22705036">Optimized conditions for primary culture of pituitary cells from the Atlantic cod (Gadus morhua). The importance of osmolality, pCO(2), and pH.</a> Gen Comp Endocrinol. 178 (2), 206-215 (2012).</li>
<li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="https://www.springer.com/us/book/9780306448706">Single-Channel Recording</a>. , Springer. US. 3-35 (1983).</li>
<li>Andersen, P. <a target="_blank" href="http://www.cell.com/trends/neurosciences/abstract/0166-2236(81)90019-9">Brain slices - a neurobiological tool of increasing usefulness.</a> Trends in Neurosciences. 4, 53-56 (1981).</li>
<li>Guerineau, N. C., Bonnefont, X., Stoeckel, L., Mollard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronized+spontaneous+Ca2%2B+transients+in+acute+anterior+pituitary+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Synchronized spontaneous Ca2+ transients in acute anterior pituitary slices.</a> J Biol Chem. 273 (17), 10389-10395 (1998).</li>
<li>Levavi-Sivan, B., Bloch, C. L., Gutnick, M. J., Fleidervish, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrotonic+coupling+in+the+anterior+pituitary+of+a+teleost+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Electrotonic coupling in the anterior pituitary of a teleost fish.</a> Endocrinology. 146 (3), 1048-1052 (2005).</li>
<li>Guerineau, N. C., McKinney, R. A., Debanne, D., Mollard, P., Gahwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+cultures+of+the+rat+anterior+pituitary%3A+morphology%2C+physiology+and+cell-to-cell+communication%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Organotypic cultures of the rat anterior pituitary: morphology, physiology and cell-to-cell communication.</a> J Neurosci Methods. 73 (2), 169-176 (1997).</li>
<li>Yu, Y., Ali, D. W., Chang, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+ionic+currents+and+electrophysiological+properties+of+goldfish+somatotropes+in+primary+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Gen+Comp+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Characterization of ionic currents and electrophysiological properties of goldfish somatotropes in primary culture.</a> Gen Comp Endocrinol. 169 (3), 231-243 (2010).</li>
<li>Price, C. J., Goldberg, J. I., Chang, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-activated+ionic+currents+in+goldfish+pituitary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gen+Comp+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Voltage-activated ionic currents in goldfish pituitary cells.</a> Gen Comp Endocrinol. 92 (1), 16-30 (1993).</li>
<li>Van Goor, F., Goldberg, J. I., Chang, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+membrane+properties+and+ionic+currents+in+cultured+goldfish+gonadotrophs%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Physiol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Electrical membrane properties and ionic currents in cultured goldfish gonadotrophs.</a> Can J Physiol Pharmacol. 74 (6), 729-743 (1996).</li>
<li>Xu, S., Shimahara, T., Cooke, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capacitance+increases+of+dissociated+tilapia+prolactin+cells+in+response+to+hyposmotic+and+depolarizing+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Gen+Comp+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Capacitance increases of dissociated tilapia prolactin cells in response to hyposmotic and depolarizing stimuli.</a> Gen Comp Endocrinol. 173 (1), 38-47 (2011).</li>
<li>Haug, T. M., Hodne, K., Weltzien, F. A., Sand, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+properties+of+pituitary+cells+in+primary+culture+from+Atlantic+cod+%28Gadus+morhua%29%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroendocrinology%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological properties of pituitary cells in primary culture from Atlantic cod (Gadus morhua).</a> Neuroendocrinology. 86 (1), 38-47 (2007).</li>
<li>Strandabo, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+transduction+involved+in+GnRH2-stimulation+of+identified+LH-producing+gonadotropes+from+lhb-GFP+transgenic+medaka+%28Oryzias+latipes%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Signal transduction involved in GnRH2-stimulation of identified LH-producing gonadotropes from lhb-GFP transgenic medaka (Oryzias latipes).</a> Mol Cell Endocrinol. 372 (1-2), 128-139 (2013).</li>
<li>Hodne, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+differences+between+fshb-+and+lhb-expressing+gonadotropes+in+primary+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological differences between fshb- and lhb-expressing gonadotropes in primary culture.</a> Endocrinology. 154 (9), 3319-3330 (2013).</li>
<li>Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medaka--a+model+organism+from+the+far+East%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Medaka--a model organism from the far East.</a> Nat Rev Genet. 3 (1), 53-64 (2002).</li>
<li>Ball, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypothalamic+control+of+the+pars+distalis+in+fishes%2C+amphibians%2C+and+reptiles%5BTitle%5D)+AND+%22Gen+Comp+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Hypothalamic control of the pars distalis in fishes, amphibians, and reptiles.</a> Gen Comp Endocrinol. 44 (2), 135-170 (1981).</li>
<li>pCLAMP 10 Data Acquisition and Analysis For Comprehensive Electrophysiology User Guide. <a target="_blank" href="NULL">Molecular Devices Corporation</a>. , (2006).</li>
<li>MultiClamp 700B COMPUTER-CONTROLLED MICROELECTRODE AMPLIFIER Theory and Operation. <a target="_blank" href="NULL">Axon Instruments / Molecular Devices Corp</a>. , (2005).</li>
<li>Dominguez-Mancera, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptin+regulation+of+inward+membrane+currents%2C+electrical+activity+and+LH+release+in+isolated+bovine+gonadotropes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Leptin regulation of inward membrane currents, electrical activity and LH release in isolated bovine gonadotropes.</a> Biochem Biophys Res Commun. 491 (1), 53-58 (2017).</li>
<li>Schmidt-Nielsen, K. <a target="_blank" href="https://books.google.com/books/about/Animal_Physiology.html?id=Af7IwQWJoCMC">Animal Physiology : adptation and environment fifth edition</a>. , Cambridge university press. 613(1997).</li>
<li>Burton, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+determinants+of+normal+arterial+plasma+pH+in+ectothermic+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Evolutionary determinants of normal arterial plasma pH in ectothermic vertebrates.</a> J Exp Biol. 205, Pt 5 641-650 (2002).</li>
<li>Burton, R. F. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0300962995021027">The dependence of normal arterial blood pH on sodium concentration in teleost fish.</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Physiology. 114 (2), 111-116 (1996).</li>
<li>Heming, T. A., Blumhagen, K. A. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0166445X88900306">Plasma acid-base and electrolyte states of rainbow trout exposed to alum (aluminum sulphate) in acidic and alkaline environments.</a> Aquatic Toxicology. 12 (2), 125-139 (1988).</li>
<li>Reeves, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interaction+of+body+temperature+and+acid-base+balance+in+ectothermic+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">The interaction of body temperature and acid-base balance in ectothermic vertebrates.</a> Annu Rev Physiol. 39, 559-586 (1977).</li>
<li>Baicu, S. C., Taylor, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acid-base+buffering+in+organ+preservation+solutions+as+a+function+of+temperature%3A+new+parameters+for+comparing+buffer+capacity+and+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Acid-base buffering in organ preservation solutions as a function of temperature: new parameters for comparing buffer capacity and efficiency.</a> Cryobiology. 45 (1), 33-48 (2002).</li>
<li>Miyanishi, H., Inokuchi, M., Nobata, S., Kaneko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Past+seawater+experience+enhances+seawater+adaptability+in+medaka%2C+Oryzias+latipes%5BTitle%5D)+AND+%22Zoological+Lett%22%5BJournal%5D)">Past seawater experience enhances seawater adaptability in medaka, Oryzias latipes.</a> Zoological Lett. 2, 12(2016).</li>
<li>Cass, A., Finkelstein, A., Krespi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ion+permeability+induced+in+thin+lipid+membranes+by+the+polyene+antibiotics+nystatin+and+amphotericin+B%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">The ion permeability induced in thin lipid membranes by the polyene antibiotics nystatin and amphotericin B.</a> J Gen Physiol. 56 (1), 100-124 (1970).</li>
<li>Holz, R., Finkelstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+water+and+nonelectrolyte+permeability+induced+in+thin+lipid+membranes+by+the+polyene+antibiotics+nystatin+and+amphotericin+B%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">The water and nonelectrolyte permeability induced in thin lipid membranes by the polyene antibiotics nystatin and amphotericin B.</a> J Gen Physiol. 56 (1), 125-145 (1970).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף

הקלטות אלקטרופיזיולוגיות בטכניקה תיקון-קלאמפ על פרוסות המוח, יותרת המוח דורש אופטימיזציה זהירה. פרוטוקולים היטב אופטימיזציה עבור ביצוע חקירות לחיות תאים במיוחד teleosts מוגבלות, עם הרוב של פרסומים באמצעות פרוטוקולים המבוססים על מערכות יונקים. בהקשר זה, חשוב להיות מודעים לעובדה כי מספר פרמטרים פיזיולוגיים כמו pH osmolality הם לא רק מינים תלויים, אבל גם תלוי מאוד אם המדובר האורגניזם חי ביבשה או במים. דגים, יש גם צורך, לקחת בחשבון, אם הם חיים בסביבה ימית או מים מתוקים. לדוגמה, הלחץ חלקי2 CO הוא נמוך בהרבה בדגים ל...

בלוטת יותרת המוח הוא איבר האנדוקרינית המפתח גולגולת ממוקם מתחת להיפותלמוס, אחורי הצנטר. הוא מייצר, מפריש הורמונים שישה עד שמונה סוגים תאים מסוים. הורמוני יותרת המוח מהווים ביניים בין המוח לבין איברים היקפיים ולנסוע מגוון רחב של תהליכים פיזיולוגיים חיוניים כולל גדילה, רבייה של ההסדרה של הומאוסטזיס. בדומה נוירונים, תאי האנדוקרינית של ההיפופיזה נמצאים חשמלית להתרגש עם היכולת לירות פוטנציאל פעולה באופן ספונטני 1. תפקידם של אלה פוטנציאל פעולה הוא תא התלויים. מספר סוגי תאים של יונקים ההיפופיזה, פוטנציאל פעולה יכול לרומם את תאיים Ca2 + מספיק לשחרור מתמשכת של הורמון 2. בנוסף, בלוטת יותרת המוח מקבל מידע מופחתים והן מעכבות המוח המשפיעה על פוטנציאל הממברנה של התאים 3,4,5,6. בדרך כלל, קלט מופחתים מגביר את רגישות לעתים קרובות כרוך על שחרורו של Ca2 + מחנויות תאיים וכן גדל ירי תדירות 7. הבנת איך התא מנצל את ההרכב ערוץ יון ומתאים אלה אותות מהמוח, היא המפתח להבנה הורמון סינתזה ושחרור.
הטכניקה תיקון-קלאמפ היה פותח בסוף שנות ה-70 על ידי Sakmann, Neher 8,9,10 , משופרת נוספת על ידי האמיל 11, ומאפשר חקירות מפורטת של מאפייני אלקטרופיזיולוגיות של תאים אל תעלות יונים יחיד. יתר על כן, הטכניקה ניתן ללמוד זרם ומתח. היום, מחבר תיקון-חובק למעקה הוא תקן הזהב למדידת תכונות אלקטרופיזיולוגיות של התא. ארבע הגדולות תצורות לשיטת תיקון-קלאמפ חותם חזק היה מפותח 11; את התא צמוד-את-inside-out, את החוץ-אאוט, התיקון השלם-תא. שלוש תצורות הראשונה משמשים בדרך כלל עבור יון בודד ערוץ חקירות. ליום העצמאות, בעקבות לתצורת צמוד-תא, חור קרום התא הוא עשה שימוש בלחץ אטמוספרי תת. תצורה זו מאפשרת גם חקירות של יון ערוץ הרכב של התא כולו 12. עם זאת, מגבלה אחת של טכניקה זו היא כי מולקולות cytoplasmic הם מדולל על ידי תיקון פיפטה פתרון 13 (איור 1א'), ובכך משפיע על התגובות חשמליות ומגנטיות פיזיולוגיים של התאים למד. אכן, חלק מן המולקולות עשוי לשחק תפקידים חשובים בהעברת האות או בוויסות של תעלות יונים שונים. כדי למנוע זאת, לינדאו, פרננדז 14 פיתח שיטה איפה תרכובת להיוות נקבובית מתווסף על פיפטה תיקון. בעקבות לתצורת צמוד-תא, המתחם לשלב קרום פלזמה תחת התיקון, לאט לנקב את הקרום יצירת מגע חשמלית עם ציטוזול (איור 1B). ניתן להשתמש במספר תבחיני שונים כגון ניסטטין 15 ו- B שהוא גוסס 16, או פיתחה כגון סאפונין בטא-escin 17,18 . תרכובות אלו ליצור נקבוביות גדול מספיק כדי לאפשר הקטיון monovalent ו- Cl– דיפוזיה בין ציטוזול על פיפטה של תיקון תוך שמירה על רמת cytosolic של מקרומולקולות, יונים גדולים יותר כמו Ca2 + 15, 16.
האתגר של שימוש תיקון מחורר הוא ההתנגדות סדרת פוטנציאל גבוה. סדרת ההתנגדות (Rs) או הגישה התנגדות נגמר ההתנגדות משולב פיפטה תיקון ביחס הקרקע. במהלך הקלטות תיקון-קלאמפ, ה-Rs יהיה במקביל התנגדות הממברנה (Rמ'). Rm ו- Rs עבודה במקביל מחלק מתח. עם ה-R גבוהs, המתח ייפול על ה Rs נותן שגיאות בהקלטות. השגיאה יהפוך גדול עם זרמים גדול נרשם. בנוסף, מחלק מתח הוא גם תדירות תלויה יצירת מסנן נמוך לעבור, ובכך להשפיע על רזולוציה טמפורלית. למעשה, התיקון מחורר שלא תמיד יאפשרו הקלטות של זרמים גדול ומהיר כמו המתח מגודרת זרמי Na+ (עבור קריאות מפורט ראו התייחסות 19). כמו כן, Rs עשוי להשתנות במהלך הקלטות תיקון-קלאמפ, שוב מובילים לשינויים בזרם המוקלט. לפיכך, תוצאות חיוביות שגויות עלולה להתרחש במצבים שבו Rs משתנה במהלך היישום סמים.
אלקטרופיזיולוגיה על הרקמה הפרוס הוצג לראשונה על ידי המעבדה אנדרסן ללמוד אלקטרופיזיולוגיות מאפייני הנוירונים במוח 20. הטכניקה סללה את הדרך עבור חקירות מפורט של תאים בודדים, כמו גם מעגלי תקשורת ותא תא-תא בסביבה יותר ללא פגע. טכניקה דומה להכנת פרוסות יותרת המוח הוצג לראשונה בשנת 1998 על ידי. Guérineau et al. 21. עם זאת, זה לא היה לפני 2005, הכנה פרוסה יותרת המוח הזה שימש בהצלחה ללימודי תיקון-קלאמפ teleost 22. במחקר זה, המחברים דיווחו גם על השימוש תיקון מחורר-קלאמפ הקלטות. עם זאת, עד כה, רוב החקירות אלקטרופיזיולוגיות של תאים יותרת המוח נערכו יונקים, רק קומץ של בעלי חוליות אחרים, כולל דגים teleost 1,2,22,23 . ב- teleosts, כמעט כל מחקרים בוצעו על תאים הפומבית ראשי 24,25,26,27,28,29,30 .
בתוך המאמר הנוכחי, אנחנו חלוקה לרמות פרוטוקול ממוטב עבור הכנה של המוח, יותרת המוח בריא, פרוסות medaka דגים המודל. הגישה מייצג מספר יתרונות בהשוואה תרביות תאים הפומבית העיקרי. ראשית, התאים נרשמים בסביבה יחסית משומר לעומת חלופה מועדפת תנאי התרבות תאים. שנית, ההכנות פרוסה מאפשרים לנו ללמוד מסלולים עקיף בתיווך תא-תא תקשורת 22, אשר אינה אפשרית בתנאי חלופה מועדפת תא תרבות. יתר על כן, נדגים כיצד לנהל הקלטות אלקטרופיזיולוגיות על הפרוסות רקמות שהושג באמצעות הטכניקה מחורר כולו-תא תיקון-קלאמפ עם המפוטריצין כסוכן להיוות נקבובית.
Medaka הוא דג מים מתוקים קטנים ילידי אסיה, בעיקר נמצאו ביפן. פיזיולוגיה, אמבריולוגיה, גנטיקה של medaka בהרחבה נחקרו במשך שנים מעל 100 31, זה דגם נפוץ מחקר במעבדות רבות. חשוב במיוחד הנייר הזה הינו הארגון מורפולוגיים ברורים של המתחם ההיפותלמוס, יותרת המוח בדגים teleost: ואילו ב יונקים וציפורים הנוירונים ההיפותלמוס משחרר שלהם הנוירו-ההורמונים וויסות תאים אנדוקריני יותרת המוח למערכת פורטל של קדושתו החציוני, יש השלכה עצבני ישירה של נוירונים היפותלמי אל התאים האנדוקריניים של ההיפופיזה ב דגים teleost 32. לפיכך, עם פרוסות המוח, יותרת המוח מתנהל היטב יש חשיבות מיוחדת בדגים, ומאפשר לנו לחקור את מאפייני אלקטרופיזיולוגיות התאים יותרת המוח ברשת יותרת המוח שהשתמרו ותאים בפרט איך בבלוטת יתרת המוח לשלוט דעתנית שלהם ועל ידי כך Ca2 + הומאוסטזיס.

<table><tbody><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>דבק כירורגי</td><td>WPI</td><td>VETBOND</td><td>3M דבק רקמות</td></tr><tr><td>להבי נירוסטה</td><td>Campden Instruments</td><td>752-1-SS</td><td></td></tr><tr><td>תבניות מתכת</td><td>SAKURA</td><td>4122</td><td></td></tr><tr><td>נבל פלדה</td><td>וורנר מכשירים</td><td>64-1417</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>SIGMA</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure LMP agarose</td><td>invitrogen</td><td>166520-100</td><td></td></tr><tr><td>פיפטות תיקון</td><td>מכשיר סאטר</td><td>BF150-110-10HP</td><td>בורוסיליקט עם נימה OD: 1.5 מ"מ, תעודת זהות: 1.10 מ"מ</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פרוסות</td><td>Scientifica</td><td>pro6000</td><td></td></tr><tr><td>P-Clamp10</td><td>מכשירים מולקולריים</td><td>#1-2500-0180</td><td>sofware</td></tr><tr><td>Digitizer Digidata 1550A1</td><td>מכשירים מולקולריים</td><td>DD1550</td><td></td></tr><tr><td>מגבר Multiclap 700B Headstage CV-7B</td><td>התקנים מולקולריים</td><td>1-CV-7B</td><td></td></tr><tr><td>GnRH</td><td>Bachem</td><td>4108604</td><td>H-GLU-His-Trp-Ser-His-Gly-Leu-Ser-Pro-Gly-OH מלח טריפלואורואצטט&nbsp;</td></tr><tr><td>מושך פיפטה</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>אמפוטריצין B</td><td>SIGMA</td><td>A9528</td><td>אנטיביוטיקה יוצרת נקבוביות</td></tr><tr><td>פוליאתילנימין&nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>P3143</td><td>50% PEI תמיסת</td></tr><tr><td>מיקרופילר מזרק</td><td>WPI</td><td>MF28/g67-5</td><td></td></tr><tr><td>זכוכית לגשר האגר</td><td>מכשיר סאטר</td><td>BF200-116-15</td><td>בורוסיליקט עם נימה OD: 2.0 מ"מ, תעודת זהות: 1.16 מ"מ אש מלוטשת</td></tr><tr>תוכנת <td></td><td></td><td>מיקרו-מנהל</td> תוכנת <td>מיקרוסקופיה קוד פתוח</td></tr><tr><td>optiMOS sCMOS מצלמה</td><td>Qimaging</td><td>&nbsp; 01-OPTIMOS-R-M-16-C</td><td></td></tr><tr><td>סוניקטור</td><td>Elma</td><td>D-7700 Sinen</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>SiGMA</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>SiGMA</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>SiGMA</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>D-גלוקוז</td><td>SiGMA</td><td>G5400</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>SiGMA</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>CaCl< תת>2</td><td>SiGMA</td><td>C8106</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>SiGMA</td><td>84097</td><td></td></tr><tr><td>D-מניטול</td><td>SiGMA</td><td>63565</td><td></td></tr><tr><td>חומצה MES</td><td>SIGMA</td><td>M0895</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>SIGMA</td><td>A2153</td><td></td></tr></tbody></table>

פרוסות המוח, יותרת המוח בריא לחקירות אלקטרופיזיולוגיות של תאים יותרת המוח בדגים teleost

Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish

חקירות אלקטרופיזיולוגיות של תאים יותרת המוח נערכו זנים חוליות רבים, אבל מעט מאוד דגים teleost. בין אלה, רוב ברור בוצעו על חלופה מועדפת תאים הראשי. כדי לשפר את ההבנה שלנו של מה teleost תאים יותרת המוח, להתנהג בסביבה יותר ביולוגית רלוונטית, פרוטוקול זה מראה כיצד להכין פרוסות המוח, יותרת המוח קיימא באמצעות medaka של דגים מים מתוקים קטנים (Oryzias latipes). עושה את פרוסות המוח, יותרת המוח, pH ו osmolality של כל הפתרונות הותאמו הערכים שנמצאו נוזלי גופו של דגי תיה 25-28 מעלות צלזיוס. בעקבות הכנה פרוסה, הפרוטוקול מדגים כיצד לערוך הקלטות אלקטרופיזיולוגיות בטכניקה תיקון שלם-תא מחורר-קלאמפ.... טכניקת תיקון-קלאמפ היא כלי רב עוצמה חסרת תקדים רזולוציה טמפורלית ורגישות, המאפשר חקירת תכונות חשמליות מתאי כל שלם אל תעלות יונים יחיד. תיקון מחורר הוא ייחודי בכך. זה שומר על הסביבה תאיים ללא פגע מונע גורמים רגולטוריים ציטוזול להיות מדולל לפי הפתרון אלקטרודה פיפטה תיקון. לעומת זאת, בעת ביצוע הקלטות שלם-תא המסורתי, זה היה ציין כי תאים יותרת המוח medaka במהירות מאבדות את יכולתן לפטר את פוטנציאל פעולה. בין ניקוב טכניקות שונות זמינים, פרוטוקול זה מדגים כיצד להשיג ניקוב של קרום תוקנו באמצעות ונעביר b. שהוא גוסס

פרוטוקול זה מדגים פרוטוקול צעד אחר צעד כיצד להשיג הקלטות אלקטרופיזיולוגיות אמין מתאי יותרת המוח (gonadotrope), באמצעות קו הטרנסגניים medaka [Tg (lhb- hrGfpII)] היכן היעד תאים (מייצרי Lh gonadotropes) מסומנות עם חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP).
בתחילה, החקירות אלקטרופיזיולוגיות נערכו באמצעות התצורה תאים שלמים. עם זאת, פוטנציאל פעולה ספונטנית לא נצפו בכל התאים למד. בקבוצת משנה של תאים, פוטנציאל פעולה יכול להיות מופעלות באמצע...

המאמר מתאר פרוטוקול ממוטב עבור ביצוע פרוסות קיימא רקמת המוח, יותרת המוח, תוך שימוש medaka של דג teleost (Oryzias latipes), ואחריו אלקטרופיזיולוגיות הקלטות של יותרת המוח תאים בטכניקה תיקון-קלאמפ עם תצורת תיקון מחורר.

פרוסות המוח, יותרת המוח בריא לחקירות אלקטרופיזיולוגיות של תאים יותרת המוח בדגים Teleost

Electrophysiological investigations of pituitary cells have been conducted in numerous vertebrate species, but very few in teleost fish. Among these, the ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הנוירואנדוקרינולוגיה. כגון כיצד תאי יותרת המוח מתקשרים, מגיבים לגורם משחרר מהמוח? היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שבהשוואה לתרבית תאים ראשונית ראשונה זו, הליך זה מאפשר חקירה של תאים בסביבה שלמה יותר.למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי התכונות החשמליות של תאים מייצרי הורמונים לוטניזציה במדקה. עם התאמות קלות בלבד, הוא יכול לשמש גם לסוגי תאים אחרים או למיני דגים אחרים. תוך כדי החזקת דג טלאוסט שהורדם עם אתנול עיקר מלקחיים חזקים תחת מיקרוסקופ מנתח, חתכו את שני עצבי הראייה מאחורי העיניים בעזרת מלקחיים חדים ושברו את עצמות הגולגולת מהצד האחורי לצד הקדמי.השתמש במלקחיים כדי לקלף את הגולגולת ולנתק את חוט השדרה. אחיזה עדינה בחוט השדרה עם המלקחיים הופכת את המוח מהכיוון האחורי לקדמי, ומניחה את האיבר בכלי מלא במדיום תאי נוסף קר, נטול סידן. לאחר מכן, מלאו אחיזת מתכת של נקודה אחת של חמישה עד שניים קוביות באגרוז נוזלי והניחו את התבנית על קרח.רגע לפני שהאגרוז מתמצק, השתמש במלקחיים כדי להרים בעדינות את המוח על ידי חוט השדרה, לייבש את המלקחיים עם פיסת נייר מעבדה ולהניח את המוח לתוך האגרוז. לאחר מכן מערבבים במהירות את האגרוז כדי לדלל את כל העקבות של מדיום תאי נוסף שנותר על הרקמה ולהתאים את כיוון המוח בתוך התבנית לפי הצורך. כאשר האגרוז התמצק, השתמש בלהב אזמל כדי לקצץ גוש מרובע של אגרוז סביב הרקמה והשתמש בדבק כירורגי כדי לחבר את הדגימה למחזיק דגימת ויברטום.מלאו את הקובט של מחזיק הוויברטום במדיום תאי נוסף קר כקרח, נטול סידן והנח את המחזיק לתוך הוויברטום. בעזרת תדר גבוה ומהירות נמוכה, חתכו את בלוק האגרוז ליצירת חתכים פרסגיטליים של 150 מיקרומטר, והניחו את החלק הנבחר בתאי ההקלטה של מהדק התיקון המכילים שלושה מיליליטר של תמיסה תאית נוספת קרה כקרח ונטולת סידן. חשוב לנוע במהירות לאחר הוספת המוח לאגרוז, מכיוון שהרקמה תתייבש אם תישאר באגרוז המעוצב זמן רב מדי ויש לה גישה מוגבלת לאוויר לפני שהיא נחתכת.לאחר שכל החלקים הושגו, הנח נבל רשת על חלק הרקמה והחלף את המדיום התאי הנוסף נטול הסידן בסידן המכיל מדיום תאי נוסף בתוספת חלבון סרום בקר. לאחר מכן הניחו לרקמה לנוח במשך 10 דקות. כדי להגדיר את מהדק התיקון, הנח את תא ההקלטה עם פרוסת יותרת המוח על שלב מיקרוסקופ ההקלטה של מהדק התיקון, והשתמש במטרה פי 10 כדי לאתר את בלוטת יותרת המוח.הנח את אלקטרודת ההארקה דרך גשר ה-2% אגר לתוך אמבט המדיום התאי הנוסף, והשתמש במטרה 40X כדי לאתר תא בריא. הגדר את המגבר למתח clamp מצב ופתח את חלון בדיקת האיטום. בחר את תצורת האמבטיה והשתמש בפולס של חמישה מילי-וולט כדי לנטר את התנגדות הפיפטה.יש למלא מחדש את קצה פיפטת המדבקה בתווך תוך-תאי נטול פטריות לפני השימוש במזרק מיקרופילר כדי להוסיף תמיסה תוך-תאית בתוספת אמפוטריצין B לחלק האחורי של פיפטת המדביקה. השתמש במזרק של מיליליטר אחד כדי להוסיף לחץ אוויר חיובי מעט לתוך פיפטת התיקון כדי למנוע זיהום של קצה הפיפטה ולהעריך את התנגדות הפיפטה. אם לא מחוברים חלקיקים לקצה הפיפטה, השתמש במיקרומניפולטורים כדי להנחות את פיפטת התיקון למטה לתא.כוונון מחדש של הפיפטה כשהיא כמה מיקרונים מעל התא כך שקצה הפיפטה ייגע בתא שליש מהמרחק ממרכז התא. כדי לגעת בתא, שחרר את הלחץ והפעל יניקה עדינה כדי ליצור איטום. חיוני למרוח את הג'יגה-סיל במהירות מכיוון שלחץ חיובי בתוך פיפטת התיקון יגרום לדליפת תמיסה אנטי פטרייתית לאחר כדקה אחת של פגיעה בתאים.כאשר האיטום נמצא במקומו, עבור מיד לחלון התיקון בתוכנת התיקון-clamp והתאם את פוטנציאל ההחזקה בין שלילי 50 לשלילי 60 מילי-וולט. אפס את הקיבול המהיר המורכב על ידי פיפטת הזכוכית ועבור לחלון התא כדי להתחיל לנטר את התנגדות הגישה, אפס את קיבול הממברנה בתוכנת המגבר לאחר גישה מספקת. עבור לזרם clamp והתאם את הערך הנכון של הזרמים הקיבוליים המהירים של הפיפטה בחלון I-Clamp, ובדוק את פוטנציאל הממברנה המתקבל.לאחר מכן, כאשר התא מחובר היטב לרקמה עם פוטנציאל ממברנה מתחת ל-40 מילי-וולט שלילי, התחל את הקלטות הניסוי על פי פרוטוקול היצרן. ניתן להפעיל פוטנציאל פעולה בתת-קבוצה של תאי יותרת המוח באמצעות זריקות זרם של חמישה עד תשעה פיקואמפר מפוטנציאל מנוחה בין שלילי 50 לשלילי 60 מילי-וולט. לפוטנציאל הפעולה הזה יש סיכום מהיר ולאחר כארבע עד שש דקות, פוטנציאל הפעולה המופעל כבר לא ניתן להשיג.במעבר לתצורת התיקון המחורר באמצעות Amphotericin B, ניתן לצפות בפוטנציאל פעולה ספונטני בכ-50% מהתאים המוקלטים וניתן להפעיל את פוטנציאל הפעולה ב-95% מהתאים הללו ללא סקירה נצפית, גם לאחר עד שעה של הקלטות. גונדוטרופין משחרר הורמון אחד, נשיפה הנפלטת לתאים בתצורת התיקון המחורר חושפת תגובה דו-פאזית, שבמהלכה התאים מקוטבים יתר על המידה בשלב הראשון של התגובה וכתוצאה מכך שחרור סידן מהמאגרים הפנימיים ואחריו דה-פולריזציה של התאים ותדירות ירי פוטנציאלית פעולה מוגברת מהרץ אחד עד שניים לשלושה הרץ בשלב השני. בזמן שאתה מנסה את ההליך הזה, חשוב לזכור שכל הפתרונות צריכים להיות מותאמים לפיזיולוגיה של האורגניזם הניסיוני שבו אתה משתמש, במקרה זה, מדקה, ואתה צריך לשים לב במיוחד ל-pH מכיוון שערך זה משתנה בין מינים החיים בטמפרטורות שונות.

healthy-brain-pituitary-slices-for-electrophysiological

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

אנו משתמשים בטכניקה תיקון-clamp למדוד GABA המופעל יחיד ערוץ זרמים (GABAA ערוצים, קולטנים GABAA) לבין זרמים סינפטיים טוניק שהם מייצרים בנוירונים. הפעלת ערוצי פוחתת רגישות עצבית בבריאות...

GABA המופעל זרמים ערוץ בודד וטוניק פרוסות המוח עכברוש

כאן אנו מתארים פרוטוקול להכנת אגר, מוטבע פרוסות רשתית המתאימים electrophysiology ו Ca2 + הדמיה. שיטה זו מאפשרת ללמוד סרט מסוג הסינפסות microcircuits הרשתית באמצעות תיקון ישיר, מהדק הקלטות של אחד מסופי העצב presynaptic.

Patch-clamp מדידות קיבול ו Ca 2 + הדמיה על מסופי עצב יחיד ב Slices רשתית

בסרטון הזה, נדגים כיצד להקליט פעילות חשמלית מתא עצב בודד שזוהה בכל הכנת מוח, השומרת על מעגלים עצביים מורכבים. אנו משתמשים בדג מהונדס שבי גונדוטרופין משחרר הורמון (GnRH) נוירונים מתויגים גנטי בחלבון פלואורסצנטי לזיהוי בהכנת המוח השלמה.

הקלטת פעילות חשמלי מתא העצב מזוהה במוח שלם של דג מהונדס

מתוארים נהלים לביצוע הקלטות בו זמנית של פוטנציאל הממברנה או זרם ושינויים בריכוז הסידן התוך תאי. נוירוני גרעין סופרכיאזמטיים ממולאים במחוון הסידן ביס-פורה-2 באמצעות אלקטרודת מהדק טלאי בכל תצורת מהדק התיקון של התא.

אלקטרו הקלטה בו זמנית ובסידן הדמיה של suprachiasmatic גרעין נוירונים

מאמר זה מתאר כיצד יכול להיות משותק דג הזברה מבוגר, מחוברת לצינורות, ומשמש לניסויי in vivo אלקטרו לאפשר הקלטות ומניפולציה של פעילות עצבית בבעלי חיים בשלמותה.

הקלטת אלקטרו במוח של דג הזברה למבוגר שלמה

כאן נתאר פרוטוקול להכין ולשמור על תרביות תאים יותרת המוח הראשי של medaka (Oryzias latipes). תנאי ממוטבת פרוטוקול זה להתחשב פרמטרים חשובים כגון טמפרטורה, osmolality ו- pH מאת לחקות את התנאים הפיזיולוגיים של הדג, ובעקבותיו פיזיולוגית משמעותי יותר תוצאות.

הכנה של תרבות התא העיקרי באיכות גבוהה של דגים Pituitaries

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים להכנת פרוסות מוח חריפה המכילים את הגרעין הגנוקה לרוחב ואת החקירה אלקטרופיסיולוגית של הפונקציה retinogeniculate ותפקוד הסינפסות. פרוטוקול זה מספק דרך יעילה לחקר הסינפסות עם שחרור גבוה והסתברות נמוכה של שחרור באותן פרוסות מוח חדות.

החקירות האלקטאליות של הפונקציה Retinogeniculate ו Corticogeniculate סינפסה

המאמר מתאר פרוטוקול מהיר לתיוג כלי דם בדגים teleost על ידי זלוף הלב של dii מדולל בתיקונים, באמצעות מסדר (oryziasלטיפס) כמודל והתמקדות במוח ובבלוטת יותרת השומן.

הוספת תוויות של כלי דם במוח Teleost ואת בלוטת היותרת שימוש בפרזיה לב עם DiI-fixative

טכניקה אלחוטית הרומן עבור הקלטת אותות עצביים מן המוח של שחייה בחופשיות הזהב מוצג. המכשיר מורכב משני tetrodes, מיקרודרייב, לוגר מידע עצבי, ומקרה עמיד למים. כל החלקים מותאמים אישית למעט לוגר הנתונים והמחבר שלו.

הקלטה אלקטרופיסיולוגית של הנוירונים על ידי להזזה Tetrodes בחינם שחייה דגים

הפרוטוקול המוצג מתאר את ההובלה וההכנה של רקמת היפוקמפוס אנושית חתוכה במטרה האולטימטיבית להשתמש פרוסות מוח חיוניות ככלי הערכה פרה-קרטילי עבור חומרים אנטי אפילפטיים פוטנציאליים.

הכנת פרוסות היפוקמפוס אנושיות חריפות להקלטות אלקטרופיזיולוגיות

חקור תקשורת תאית בנוירואנדוקרינולוגיה באמצעות פרוסות מוח-יותרת המוח מדגי מדקה Oryzias latipes. השיטה משלבת patch-clamp perforated לרישום פעילות חשמלית של תאי יותרת המוח בסביבה פיזיולוגית שלמה.

פרוסות המוח, יותרת המוח בריא לחקירות אלקטרופיזיולוגיות של תאים יותרת המוח בדגים Teleost

גלה סרטונים נוספים