בידול, תחזוקה, וניתוח תאים אפיתל הפיגמנט ברשתית אנושי: מודל המחלה-ב--תבשיל BEST1 מוטציות

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום מחלות רשתית הקשורות לתעלת יונים לגבי המנגנונים המולקולריים של מוטציות BEST1 ופתולוגיה של בסטרופינופתיות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא עוקפת את הקושי בהשגה ישירה של תאי RPE מבני אדם. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול בבסטרופינופתיות, כולל מחלת בסט, שכן תאי RPE יכולים לשמש הן למטרות מחקר והן לטיפולים בהחלפת תאים.

כאשר תרבית hPSC מגיעה למפגש, החלף את מדיום התרבות בארבעה מיליליטר של מדיום התמיינות לכל באר של צלחת של שש בארות. לאחר שבועיים של תרבית, השלם את מדיום ההתמיינות ב-100 ננוגרם למיליליטר של אקטיבין-A אנושי, והחלף את המדיה התוספת שלוש פעמים בשבוע למשך 14 ימים נוספים. ביום ה-29, עברו למדיום התמיינות ללא תוספת למשך שמונה עד 10 שבועות נוספים עד להופעת אשכולות תאי RPE פיגמנטיים.

כדי לבודד את תאי ה-RPE הפיגמנטיים, החזיקו תחילה פיפטות פסטר זכוכית בודדות בגודל תשעה אינץ' אופקית מעל הלהבה של מבער בונסן כשני שליש לאורך החלק הדק של הפיפטה. כאשר הזכוכית המחוממת הופכת רכה, משוך במהירות את שני הקצוות זה מזה ליצירת קצה דמוי מגרד בקצה החדש של הפיפטה. רססו את הפיפטות המשוכות באתנול 70% ותנו להן להתייבש באוויר במכסה תאים.

כאשר הפיפטות מוכנות, שטפו כל באר של תרבית ההתמיינות עם PBS והוסיפו מיליליטר אחד של 0.05% טריפסין בתוספת יחידה אחת למיקרוליטר קולגנאז לכל באר. לאחר 20 עד 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, עצרו את העיכול עם שני מיליליטר של מדיום RPE של 37 מעלות צלזיוס לכל באר של צלחת של שש בארות והניחו את הצלחת על במת מיקרוסקופ. בעזרת פיפטה משוכה, הקש בעדינות על אשכולות RPE פיגמנטיים.

ברגע שהתאים מתנתקים מתחתית הבאר, השתמש במיקרופיפטה של 20 מיקרוליטר כדי להעביר תאים מנותקים לבארות בודדות של צלחת תרבית תאים חדשה המכילה מדיום RPE. כאשר נוספו כ-5,000 תאי RPE לכל באר של צלחת של 12 בארות, הביאו את הנפח הסופי לשני מיליליטר עם מדיום RPE טרי ותרבו את תאי ה-hPSC-RPE המבודדים למשך שישה עד שמונה שבועות נוספים עד שנצפתה שכבה אחת של תאי RPE בוגרים פיגמנטיים וצורת אבן. 24 עד 72 שעות לפני מהדק התיקון, שטפו את התאים החד-שכבתיים הפיגמנטיים בשני מיליליטר PBS, ולאחר מכן, לאחר הסרת ה-PBS, הוסיפו מיליליטר אחד של 0.05% טריפסין בתוספת יחידה אחת למיקרוליטר קולגנאז לתאים בכל באר של צלחת של 12 בארות לתקופת דגירה של שמונה דקות ב-37 מעלות צלזיוס.

כאשר התאים מתחילים להתנתק, השתמש במיקרופיפטה של מיליליטר אחד כדי לשטוף בעדינות את התאים מתחתית הבאר ולאגד את מתלה התאים לצינור חרוטי של 15 מיליליטר. הוסף לבאר מיליליטר אחד של תמיסת טריפסין-קולגנאז של 37 מעלות צלזיוס. דגרו עוד שמונה דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס, ואז שטפו את כל התאים שנותרו מתחתית הבאר ושלבו את תרחיף התאים לאותו צינור חרוטי של 15 מיליליטר.

דגרו על התאים באמבטיה יבשה של 37 מעלות צלזיוס למשך שמונה דקות, ולאחר מכן השתמשו במיקרופיפטה של מיליליטר אחד כדי לשלש בעדינות את התאים 10 עד 15 פעמים. לאחר דגירה וטריטורציה של התאים פעמיים נוספות, הוסף חמישה מיליליטר של מדיום RPE של 37 מעלות צלזיוס לתרחיף התא הבודד וגלול את התאים על ידי צנטריפוגה. השעו מחדש את הגלולה בנפח המתאים לזריעה על צלחות מצופות מראש עם החלקות כיסוי במפגש של 10 עד 20% ובצעו מהדק תיקון של תא שלם על פי פרוטוקולים סטנדרטיים.

לאחר בידוד מוצלח, יותר מ-90% מהתאים באוכלוסיית מעבר האפס אמורים להבשיל כדי להציג את מורפולוגיה של תאי RPE החתימה. עם גישת המחלה בצלחת המבוססת על hPSC-RPE, ניתן לאפיין באופן מקיף כל מוטציה ב-BEST1 הספציפית לחולה עבור ביטוי החלבון שלה, סחר בממברנה ותפקוד תעלת היונים כדי להשיג מידע קריטי להבהרת מנגנונים פתולוגיים של RPE. יש לציין שחלק מהמוטציות ב-BEST1 עשויות להשפיע על ביטוי החלבון שלו, ולכן יש לבדוק גם סמני RPE מבוססים אחרים.

התמיינות תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים RPE אורכת שלושה עד שישה חודשים, תלוי בקו תאי הגזע הפלוריפוטנטיים האנושיים ובסוג המוטציה, וניתן להשלים את הבידוד של התאים הפלוריפוטנטיים האנושיים הממוינים תוך שעתיים אם הוא מבוצע כראוי. בזמן שמנסים לפצל את התאים עבור מהדק הטלאי, חשוב לזכור לשבש את התאים בעדינות רבה כדי למנוע מוות עודף של תאים. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו תרבית תאי RPE תלת מימדית כדי לענות על שאלות נוספות לגבי האופן שבו הובלת יונים על הממברנות האפיקליות והבסיסיות של תאי RPE מושפעת ממוטציות BEST1.

לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום המחלות הניווניות של הרשתית לחקור את הפנוטיפים הפיזיולוגיים והמנגנונים הפתולוגיים של תאי RPE שמקורם בחולה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד להבדיל תאי גזע פלוריפוטנטיים לתאי אפיתל פיגמנט ברשתית ולהכין את תאי ה-RPE למהדק תיקון של תא שלם.