Name: מידה נוקשות של סובסטרטים סיליקון רך Mechanobiology מחקרים באמצעות מיקרוסקופ זריחה Widefield (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: למדו למדוד את מודול יאנג של סובסטרטים סיליקון רכים באמצעות מיקרוסקופ זריחה widefield. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לחקור תגובות תאים לקשיחות סובסטרט במכנוביולוגיה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים מרגרט גרדל בנדיבות להתרת השימוש rheometer. אנו להכיר תמיכה של NIH (1R15GM116082) שיאפשרו עבודה זו.

1. ייצור של מצע סיליקון רך
<ol><li>שוקלים לצאת 1.75 גרם של רכיב ה-A ו- g 1.75 של רכיב ה-B (A:B = 1:1) אלסטומר סיליקון רך הערכה באמצעות (פוליסטירן) במשקל של מגשים.</li>
	<li>הוסף את הרכיב A אל רכיב B במגש במשקל ומערבבים אותם יחד במשך 5 דקות באמצעות מקל של המוליך המתאים.</li>
	<li>להוסיף את התערובת מעל 35 מ מ פטרי. לאפשר את התערובת נמרח על פני הפטרי לכמה דקות. הערה: הבחירה של קוטר צלחת פטרי ואת מידת סיליקון רך יקבע את עובי סיליקון רך. . כאן, העובי יהיה בסביבות 3.5 mm; עוד על בחירת העובי elastomer במקטע דיון .</li>
	<li>מקם את צלחת פטרי עם התערובת סיליקון, עם המכסה, תא ואקום למשך 15 דקות להסיר את כל בועות האוויר. במהלך תקופה זו, מראש בחום תנור ל 70 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>ברגע הכיריים מגיע ל- 70 מעלות צלזיוס, במקום זכוכית על זה ולאחר מכן מקם את צלחת פטרי עם התערובת סיליקון בשקופית זכוכית. תן שהסיליקון התרופה ב 70 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. אין למקם את המנה פוליסטירן ישירות על הכיריים, כפי הפטרי עלול להמיס.</li>
</ol>2. צימוד של פלורסנט. גרגרי כדי שהסיליקון רך
<ol><li>מקום של סיליקון רך נרפא (בצלוחית הפטרי חשפו) תא UV עמוק (מארז עם מנורת UV עמוק של אורכי גל אור של 185 ו- 254 ננומטר). לחשוף את הדגימה סיליקון רך (~ 5-10 ס מ מן המנורה UV) עמוק אולטרא סגול במשך 5 דקות.<ol>
<li>בעוד שהסיליקון הוא נחשף לאור UV עמוק, להמשיך עם שלבים 2.2-2.6 להלן. לאחר החשיפה UV עמוק, דגה תא UV עמוק למשך לפחות 5 דקות לפני מאחזר את הדגימה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>בינתיים, שוקל את 19 מ"ג של 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) צינור microcentrifuge 1.5 mL ולהוסיף 500 μL של מים מים יונים (די) זה. להמיס את EDC ע י ניעור בעדינות את הצינור.</li>
	<li>בשפופרת microcentrifuge mL 1.5 נפרדים, שוקל את 11 מ"ג של N- hydroxysulfosuccinimide (sulfo-NHS), להוסיף לו 500 μL DI מים, להמיס sulfo-בקופת חולים ע י ניעור בעדינות את הצינור. לאחר מכן, לשלב את הפתרונות EDC, sulfo-NHS צינור microcentrifuge יחיד.</li>
	<li>זה פתרון EDC/sulfo-NHS, להוסיף 30 μL של 0.44 μm קוטר אדום (או כל צבע פלורסצנטיות אחר המבוסס על קוביות המסנן זמין המיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית) carboxylate שונה פלורסנט. גרגרי (עם ריכוז w/v 1% מניות).</li>
	<li>לתערובת EDC/sulfo-NHS/חרוז, להוסיף 0.02 נקודות מ ג של קולגן אני (מתוך זנב החולדה, ריכוז מניות של 4 מ ג/מ ל חומצה אצטית מ' 0.02 נקודות) בריכוז של-0.02 נקודות מ"ג/מ"ל.</li>
	<li>מערבולת EDC/NHS/חרוז/הקולגן אני תערובת בקצרה על מנת להבטיח כי החרוזים הם שווה הפזורים, לפני צימוד.</li>
	<li>פיפטה 1 מ"ל של EDC/NHS/חרוז/הקולגן אני תערובת על חתיכה של מצלמות-מיקרוסקופים הממוקמת מעל המכסה שטוח רדוד, אחרת (של קוטר קטן יותר). היפוך על צלחת פטרי עם סיליקון רך על תערובת זו כך משטח סיליקון רך יוצר קשר עם התערובת אך אינו נוגע ישירות השטח של המכסה פטרי קטן למטה. כדי להעלות את צלחת פטרי הפוכה, השתמש שקופיות זכוכית אחד או שניים מתחת צדי קפיציות פטרי הפוכה. הערה: נא עיין באיור 1 כדי לראות איך מתבצע שלב 2.7.</li>
	<li>מכסה את הדגימה ברדיד אלומיניום, דגירה זה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.</li>
	<li>הסר את צלחת פטרי עם סיליקון רך והנח אותו זקוף (סיליקון-צד למעלה).</li>
	<li>לשטוף את משטח סיליקון רך עם באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) על-ידי הוספת 2 מ"ל ל- PBS (pH 7.4) למנה. . תן לזה לנוח לכמה דקות. מחוק לגמרי טוב, מגניב ולשטוף שהסיליקון שוב עם 2 מ"ל ל- PBS. תן סיליקון תרופה נוספת ביום. מסיבה זו, מקום המדגם סיליקון רך PBS ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.</li>
</ol>3. מדידה של נוקשות סיליקון עם כדור כניסה באמצעות מיקרוסקופ זריחה Widefield
<ol><li>אחזר את צלחת פטרי עם סיליקון רך וודא שהיא מכילה לפחות 1 מ"ל של PBS יש משטח סיליקון מספר מ מ מתחת לפני השטח נוזלי.</li>
	<li>באמצעות פינצטה מחודדת, ירידה חמש 1 מ"מ זירקוניום כדור indentors על שהסיליקון רך. לטבול את הכדורים לתוך המדיום הנוזלי ושחרר אותם, מן הקצוות של השכבה סיליקון, לפחות 5 קטרים indentor מן המיקום של indentors אחרים. הערה: כאשר ירד מעל פני השטח נוזלי, הספירות עלולים להיכשל להזין את המדיום הנוזלי (float) עקב מתח הפנים של המדיום הנוזלי.</li>
	<li>המקום של צלחת פטרי עם סיליקון רך על הבמה מיקרוסקופ כך אפשר תמונה דרך הפטרי הבסיס.</li>
	<li>באמצעות הדמיה שלב עם מטרה X 10 (כגון יבש 10 X אובייקטיבית של נה 0.30), אתר ולהביא indentor sphere להתמקד.</li>
	<li>תמונת שלב של חלק או את כל indentor ולשמור את התמונה הזו. השתמש סריקה אריח אם זמין. אם indentor יש פגמים גלויים, למחוק ולהחליף אותו עם indentor אחרת.</li>
	<li>תחת הדמיה שלב חיה, פאן עד לקצה של indentor כך הקצה השמאלי של המסגרת היא לפחות למרחק של ~1.5 R מהמרכז indentor. ודא כי מרכז indentor נשאר גלוי בצד ימין, קרוב לקצה הימני של המסגרת התמונה. קחו תמונת שלב ולשמור אותו.</li>
	<li>לעבור מקור האור מיקרוסקופ התאורה עבור הערוץ ניאון אדום. עם x- ו - y-המוקד קואורדינטות ללא שינוי (ה- x-y המיקום של המרכז indentor בתוך אבל סמוך לשוליים הימניים של המסגרת), למטה (ירידה Z) עד גרגרי ניאון אדום תחת המרכז של indentor כדור פשוט ללכת מחוץ לפוקוס.</li>
	<li>קח z-מחסנית עם תמונה עבור כל z קבועה של 0.5 מיקרומטר עד גרגרי בשכבה העליונה של שהסיליקון רחוק indentor (ליד הקצה השמאלי של מסגרת הדמיה) לצאת משליטה.</li>
	<li>חזור על שלבים 3.4-3.8 עם indentors אחרים על הדגימה.</li>
</ol>4. חישוב הנוקשות של הסיליקון (מודול האלסטיות)
<ol><li>פתחו את התמונה שלב של indentor באמצעות ImageJ, לחץ על הכלי קו, ומדידת הקוטר של indentor פיקסלים. לחץ והחזק בנקודה בקצה indentor, להזיז את הסמן על נקודת ההפוך לחלוטין על הקצה ורשום את האורך בפיקסלים המוצג בשורת המצב של החלון הראשי ImageJ לפני שחרור הסמן.<ol>
<li>להבטיח כי יחידת אורך מוגדר פיקסלים על ידי לחיצה נתח | לקבוע קנה מידה ובדיקת יחידת אורך.</li>
		<li>להמיר ברדיוס של indentor פיקסלים μm תוך התחשבות ההגדלה אובייקטיבית ואת גודל פיקסל מצלמה CCD (R ב μm = R בפיקסלים x גודל פיקסל מצלמה CCD μm / ההגדלה אובייקטיבית).</li>
	</ol>
</li>
	<li>לפתוח ערוץ אדום z-הערימה של תמונות microbead (אם גרגרי פלורסנט אדום) ב- ImageJ על ידי לחיצה על קובץ | ייבוא | תמונה רצף ובחר כל תמונה במחסנית ולחץ על אישור כדי לפתוח את המחסנית. הערה: F1 הוא מספר מסגרת שבה גרגרי תחת המרכז indentor יש המוקד האפשרי הטוב ביותר, F2 הוא המספר מסגרת שבה גרגרי (ליד אזור ~1.5 R מהמרכז חרוז) ליד הקצה השמאלי של המסגרת הם בפוקוס האפשרי הטוב ביותר. Z-ההבדל בין שתי המסגרות אלפא עומק הכניסה.<ol>
<li>שימוש בכלי קו ב- ImageJ, לצייר קו לרוחב microbead מוגדרים היטב בתמונה. לחץ על לנתח | מגרש פרופיל ולחץ על הכפתור Live כדי להשיג את עוצמת סריקת קו מעודכן על פני החרוז בעת בחירת מסגרות שונות. ניתן לבחור את המסגרת שנותן את הערך הגבוה ביותר של העוצמה המקסימלית כמסגרת בפוקוס.</li>
		<li>מאחר z-התוספת בין המסגרות במחסנית z 0.5 μm, לחשב את עומק כניסה μm כמו אלפא = (F2-F1) x 0.5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לחשב את הכוח שהופעל על הג'ל על ידי indentor עקב משקלו (מינוס מנוגדות קליל הכוח), כלומר, כניסת כוח F, כמו הנפח של indentor x (צפיפות indentor - הצפיפות של המדיום הנוזלי) x ההאצה בשל כוח המשיכה. השתמש המשוואה F = (4/3) x 3.142 x (R3) x (ρindentor - ρבינוני) x g כאשר R הוא רדיוס indentor, ρindentor היא הצפיפות של indentor, ρבינוני היא הצפיפות של המדיום הנוזלי, g זה כוח הכבידה (9.81 מ'/ש'2). מבטאים את כל הכמויות בצד ימין ביחידות SI לקבל F (N).</li>
	<li>לחשב האלסטיות (E) של שהסיליקון משתמש ששונה11 הרץ דגם12 המשוואה: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57797/57797eq1.jpg"> איפה: c = גורם תיקון משנה הרץ דגם הביטוי הבא; v = פואסון של הג'ל סיליקון (נלקח כ- 0.5 לגבי חומרים וחישובים7); F = חיל כניסה; R = רדיוס indentor; ו אלפא = כניסה לעומק. לבטא את כל הכמויות בצד ימין ביחידות SI לקבל E בהרשות הפלסטינית.<ol>
<li>לחשב את תיקון גורם c כמפורט להלן3: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57797/57797eq2.jpg"> איפה: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/57797/57797eq3.jpg"> <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/57797/57797eq4.jpg">; ו <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/57797/57797eq5.jpg">. יצוין, כי פקטור התיקון הזה הוא במיוחד כדי לשמש רק כאשר שהסיליקון רך לאנאפוליס טוב צלחת פטרי (או סיליקון נוקשה) מתחתיו (וזה המקרה כאן).</li>
		<li>לחשב את גובה h של שכבת סיליקון רך המבוסס על הסכום של סיליקון הוסיף את קוטר צלחת פטרי. לחלופין, לקבל h ישירות על-ידי קביעת הקואורדינטה z של משטחים עליונים ותחתונים של שכבת סיליקון על ידי הדמיה שלב (זיהומים קלים באים להתמקד גם פני השטח). שימו לב כי עבור ה גדול (h2 &gt; Rδ), פקטור התיקון c הוא קרוב ל- 1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>חזור על הצעדים 4.1-4.4 כל indentor. ממוצע מודול האלסטיות המתקבל בכל indentor כדי להשיג מתכוון האלסטיות עבור המדגם סיליקון.</li>
</ol>

<ol><li>Handorf, A. M., Zhou, Y., Halanski, M. A., Li, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+stiffness+dictates+development%2C+homeostasis%2C+and+disease+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Organogenesis%22%5BJournal%5D)">Tissue stiffness dictates development, homeostasis, and disease progression.</a> Organogenesis. 11 (1), 1-15 (2015).</li>
<li>Pelham, R. J., Wang, Y. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+locomotion+and+focal+adhesions+are+regulated+by+substrate+flexibility%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (25), 13661-13665 (1997).</li>
<li>Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+movement+is+guided+by+the+rigidity+of+the+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Cell movement is guided by the rigidity of the substrate.</a> Biophysical Journal. 79, 144-152 (2000).</li>
<li>Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+cells+feel+and+respond+to+the+stiffness+of+their+Substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue cells feel and respond to the stiffness of their Substrate.</a> Science. 310, 1139-1143 (2005).</li>
<li>Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyacrylamide+hydrogels+for+cell+mechanics%3A+steps+toward+optimization+and+alternative+uses%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses.</a> Methods in Cell Biology. 83, 29-46 (2007).</li>
<li>Johnston, I. D., McCluskey, D. K., Tan, C. K. L., Tracey, M. C. <a target="_blank" href="http://iopscience.iop.org/article/10.1088/0960-1317/24/3/035017/meta">Mechanical characterization of bulk Sylgard 184 for microfluidics and microengineering.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 24 (3), 035017(2014).</li>
<li>Style, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+force+microscopy+in+physics+and+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Traction force microscopy in physics and biology.</a> Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).</li>
<li>Lee, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+the+cytoplasmic+domain+of+N-cadherin+reduces%2C+but+does+not+eliminate%2C+traction+force-transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Deletion of the cytoplasmic domain of N-cadherin reduces, but does not eliminate, traction force-transmission.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 478 (4), 1640-1646 (2016).</li>
<li>Frey, M. T., Engler, A., Discher, D. E., Lee, J., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopic+methods+for+measuring+the+elasticity+of+gel+substrates+for+cell+culture%3A+microspheres%2C+microindenters%2C+and+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microscopic methods for measuring the elasticity of gel substrates for cell culture: microspheres, microindenters, and atomic force microscopy.</a> Methods Cell Biol. 83, 47-65 (2007).</li>
<li>Lee, D., Rahman, M. M., Zhou, Y., Ryu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+confocal+microscopy+indentation+method+for+hydrogel+elasticity+measurement%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional confocal microscopy indentation method for hydrogel elasticity measurement.</a> Langmuir. 31 (35), 9684-9693 (2015).</li>
<li>Dimitriadis, E. K., Horkay, F., Maresca, J., Kachar, B., Chadwick, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+elastic+moduli+of+thin+layers+of+soft+material+using+the+atomic+force+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Determination of elastic moduli of thin layers of soft material using the atomic force microscope.</a> Biophysical Journal. 82 (5), 2798-2810 (2002).</li>
<li>Hertz, H. <a target="_blank" href="https://www.degruyter.com/view/j/crll.1882.issue-92/crll.1882.92.156/crll.1882.92.156.xml">Über die Berührung fester elastischer Körper.</a> Journal für die reine und angewandte Mathematik. 92, 156-171 (1882).</li>
<li>Azioune, A., Carpi, N., Tseng, Q., Théry, M., Piel, M. Protein micropatterns: a direct printing protocol using deep UVs. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0091679X10970088">Microtubules: In Vivo</a>. Cassimeris, L., Tran, P. , Academic Press. Burlington, San Diego. 133-146 (2010).</li>
<li>Bashirzadeh, Y., Qian, S., Maruthamuthu, V. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0924424717321118">Non-intrusive measurement of wall shear stress in flow channels.</a> Sensors and Actuators A: Physical. 271, 118-123 (2018).</li>
<li>Muhamed, I., Chowdhury, F., Maruthamuthu, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+tools+to+study+cellular+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineering+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Biophysical tools to study cellular mechanotransduction.</a> Bioengineering (Basel). 4 (1), 12(2017).</li>
<li>Dumbali, S. P., Mei, L., Qian, S., Maruthamuthu, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+sheet-averaged+tension+within+a+large+epithelial+cell+colony%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Endogenous sheet-averaged tension within a large epithelial cell colony.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 139 (10), 101008(2017).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

בעוד השיטה כניסה פרנה קלה לביצוע, תשומת לב רבה ישולם הבחירה של indentor ואת העובי של המדגם סיליקון רך. המשוואה לחישוב מודול האלסטיות הוא חוקי תחת תנאים11, אלה הם בדרך כלל מרוצה כאשר העובי של המדגם סיליקון > 10% של הרדיוס indentor ו < ~ 13 x רדיוס indentor. מצאנו כי סיליקון עובי של 5-10 x רדיוס indentor היה בחירה טובה, שבה העובי מדגם אינה גבוהה מדי (כלומר, המרחק עבודה אובייקטיבית אינה הולמת מגבלה) ואת הקשיחות מחושב היה גם לא רגיש מדי הערך המדויק של עובי סיליקון. הבחירה של כדורי indentor צר...

תאים ברקמות רכות לשכון בסביבת מיקרו-נוקשות של מי זה קילו פסקל טווח1, בניגוד מנות תרביות רקמה נוקשות של מי הוא במספר סדרי גודל גבוה יותר. הניסויים הראשונים עם תאים מצופים חלבון מצעים רכים מטריצה חוץ-תאית הראה כי הקשיחות המצע השפעות כמה תאים הלאה וכן לדבוק מטריצות מתחת2,3. למעשה, הקשיחות המצע משפיעה באופן מהותי את הפונקציה תא4 באופן דומה על אותות ביוכימיים נרחבת. ג'לים לזיהוי (מצופה עם מטריצה חוץ-תאית חלבונים) הם (המגובש מים) hydrogels כי שימשו בהרחבה כתא תרבות מצעים עבור mechanobiology מחקרים5. Polydimethylsiloxane (PDMS), שהסיליקון הנפוץ ביותר (ששינינו), כבר בשימוש נרחב כמו סיליקון נוקשה עם נוקשות מגה פסקל-טווח עבור ייצור בקנה מידה מיקרון6. יותר לאחרונה, סיליקון רך מצעים עם נוקשות בטווח קילו פסקל רלוונטי יותר מבחינה פיזיולוגית יש כבר מועסקים בשם דיאלקטריים תרבות תא mechanobiology מחקרים7,8.
מספר שיטות השתמשו כדי למדוד את הנוקשות של מצעים גמיש, כולל מיקרוסקופ כוח אטומי, דפורמציה מאקרוסקופית של כל הדגימות על מתיחות, rheology וכניסה באמצעות כדורים והודיע כדורית microindentors9 . בעוד כל טכניקה יש יתרונות וחסרונות משלה, כניסה עם כדור היא שיטה פשוטה במיוחד אך מדויק למדי כי רק מחייב הגישה אל המיקרוסקופ זריחה widefield. כניסה עם כדור מתכתי שימש כדי למדוד את הנוקשות של hydrogels9,3,מוקדמת עבודה10. עבודה מוקדמת הראו את החשיבות של קשיחות המצע תא לתנועה מנוצל שיטה זו כדי לקבוע הידרוג המצע נוקשות3. לאחרונה, מיקרוסקופיה קונפוקלית שימש גם אפיון אלגנטי10.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול צעד אחר צעד להכנת מצע סיליקון רך, צימוד חרוזים פלורסנט (וחלבון מטריצה חוץ-תאית כמו קולגן אני) רק כדי המשטח העליון, הדמיה של הספרה כניסות טקסט באמצעות משטח עליון שלב ו קרינה פלואורסצנטית הדמיה, בהתאמה, ולבסוף ניתוח התמונות כדי לחשב האלסטיות של המצע סיליקון. המצע סיליקון רך שהוכנו בצורה זו ניתן בקלות לניסויים מיקרוסקופ כוח המתיחה. השימוש של סיליקון נוקשה (במקום צלחת פטרי) כבסיס עבור שהסיליקון רך מאפשר גם מחקרים mechanobiology באמצעות רצועת חיצוניים. ובמידת הצורך להימנע סיבוכים אפשריים שיקולים מעשיים גם מצוינים.

<table><tbody><tr><td>CY 52-276 ערכת אלסטומר סיליקון A/B</td><td>&nbsp; Dow Corning</td><td>CY 52-276</td><td>חנות בטמפרטורת החדר</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Pierce EDC</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI22980</td><td>Store ב-20&deg; סי</td></tr><tr><td>תרמו סיינטיפיק&nbsp; פירס סולפו-NHS קרוסלינקר</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>PI-24510</td><td>חנות ב-4&deg; C</td></tr><tr><td>חלקיקים ורודים פלואורסצנטיים של קרבוקסיל, 0.4-0.6 ומיקרו; מ', 2 מ"ל</td><td>Spherotech, Inc.</td><td>CFP-0558-2</td><td>חנות ב-4&deg; ג, אין להקפיא</td></tr><tr><td>1.0 מ"מ חרוזי זירקוניום שטופים בחומצה</td><td>OPS Diagnostics LLC</td><td>BAWZ 1000-250-33</td><td></td></tr><tr><td>תא UV עמוק עם מפנה אוזון</td><td>Novascan Technologies, Inc.</td><td>PSD-UV4, OES-1000D</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי שדה רחב</td><td>Leica Microsystems</td><td>DMi8</td><td></td></tr><tr><td>Collagen I, מזנב חולדה</td><td>Corning</td><td>354236</td><td>ריכוז מלאי = 4 מ"ג/מ"ל; אחסן ב-4&deg; C</td></tr><tr><td>ImageJ-NIH</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>תוכנה נחלת הכלל</td></tr></tbody></table>

מידה נוקשות של סובסטרטים סיליקון רך mechanobiology מחקרים באמצעות מיקרוסקופ זריחה widefield

Stiffness Measurement of Soft Silicone Substrates for Mechanobiology Studies Using a Widefield Fluorescence Microscope

בדרך כלל, רקמות רכות בגוף האדם יש נוקשות בטווח קילו פסקל (kPa). בהתאם לכך, סיליקון, הידרוג סובסטרטים גמיש הוכחו להיות סובסטרטים שימושי עבור culturing בתאים microenvironment הפיזי המחקה חלקית תנאים ויוו . כאן, אנו מציגים פרוטוקול פשוט עבור אפיון מודולים של הצעירים של איזוטרופיות סובסטרטים אלסטי ליניארי משמש בדרך כלל עבור מחקרים mechanobiology. הפרוטוקול מורכב הכנת מצע סיליקון רך על צלחת פטרי או סיליקון נוקשה, ציפוי המשטח העליון של המצע סיליקון עם חרוזים פלורסנט, באמצעות כדור בקנה מידה מילימטר להכנסת המשטח העליון (על-ידי כוח הכבידה), הדמיה של פלורסנט חרוזים על משטח סיליקון עם כניסות באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות, וניתוח תוצאות תמונות כדי לחשב האלסטיות של המצע סיליקון. צימוד השטח העליון של המצע עם חלבון מטריצה חוץ-תאית מודולים (בנוסף החרוזים פלורסנט) מאפשר את המצע סיליקון לשמש בקלות יופיצ תא, מחקרים מאוחרים יותר באמצעות ניסויים מיקרוסקופ כוח המתיחה. השימוש סיליקון נוקשה, במקום צלחת פטרי, כבסיס של שהסיליקון רך, מאפשר את השימוש mechanobiology מחקרים שכללו מתח חיצוני. יתרון מסוים של פרוטוקול זה הוא מיקרוסקופ זריחה widefield, אשר זמין בדרך כלל במעבדות רבות, הציוד העיקרי הנדרש בהליך זה. נדגים לפרוטוקול זה על ידי מדידת האלסטיות של סובסטרטים סיליקון רך של מודולים שונים אלסטי.

באמצעות פרוטוקול שתוארו לעיל, אנו מוכנים סיליקון רך ב- 35 מ מ פטרי, ריפא אותו ב- 70 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, בשילוב גרגרי פלורסנט (קולגן אני) על פני השטח העליון כמו סכמטי מתואר באיור 1. UV עמוק שימש בעבר עבור החלבון בסופו של דבר צימוד סובסטרטים13. שים לב (I) התנאים לריפוי המשמש כאן הם הספציפי הזה סיליקון רך, (II) המדידה כניסה מבוצעת ביום הבא כצפוי סיליקון רך כדי לרפא קצת בהמשך במהלך יום.
<p class="jove_content" fo:keep-toget...

מצעים עם נוקשות ב קילו פסקל-הטווח שימושיות ללמוד תגובת התאים נוקשות סביבת מיקרו רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. שימוש רק מיקרוסקופ זריחה widefield, האלסטיות של ג'ל סיליקון רך יכול להיקבע באמצעות ההזחה עם כדור מתאים.

מידה נוקשות של סובסטרטים סיליקון רך Mechanobiology מחקרים באמצעות מיקרוסקופ זריחה Widefield

Soft tissues in the human body typically have stiffness in the kilopascal (kPa) range. Accordingly, silicone and hydrogel flexible substrates have been ...

ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לסווג סובסטרטים המשמשים לחקר תופעות מפתח במכניוביולוגיה, נדידת התאים והדור הראשון. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא דורשת שימוש במיקרוסקופ רחב שדה, ציוד שזמין בדרך כלל במעבדות רבות. ניתן ליישם שיטה זו כדי למדוד את מודול יאנג של סיליקון או ג'ל פוליאקרילאמיד, כמו גם כל אחד מהחומר האלסטי הליניארי האיזוטרופי הרך.המצע מוכן ומאופיין בשיטה זו יכול לשמש גם לניסויי מתיחה עצמית עם בסיס הסיליקון הנוקשה. כדי לייצר את מצע הסיליקון הרך לאחר שקלול של כ-1.75 גרם כל אחד מרכיבים A ו-B מערכת אלסטומר הסיליקון הרך, הוסף את רוב החלק השקול של רכיב A למגש השקילה של פוליסטירן רכיב B והשתמש במקל מוליך מתאים כדי לערבב את שני הרכיבים יחד למשך חמש דקות. מעבירים את התערובת לצלחת פטרי בגודל 35 מילימטר ומניחים למצע להתפשט באופן שווה על פני צלחת הפטרי למשך מספר דקות.לאחר מכן, הניחו את צלחת הפטרי בתא ואקום למשך 15 דקות כדי להסיר בועות אוויר ולחמם מראש פלטה חמה. כאשר הפלטה החמה מגיעה ל-70 מעלות צלזיוס, הניחו מגלשת זכוכית על הפלטה החמה, והניחו את צלחת הפטרי על צד הזכוכית. לאחר מכן, הניחו לסיליקון להתרפא ב-70 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.כדי לחבר את הסיליקון הרך עם חרוזי פלורסנט, הנח את הסיליקון הנרפא בתא UV עמוק, במרחק של חמישה עד עשרה סנטימטרים ממנורת ה-UV וחשוף את הדגימה לאור UV עמוק למשך חמש דקות. בזמן הטיפול בסיליקון, יש להמיס 19 מיליגרם של EDC ב-500 מיקרוליטר של מים נטולי יונים בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. ומערבל את הצינור כדי להמיס את הכימיקל.לאחר מכן, הוסף 500 מיקרוליטר של מים נטולי יונים ל-11 מיליגרם של סולפו-NHS בשפופרת שנייה של 1.5 מיליליטר. ומערבולת כדי להמיס את הכימיקל. לאחר מכן, שלב את תמיסות EDC ו-sulfo-NHS לצינור מיקרו-צנטריפוגה יחיד.כעת, הוסיפו לתערובת 30 מיקרוליטר של תרחיף מתאים של מיקרו-חרוזים מצומדים עם קרבוקסילט פלואורו-4 ו-0.02 מיליגרם של קולגן 1 זנב חולדה. לאחר מערבולת קצרה, הנח חתיכת פרפילם על מכסה שני בקוטר קטן יותר והעביר מיליליטר אחד מתערובת קולגן 1 חרוזי EDC-NHS לפרפילם. הפוך את צלחת הפטרי המכילה את הסיליקון הרך מעל התערובת, ותמך את המנה משני הצדדים בשתי שקופיות זכוכית, כך שמשטח הסיליקון הרך ייגע בתמיסת החרוזים מבלי לגעת ישירות במשטח המכסה בקוטר הקטן יותר שמתחת.לאחר מכן, כסו את הדגימה בנייר אלומיניום למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, לפני שטיפת הסיליקון פעמיים, עם שני מיליליטר PBS לכל שטיפה ותנו לסיליקון להתרפא זקוף בשני מיליליטר PBS טרי ב-37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת בבוקר, השתמש בפינצטה מחודדת כדי לעטוף שקעים כדוריים של חמישה מילימטר זירקוניום על הסיליקון הרך מתחת למיליליטר אחד לפחות של PBS הרחק מקצוות שכבת הסיליקון ולפחות חמישה קוטר שקעים ממיקום החריצים האחרים. לאחר מכן, הנח את צלחת הסיליקון הרך על שלב מיקרוסקופ בעל שדה רחב והשתמש במטרה פי 10 כדי לקבל תמונת פאזה של שקע שלם ללא פגמים גלויים.לאחר שמירת התמונה, בחר את הערוץ הפלואורסצנטי המתאים להמחשת המיקרו-חרוזים הפלואורסצנטיים. כאשר מרכז הכניסה קרוב לקצה הימני של המסגרת, הקטן את קואורדינטות ה-z עד שהמיקרו-חרוזים הפלואורסצנטיים מתחת למרכז הכדור יוצאים מהמיקוד. לאחר מכן, רכשו מחסנית z עם תמונה עבור כל תוספת z של 0.5 מיקרומטר עד שהמיקרו-חרוזים בשכבה העליונה של הסיליקון ליד הקצה השמאלי של מסגרת ההדמיה נכנסים ואז יוצאים מהמיקוד.כדי לחשב את קשיחות הסיליקון, ראשית, פתח את תמונת שלב הכניסה ב-ImageJ ולחץ על ניתוח והגדר קנה מידה ובדוק יחידת אורך כדי לאשר שהאורך מוגדר לפיקסלים. היעזרו בכלי קו, לחצו והחזיקו נקודה בקצה הכניסה, תוך הזזת הסמן לנקודה בקצה הנגדי בקוטר, כדי למדוד את קוטר הכניסה ולציין את האורך בפיקסלים בשורת המצב של החלון הראשי של ImageJ לפני שחרור הסמן. לאחר מכן, פתח את תפריט הקובץ ובחר ייבא רצף תמונות כדי לאפשר בחירת תמונה בערימת ה-z של תמונות מיקרו-חרוזים פלואורסצנטיים ולחץ על אישור כדי לפתוח את הערימה.בעזרת כלי הקו, צייר קו על פני מיקרו-חרוז מוגדר היטב בתמונה אחת ולחץ על נתח פרופיל עלילה בשידור חי כדי לקבל את עוצמת סריקת הקו המעודכנת על פני החרוז, תוך בחירת מסגרות שונות. לאחר מכן ניתן לבחור את המסגרת שנותנת את הערך הגבוה ביותר של העוצמה המקסימלית כמסגרת במיקוד. תמונות פלואורסצנטיות של המיקרו-חרוזים במשטח העליון של הסיליקון שצולמו במיקום מסגרת xy, ממקמות את האזור מתחת לשקע לצד הימני הקיצוני של המסגרת.לאחר מכן, האזור בקצה השמאלי של המסגרת נבחר כאזור המרוחק מהתוכנית. בקבוצה מייצגת זו של סריקות קווי עוצמה הנמדדות על פני מיקרו-חרוז יחיד, המיקוד משתנה במרווחי z של 0.5 מיקרומטר. לאחר מכן ניתן לבחור באופן אובייקטיבי את ערך ה-z המתאים לתמונה בפוקוס על סמך ערך ה-z המתאים לסריקת הקו בעוצמה המקסימלית הגבוהה ביותר.כאן, מודול יאנג של הסיליקון עבור יחסי תערובת שונים של רכיבי A:B, הושג על סמך השיטה כפי שהודגם זה עתה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין מצעי סיליקון רכים, לכסות אליהם את חרוזי הפלואורסצנט ולמדוד את קשיחות המצע באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בעל שדה רחב.

stiffness-measurement-soft-silicone-substrates-for-mechanobiology

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

אנו מציגים שתי עצמאית, מיקרוסקופ מבוססי כלים למדידת דפורמציות גרעיני cytoskeletal המושרה, תאים בודדים חיים חסיד בתגובה לבקשה מאמץ עולמי או מקומי. טכניקות אלו משמשות כדי לקבוע קשיחות גרעיני (כלומר, deformability) וכן לחקור העברת כוח תאיים בין הגרעין לבין cytoskeleton.

מבחני Biophysical לחקור את תכונות מכניות של גרעין התא שלבי הביניים: מסננים תשתית יישומים מניפולציה Microneedle

כאן אנו מתארים שיטה פשוטה ומהירה למדידת נוקשות תא. העיקרון הכללי של גישה זו הוא למדוד עיוות קרום בתגובה ללחץ שלילי מוגדר היטב ליישם באמצעות micropipette על פני התא. שיטה זו מספקת כלי רב עצמה כדי לחקור את התכונות של תאי מצע biomechanical-מצורפים.

שאיפת micropipette של תאי מצע מצורפים להערכת נוקשות סלולריות

מסמך זה מדגים פרוטוקול כדי לאפיין את התכונות מכאניות של תאי חיים באמצעות microindentation באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM).

מדידת התכונות המכאניות של תאי חיים באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

כאן מתוארת שיטה המאפשרת הכנה מהירה, יעילה וזולה של ג'לים פוליאקרילאמיד בפורמט צלחת מרובת בארות. השיטה אינה דורשת ציוד מיוחד וניתן לאמץ אותה בקלות על ידי כל מעבדת מחקר. זה יהיה שימושי במיוחד במחקר המתמקד בהבנת תגובות תאים תלויות נוקשות.

Multiwell הנוקשות Assay לחקר תגובות תא הנוקשת תלויות מבוסס polyacrylamide פשוטה

פרוטוקול הדמיה חדשני פותח באמצעות מפעיל מכני מונע מנוע מותאם אישית כדי לאפשר מדידה של תגובות בזמן אמת למתח מכני בתאים חיים. רלוונטית למכניוביולוגיה, המערכת יכולה ליישם זנים של עד 20% תוך שהיא מאפשרת הדמיה כמעט בזמן אמת עם מיקרוסקופ כוח קונפוקלי או אטומי.

הדמיה של תא חי במהלך מכאני למתוח

אנו מציגים פרוטוקולים מפורטים לבידוד אבי העורקים מעכבר ומדידת המודול האלסטי שלהם באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי.

מדידת הקשיחות של<em&gt; Ex Vivo</em&gt; עכבר Aortas באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

באמצעות התקן שתוכנן בעבר כדי להחיל זן מכני לתאים חסיד, נייר זה מתאר גיאומטריה תת שכבה מחדש מכשיר מותאם אישית עבור ברזולוציה גבוהה תא יחיד הדמיה של תאים מתוחים עם המטרה טבילה 100x שמן.

ברזולוציה גבוהה הדמיה של דינמיקה גרעינית בתאים חיים תחת מתיחה Uniaxial המתח

לאחרונה זיהינו התקשות נימי רשתית כפרדיגמה חדשה לתפקוד לקוי של הרשתית הקשור לסוכרת. פרוטוקול זה מפרט את השלבים לבידוד נימי הרשתית של עכבר והמטריצה התת-אנדותלית מתרביות אנדותל ברשתית, ולאחר מכן תיאור של טכניקת מדידת הנוקשות באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי.

בידוד נימי רשתית עכבר ומטריצת תת-אנדותל למדידת נוקשות באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

כאן, אנו מציגים מכשיר מתיחה שווה צירי רב-תכליתי המופעל פניאומטית ותואם למיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה.

מכשיר מתיחה שווה צירי למיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונפוקלית של תאים חיים בהגדלה גבוהה

עצמית התאספו monolayers (Sams) נוצר זמן alkane thiols על שרשרת זהב לספק מוגדרים היטב מצעים ליצירת דפוסי חלבון תא הכליאה. הדפסה Microcontact של hexadecanethiol באמצעות חותמת (PDMS) polydimethylsiloxane ואחריו למלא את משבצות עם גליקול, הסתיים alkane תיאול מונומר מייצר דפוס שבו חלבונים בתאים לספוג רק לאזור hexadecanethiol חותמת.

יצירת דו מימדי מצעים Patterned עבור החזקת חלבון ו-Cell

למדו למדוד את מודול יאנג של סובסטרטים סיליקון רכים באמצעות מיקרוסקופ זריחה widefield. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לחקור תגובות תאים לקשיחות סובסטרט במכנוביולוגיה.

מידה נוקשות של סובסטרטים סיליקון רך Mechanobiology מחקרים באמצעות מיקרוסקופ זריחה Widefield

גלה סרטונים נוספים