עלות נמוכה גמיש מערכת הידרופונית להערכת תגובות צמח מולקולות קטנות בתנאים סטריליים

מערכת הידרופוניקה חוץ גופית פשוטה, רב-תכליתית ובעלות נמוכה עברה אופטימיזציה מוצלחת, ואפשרה ניסויים בקנה מידה גדול בתנאים סטריליים. מערכת זו מאפשרת יישום כימיקלים בתמיסה וספיגתם היעילה בשורשים למחקרים מולקולריים, ביוכימיים ופיזיולוגיים. הראינו שמערכת זו יעילה ביותר בהשגת שתילים הומוגניים לאורך ההתפתחות הראשונית, כמו גם בהפרדת שורשים ונבטים באמצעות זרעי Arabidopsis thaliana.

הפריטים הבאים נחוצים לבניית מערכת ההידרופוניקה ולטיפוח צמחים בתנאים סטריליים ומבוקרים. 7% אתנול, 10% תמיסת אקונומיקה, פוליסורבט 20, מדיום MS כולל ויטמינים. MES מונוהידרט, אגר, אשלגן הידרוקסיד.

מכסה מנוע זרימה למינרית, פלטה חמה, תא גדילה. קופסאות פלסטיק חד פעמיות, כלי פטרי מזכוכית סטרילית, סרט דבק, קצות פיפט סטריליים של 200 ו-300 מיקרוליטר, מספריים, פיפט רב-ערוצי 300 מיקרוליטר, פיפט 200 מיקרוליטר, להב אזמל, פינצטה ומדפי קצה פיפט של 200 מיקרוליטר. זה חיוני שלקצה הפיפט שטוח יהיה שטח למילוי במדיום המוצק.

עקר את מתלי קצות הפיפט ללא כיסויים שישמשו כמיני טנקים בחיטוי בחום של 121 מעלות למשך 20 דקות. על מנת למנוע זיהום, כל החומרים שהוזכרו קודם לכן עוקרו בחיטוי. כאשר זה לא היה אפשרי, כמו במקרה של קופסאות הפלסטיק החד פעמיות, החומרים נוקו עם אתנול 7% לפני הכניסה לקולט האדים.

אם מכסה המנוע מאפשר, ניתן להדליק אור UV למשך 10 דקות לפני הרכבת המערכת ההידרופונית. אטום את המשטח העליון של קצה הפיפט שטוח בעזרת סרט ההדבקה. במידת האפשר, הניחו להם תחת אור UV למשך 10 דקות.

לאחר מכן, הוסף 108 מיקרוליטר של מדיום מוצק מומס בכל באר באמצעות פיפט רב ערוצי. אם אתה מכין מיכלים רבים, השתמש בפלטה חמה כדי למנוע ממדיום MS להתמצק. הניחו למדיום להתמצק לחלוטין, כ -30 דקות.

במהלך תקופת ההתמצקות ניתן להדליק אור UV. מלאו את קופסת הטיפים לחלוטין במדיום תרבית נוזלי. הבטח את הקומפקטיות ההדוקה בין מדיה מוצקה לנוזלית.

הסר סרטי דבק מהמשטח העליון של קצה הפיפט שטוח, והתקן אותו על המתלה בזהירות. המערכת ההידרופונית מוכנה כעת לקלוט את הזרעים המעוקרים. עיקור האקונומיקה הנוזלית המתואר כאן הוא שיטה מעשית לעיקור זרעים.

אגרוף, מניחים 500 זרעי ארבידופסיס בצינור מיקרו של 1.5 מ"ל. השתמש בכמה צינורות מיקרו שצריך בהתאם למספר הצמחים הנדרשים לניסוי. שוטפים את הזרעים באתנול 7% למשך שתי דקות בתסיסה.

הסר את האתנול בזהירות. הוסף מ"ל אחד של תמיסת אקונומיקה 10% המכילה שני מיקרוליטר של חומר ניקוי פוליסורבט 20. התסיסו במשך חמש דקות.

הסר את התמיסה בזהירות. לבסוף, שטפו את הזרעים במים מזוקקים מעוקרים עד שכל שאריות האקונומיקה מוסרות לחלוטין, כחמש פעמים. פרוטוקול זה אפשרי עבור ארבידופסיס, אולם ניתן להשתמש במערכת זו גם עבור מיני צמחים אחרים.

לשם כך, יש לשנות את הליך העיקור האמור בהתאם לדרישת המין. לאחר עיקור פני השטח, הזרעים הוטבלו במים מזוקקים סטריליים ורובדו בארבע מעלות בחושך במשך חמישה ימים כדי לסנכרן את הנביטה. חותכים מעט את הקצה של קצה פיפט 200 מיקרוליטר בעזרת אזמל סטרילי.

זרעו את זרעי הערבידופסיס למדיום התרבות המוצק על המשטח העליון של קצה הפיפט שטוח. דאגו שהמדיום לא ישתחרר מהדירה, אחרת הזרעים יהיו צל והשתילים לא יגדלו כראוי. אחסן כמה שיותר מיני מיכלים בתוך קופסת פלסטיק חד פעמית כדי לשמור על לחות גבוהה והסביבה נקייה ממיקרואורגניזמים.

אטום את קופסת הפלסטיק החד פעמית באמצעות סרט דבק. המערכות ההידרופוניות מוכנות כעת לכניסה לתא הגידול. מערכת הידרופונית זו פותחה בתחילה כדי להקל על מתן כימיקלים לצמחים, כגון תרכובות המסומנות באיזוטופים, שבאופן כללי יקרות מאוד ליישום בניסויים בקנה מידה גדול.

כהוכחת רעיון, השתמשנו במעכב התחרותי ATP AZD8055, המכוון באופן ספציפי לאתר קשירת ה-ATP של חלבון המטרה רפמיצין קינאז. TOR קינאז הוא מווסת עיקרי המשלב חישת חומרים מזינים ואיתות אנרגיה כדי לקדם שגשוג וצמיחה של תאים. על מנת להעריך את התגובות העיקריות של עיכוב TOR בתיווך AZD, זרעי ארבידופסיס גודלו באופן הידרופוני עד לשלב ההתפתחותי הרצוי תחת תקופת צילום של 12 שעות.

מדיום טרי המכיל שני AZD מיקרו-מולרי או 0.05% DMSO כבקרה הוחלף במיכלים ההידרופוניים בסוף הלילה. שתילים נקטפו בנקודות זמן שונות לאחר הטיפול, הופרדו לשורשים ונבטים קפואים בחנקן נוזלי, נטחנו לאבקה דקה ואוחסנו במינוס 80 מעלות עד לשימוש. דפוס הזרחן של החלבון הריבוזומלי S6 קינאז, RPS6, אחד היעדים הידועים של מסלול TOR.

אימונובלוטינג מראה את כמות ה-RPS6 הכולל והזרחני בשורשים, גרף A ויורה, גרף B.דיכוי זרחון בנוכחות ADZ855 התרחש מיד 30 דקות לאחר הטיפול התרופתי הן בשורשים והן ביורה, מה שמדגים כי בתנאי הניסוי בהם נעשה שימוש, ADZ הוכח גם כמעכב TOR חזק המדכא במהירות את פעילות הקינאז שלו. קווי ארבידופסיס טרנסגניים עם ביטוי מופחת של גן TOR או רכיבים של קומפלקס TOR מציגים פנוטיפ עודף עמילן ברור. ניתוח איכותני של עמילן באמצעות תמיסת לוגול חושף את הדפוס הצפוי של הצטברות עמילן ופירוק במהלך המחזור.

שתילים שלא קיבלו יישום של MSO או AZD855 לא הראו הצטברות גדולה יותר של עמילן בעלים שלהם בסוף הלילה, והצטברות עמילן במפעלי הביקורת, ה-MSO, הייתה עקבית עם הספרות. יתר על כן, צמחים שטופלו ב-AZD הציגו כמות גדולה יותר של עמילן שנותר בסוף הלילה בהשוואה לשתילי הביקורת. תוצאות אלה מצביעות על התועלת של המערכת ההידרופונית המוצעת בגידול שתילים המחקים תנאים פיזיולוגיים.

עמילן מצטבר בעלים במהלך היום, ומגויס מחדש במהלך הלילה כדי לקיים פעילויות מטבוליות. בתנאים רגילים, רק חלק קטן של עמילן, בין 5 ל -10% מהכמות הכוללת לאחר סוף היום נשאר בסוף הלילה. תוצאות אלה נבדקות כי פנוטיפ עמילנים שנצפה תחת דיכוי TOR מתרחש לאורך כל המחזור.

צמחים שגודלו באופן הידרופוני הושוו לשתילים המגדלים מצע גנני בתנאי אקלים דומים מאוד לגבי רמת הביטוי של החומצה האבציסית בעלי גורם קשירת יסוד מגיב שלוש, גן ABF3, המוצג באיור 5-A. הביטוי של ABF3 נמצא בקורלציה ישירה עם רמות ABA פנימיות, סוג של הורמונים הידוע כסמן בשל תפקידו בתגובות לחץ אביוטיות מרובות. למרות שצמחים שגודלו בהידרופון הציגו עלייה משמעותית בביטוי ABF3 בהשוואה לצמחים שגדלו באדמה, רמות הביטוי של אספרגין סינתטאז אחד ASN1, לא הושפעו מטיפולי MSO או AZD המוצגים באיור 5-B.

עם זאת, הביטוי של טרהלוז פוספט סינתאז חמש, TPS5, בתוספת עלייה משמעותית לאחר שמונה שעות של דיכוי TOR. ASN1 ו-TPS5 מגיבים לרמות סוכר נמוכות וגבוהות בהתאמה, מה שמרמז על כך שצמחים אלה לא חוו לחץ גנטי. הצלחנו להשתמש במערכת זו כדי להעריך את היישום של מולקולות קטנות בצמחים.

לסיכום, למערכת הידרופונית זו יתרונות רבים מכיוון שהיא מהירה מאוד וקלה להרכבה, ויש לה עלות נמוכה, מכיוון שהרכיבים העיקריים זולים, וניתן לעשות בהם שימוש חוזר נרחב. יתר על כן, מערכת זו היא רב-תכליתית, ומאפשרת מחקר של שתילים שלמים או הבחנות לאורך התפתחות הצמח, והיא ניתנת להרחבה גבוהה, ומאפשרת גידול של מספר עצום של צמחים בשטח קטן מאוד.