Name: עלות נמוכה גמיש מערכת הידרופונית להערכת תגובות צמח מולקולות קטנות בתנאים סטריליים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-25T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: למד מערכת הידרופונית פשוטה וזולה לגידול צמחים בתנאים סטריליים. השיטה מאפשרת ספיגה יעילה של מולקולות קטנות בשרשים Arabidopsis thaliana למחקרים מולקולריים ופיזיולוגיים בקנה מידה גדול.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי קרן מחקר סאו פאולו (FAPESP; להעניק 12/19561-0), אגודת מקס פלאנק. אליאס פ Araújo (FAPEMIG 14/30594), קרולינה ג מונטה בלו (FAPESP; Mafra גרנט 14/10407-3), Valéria (FAPESP; גרנט 14/07918-6), ו- Viviane ג ה דה סילבה (גלימות/CNPEM 24/2013) אסירי תודה על המלגות. המחברים מודים כריסטיאן מאייר מ אינסטיטוט ז'אן פייר Bourgin (INRA, ורסאי, צרפת) על בנדיבות מתן נוגדנים נגד RPS6. המחברים תודה RTV UNICAMP והקלטת אד פאולו Aparecido de Souza מנואל לתמיכה טכנית שלהם במהלך השמע.

1. הכנת המדיה תרבות נוזלי ומוצק
<ol><li>להכין מדיום נוזלי באמצעות מדיום Murashige ו- Skoog (MS) בחצי כוח עם ויטמינים [0.0125 mg/L של cobalt(II) pentahydrate כלוריד, 0.0125 mg/L של copper(II) סולפט pentahydrate, 18.35 mg/L של נתרן ferric ethylenediaminetetraacetate, 3.10 מ ג/ליטר של . חומצת בור, 0.415 mg/L של אשלגן יודיד, 8.45 מ ג/ליטר של מנגן מונוהידראט, 0.125 מ"ג/ליטר של נתרן molybdate וגופרית והרכבו 4.30 מ ג/ליטר של אבץ סולפט heptahydrate, 166.01 mg/L של סידן כלורי, 85 מ"ג/ליטר של אשלגן פוספט dihydrogen, 950 מ ג/ליטר של חומצה גופרתית חנקת אשלגן 90.27 mg/L של מגנזיום גופרתי, 825 מ"ג/ליטר של אמוניום חנקתי, 1 מ ג/ליטר של גליצין, 50 מ"ג/ליטר של myo-אינוזיטול, 0.25 mg/L nicotinic חומצה, 0.25 mg/L של פירידוקסין הידרוכלוריד, 0.05 mg/L של תיאמין הידרוכלוריד] בתוספת 0.25 g/L של MES, ולהתאים את ה-pH ל 5.8 עם 10 מ' KOH.</li>
	<li>להוסיף 10 גרם/ליטר של אגר לעשות בחצי כוח מוצק MS בינוני. אוטוקלב המדיום ב 121 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות לפני השימוש.</li>
</ol>2. מערכת הידרופונית הרכבת
הערה: השלבים שיש אחריו בקפידה כדי לבנות מערכת הידרופוני.
<ol><li>
עיקור גשמי
	<ol>
<li>לארוז בשקית אוטוקלב הטיפ פיפטה ארונות תקשורת (ללא מכסה) אשר ישמש בתור minitanks. אוטוקלב המדפים ב 121 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות, 15 psi. הערה: המדף עצה פיפטה פוליפרופילן השתמשנו היה הממדים הבאים: 120 מ מ (אורך) x 89 מ מ (רוחב) x 55 מ מ (גובה). משטח שטוח של עצה פיפטה חייב להיות שטח עבור התוספת של תרבות בינוני. ארונות תקשורת אחרים עצה יכול לשמש (ראו טבלה של חומרים). הערה: לאורך כל ההליך הרכבה של מערכת הידרופוני, יש צורך להשתמש תא למינארי, אשר צריך לנקות ולשמור חיטוי עם אתנול 70% לפני השימוש. הנסיין עליך ללבוש חלוק מעבדה, לשטוף את הידיים שלהם, כל חשופות העור, ולחטא אותם עם 70% אתנול. כפפות הם אופציונליים, מלבד יישום סמים.</li>
		<li>לנקות את כל האביזרים שתוארו לעיל (קופסאות פלסטיק חד פעמיות, דבק, פיפטות, מספריים, ופינצטה) עם אתנול 70% לפני הכניסה את למינארי. אם המנוע מאפשר, הפעל את האור האולטרה סגול 10 דקות לפני הרכבת של מערכת הידרופוני על מנת לשמור על אזור העבודה ושוקמו.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Minitank הרכבת
	<ol>
<li>לאטום את המשטח העליון של קצה פיפטה שטוח עם סקוטש (איור 1B). אם אפשר, תשאיר את זה מתחת UV אור למשך 10 דקות.</li>
		<li>להוסיף כל טוב באמצעות פיפטה רב-ערוצי (איור 1C) µL 180 מומס מוצק MS תרבות בינוני (מעט חמים). הערה: בעת הכנת טנקים רבים, השתמש פלטה כדי למנוע המדיום MS שהשרף מתהווה.</li>
		<li>לאפשר המדיום שבמהלכו לחלוטין (במשך כ 30 דקות). הערה: במהלך תקופת התמצקות, האור האולטרה סגול יכול להיות מופעלת.</li>
		<li>למלא את המדף עצה פיפטה לחלוטין עם MS נוזלי תרבות בינוני (איור 1D) וודאו כי יש קשר הדוק בין המוצק התקשורת נוזלי.</li>
		<li>הסר את סרטי הדבקה של המשטח העליון של קצה פיפטה שטוח, להתאים את זה על המדף בקפידה. מערכת הידרופוני עכשיו הוא מוכן לקבל את הזרעים מעוקר.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. זרעי עיקור
<ol><li>המקום 500 תודרנית זרעים 1.5 mL microtube. השתמש microtubes רבים ככל שנדרש על פי מספר צמחים הנדרשות לניסוי.</li>
	<li>לשטוף את הזרעים עם אתנול 70% למשך 2 דקות עם עצבנות עדין. תן הזרעים להתיישב ולאחר מכן תסיר האתנול בקפידה.</li>
	<li>להוסיף 1 מ"ל של נתרן תת-כלורי 10% הפתרון הכולל 2 µL של חומר ניקוי 20 polysorbate. להתסיס הפתרון עבור 5 דק. הסר את הפתרון בקפידה.</li>
	<li>יש לשטוף את הזרעים במים מזוקקים סטריליים עד להסרת כל השאריות אקונומיקה הוא לחלוטין (בערך 5 x). הערה: לאחר עיקור פני השטח, הזרעים היו שקוע במים מזוקקים סטריליים, מרובדת ב 4 ° C בחושך 5 d לסנכרן את הנביטה. הערה: זרעי דגולה זיפן (ההצטרפות A10.1) היו preincubated בחומצה גופרתית מרוכזת למשך 15 דקות (לשבור את תרדמה הפיזי), לשטוף ביסודיות במים מזוקקים סטריליים, ואז disinfested עם פתרון 5% נתרן תת-כלורי המכיל 0.1% polysorbate 20 במשך חמש דקות עם עצבנות עדין21. השלבים עיקור הנותרים היו זהים לאלו שתוארו תודרנית זרעים.</li>
</ol>4. הזרע יישום
<ol><li>לחתוך מעט החמורים של טיפ µL 200 בעזרת אזמל סטרילי.</li>
	<li>Pipette הזרעים תודרנית לתוך האמצעי תרבות אחיד על פני השטח העליון של קצה פיפטה שטוח. . שמור על עצמך כי המדיום לא שחרר מהדירה; . אחרת, הזרעים יהיה מוצל ולא השתילים לא יגדלו כראוי (איור 1E). הערה: השתמש פינצטה סטרילי עבור זרעים זיפן (עם העובר בעמדה כלפי מעלה).</li>
	<li>חנות minitanks רבים ככל האפשר בתוך קופסת פלסטיק חד פעמיות כדי לשמור על לחות גבוהה ולשמור על הסביבה מפני מיקרואורגניזמים (איור 1F) חינם.</li>
	<li>חותם את קופסת פלסטיק חד פעמיות ביסודיות באמצעות דבק כדי למנוע זיהום.</li>
	<li>מקם את מערכות הידרופוני לתא צמיחה עם התנאים המתאימים צמיחה של הצמח עניין. הערה: בעבודה זאת, התנאים הבאים שימשו: 75% לחות, ו- 150 µmol ז-2 s-1 irradiance והתנאים equinoctial של 12 שעות אור (21 ° C) / 12 h כהה (19 ° C) עבור תודרנית, או 300 µmol ז-2 s-1 של אור בקרינה ו- 12 h (28 מעלות צלזיוס) / 12 h כהה (25 ° C) עבור זיפן (איור 1 ג'י ו- 1 H).</li>
</ol>5. אימות השימוש של מערכת הידרופוני זו כדי לעכב את היעד של קינאז Rapamycin
הערה: מערכת הידרופוני זו פותחה בתחילה כדי להקל את הניהול של כימיקלים צמחים, אשר, באופן כללי, הם יקרים מאוד להיות מיושם ניסויים בקנה מידה גדול. מהווה הוכחה של המושג, החומר המדכא תחרותי ATP AZD-8055, אשר ידוע במיוחד למטרה האתר מחייב ATP של TOR פרוטאין קינאז22, הועסק לעקוב הדיכוי של TOR פעילות אחרים-שתילים, (קולומביה-0 לבנה א מרכז תודרנית מניות נוטינגהאם, NASC מזהה: N22681). . הנה, פרוטוקול המשמש מתואר בקצרה.
<ol><li>גדלים הזרעים hydroponically עד שלב 1.04 לפי BBCH גודל23 (במשך כ 11 יח) בתנאים אקלימיים שתוארו לעיל. להחליף את הפתרון התזונתי, גם עם טרי בינוני המכילים 0.05% דימתיל סולפוקסיד (בקרה), 2 מיקרומטר AZD-8055 (TOR מעכב) מדולל דימתיל סולפוקסיד, או ללא טיפול (מעושה), בסוף הלילה (EN).</li>
	<li>הקציר כמה שתילים בנקודות זמן שונות לאחר הטיפול ולהפריד אותם לתוך רוטס & שוטס. הקפאת הדגימות של חנקן נוזלי, לטחון אותם כדי אבקה לתוך מטחנה רובוטית (ראה טבלה של חומרים), ולאחסן את האבקה ב-80 מעלות צלזיוס עד השימוש.</li>
	<li>Immunoblot נגד phosphorylated ו- phosphorylated צורות החלבונים ribosomal בשנות ה-40, S6 (RPS6) על פי Dobrenel. et al. 24.</li>
	<li>אקונומיקה שתילים שלם עבור מדגם depigmentation לשטוף אותם במים מזוקקים, לטבול אותם פתרון יוד 5 דקות25, לצלם את השתילים בשטח stereomicroscope (0.63 X אובייקטיבי, 20 x קירוב, ובהיקף x 7.5) עבור הערכה איכותית של התוכן עמילן.</li>
	<li>לכמת את העמילן בעקבות השפלה אנזימטי של מדידה של הגלוקוז שפורסמו spectrophotometrically על ידי צימוד זה את ההפחתה של NADP+ ל nadph ל26,27.</li>
	<li>מבצע החילוץ RNA הכולל, סינתזה cDNA, ו- RT-PCR כמותי מבחני כפי שתואר על ידי. Caldana et al. 28 כדי להעריך את רמת הביטוי של גנים הקשורים סוגים שונים של לחצים.</li>
	<li>באופן אופציונלי, לגדל שתילים על מצע הגננות בעציצים פלסטיק עם קיבולת 0.1 L תחת תנאי אקלים דומה [60% לחות, 150 µmol ז-2 s-1 של אחידות irradiance והתנאים equinoctial של 12 שעות אור (21 ° C) / 12 h כהה (19 מעלות )] על מנת להשוות אותם עם שתילים שגדלו hydroponically. הערה: הגנים היעד המשמש את מבחני ביטוי הגן היו ABF3 (At4g34000), ASN1 (At3g47340), ו- TPS5 (At4g17770), ואת רמות הביטוי שלהם היו מנורמל העסקת את שיטת דלתא-Ct29 באמצעות ACT2 (At3g18780) או PDF2 (At4g04890) כמו הגנים להפניה פנימית, בהנחה 100% של ה-PCR הגברה יעילות בכל הדוגמאות. זוגות oligonucleotide משמש את ה-PCR כמותי היו: ABF3 (GTTCTCAACCTGCAACACAGTGC; TCCAGGAGATACTGCTGCAACC), ASN1 (AGGTGCGGACGAGATCTTTG; GTGAAGAGCCTTGATCTTGC), TPS5 (CTGCTCTGATGCTCCTTCTTCC; AAGCTGGTTTCCAACGATGATG), ACT2 (CGTACAACCGGTATTGTGCTGG; CTCTCTCTGTAAGGATCTTCATG), ו- PDF2 (TAACGTGGCCAAAATGATGC; GTTCTCCACAACCGCTTGGT).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

מבנה הידרופוני ממוטבת זה מאפשר התרבות מוצלחת במבחנה של צמחים. הזרעים לנבוט על המדיום מוצק על משטח שטוח של עצה פיפטה, רווח ניכר לעומת מערכות איפה זרעים רטובים עם הפתרון התזונתי. יתרון גדול של השיטה היא כי במהלך הפיתוח שתיל, שורשים לקבל ישירות עם המדיום הנוזלי ללא הצורך של העברה. יתר על כן, טיפול כימי ניתן להחיל בקלות בתוך המדיום הנוזלי באמצעי אחסון מופחת. נשמרת לחות גבוהה, הימנעות האידוי של הפתרון התזונתי, חידוש המלאי שלה. בנוסף, ולהתפתחות הומוגנית במהלך הקמת שתיל ניתן להשיג בקלות, לערבב אינה נדרשת בעת עבודה עם ט...

היתרונות של שימוש הידרופוניקה גידול צמחים זוהו נרחב בייצור של צמחים גדולה ואחידה, הפעלת ניסויים לשחזור1,2,3. במערכת זו, ההרכב של הפתרון התזונתי יכול להיות כראוי נשלטים ועל ממוחזר לאורך כל שלבי התפתחות וצמיחה של הצמח. יתר על כן, שורשים לא נתון והאביוטיים מושם, כפי שעלול לקרות בצמחים שגודלו בקרקע, כגון חומר מזין הרעבה ומים מחסור4. כמו הצמחים גדלו hydroponically נוכח פיזיולוגיים מורפולוגיים תכונות דומים למדי לאלו תרבותי בקרקע, מערכת זו כבר בהרחבה מועסקים במחקר כי זה מאפשר פיקוח על צמיחה שורש/לירות קצירת שלהם מבלי פציעות2,5.
בשל האפשרות של שינוי הרכב ואת ריכוז של הפתרון התזונתי, רוב המחקרים שימוש בתנאים הידרופוני בוצעה כדי לאפיין את הפונקציות של מיקרו - ו macronutrients1,3 ,6,7,8. עם זאת, מערכת זו הוכיחה להיות מאוד שימושי למגוון רחב של יישומים בביולוגיה הצמח, כגון להבהיר את הפונקציות של הורמונים וכימיקלים בצמחים. כך למשל, גילוי סטריגולקטונים כמו סוג חדש של הורמונים9 ו של פנוטיפ הצמיחה המואצת המופעלות על-ידי יישום ברסינוסטרואיד10 בוצעו בתנאים הידרופוני. יתר על כן, מערכת זו מאפשרת ניסויים עם איזוטופים שכותרתו (למשל, 14N /15N ו- 13CO2)11,12 להעריך שלהם שהשתלבה חלבונים ו מטבוליטים באמצעות ספקטרומטר מסה.
בהתחשב החשיבות של מערכת זו במחקר הצמח, מספר גבוה של תרבויות הידרופוני תוכנן בהשנים האחרונות, כולל מערכות המשתמשות (i) את ההעברה של שתילים של פלטות מיכלי הידרופוני3, 13; (ii) rockwool המגבילים גישה בשלבים המוקדמים של שורש פיתוח2,14,15; (iii) פוליאתילן מגרסת כמו הגוף צף, מה שהופך את היישום הומוגנית של מולקולות קטנות/טיפולים קשה16; או (iv) מופחתת מספר צמחים9,17. הנפח של טנקים הידרופוני תיאר ברבות מן הפרוטוקולים האלו הם בדרך כלל גדולים (אחסון קטן הנע בין 1-5 L, עד 32 L)18, מה שהופך את היישום של כימיקלים יקר מאוד. למרות מחקרים מעטים לתאר ההידרופוניות תחת תנאים aseptic8,19, ההרכבה של המערכת בדרך כלל די מייגעת, המורכב ההתאמה המושלמת של רשתות שינוי ניילון פלסטיק או זכוכית מכולות5,8,17,20.
בשל החשיבות של תודרנית לבנה כמו צמח מודל, הרוב המכריע של הידרופוניקה מערכות תוכננו עבור זה מינים1,2,8,14,18, 19 , 20. עם זאת, ישנם כמה מחקרים דיווח התכונות גידול הידרופוני מיני צמחים אחרים עם רעלני של זרעים לשפר את הנביטה שלהם ומחשיבה סינכרון במבחנה8,16 . כדי לעבוד בקנה מידה גדול, פיתחנו פרוטוקול עבור הגדרת מערכת הידרופוני תחזוקה פשוטה, בעלות נמוכה המאפשר בתנאים סטריליים לגידול צמחים, כולל לבנה א ו מינים אחרים, כגון הדשא זיפן דגולה. השיטה המתוארת כאן מתאימה לניסויים שונים, ככל הגידול שתיל יכול להיות מוגדל, מסונכרנים, בקלות תחת פיקוח. יתר על כן, מערכת זו יש יתרונות רבים כמו: (i) על מנת להרכיב וסופן ולהשתמש מרכיביו; (ii) זה מאפשר את יישום קל של כימיקלים שונים לתוך המדיום הנוזלי; (iii) את השתילים לנבוט ולגדול ישירות בהמדיום תרבות ללא הצורך של העברה אל מערכת הידרופוניקה; (iv) לירות ושורש הפיתוח/הגידול יכול להיות תחת פיקוח צמוד, השתילים נקצרים ללא פיצויים; ו (v) זה עושה את זה אפשרי לעבודה בקנה מידה גדול, שמירה על מצבים פיזיולוגיים.

<table><tbody><tr><td>אתנול</td><td>Merck</td><td>100983</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת נתרן היפוכלוריט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>425044</td><td></td></tr><tr><td>פוליסורבט 20&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>Murashige ו-Skoog (MS) בינוני כולל ויטמינים&nbsp;</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>M0222</td><td></td></tr><tr><td>2-(N-morpholino)חומצה אתנסולפונית (MES) מונוהידראט</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>M1503</td><td></td></tr><tr><td>Agar&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7921</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן הידרוקסיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>484016</td><td></td></tr><tr><td>קולט אדים זרימה למינרית</td><td>Telstar</td><td>BH-100</td><td></td></tr><tr><td>פלטה חמה</td><td>AREC</td><td>תא</td> צמיחה F20510011 <td></td></tr><tr><td></td><td>Weiss Technik</td><td>HGC 1514</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי זכוכית (150 מ"מ x 25 מ"מ)</td> <td>Uniglass</td><td>189.006</td><td></td></tr><tr><td>200 & מו; מתלים לקצה פיפטה L&nbsp;</td><td>Kasvi</td><td>K8-200-5 *</td><td></td></tr><tr><td>300 &mu; L פיפטה רב ערוצית</td><td>Eppendorf</td><td>3122000060</td><td></td></tr><tr><td>300 &mu; קצות פיפטה L</td><td>Eppendorf</td><td>30073088</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; L פיפטה&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>3120000054</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; L קצות פיפטה</td><td>Eppendorf</td><td>מספריים 30000870</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Tramontina</td><td>25912/108</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה</td><td>ABC Instrumentos</td><td>702915</td><td></td></tr><tr><td>להב אזמל</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2771</td><td></td></tr><tr><td>סרט שקוף דבק (45 מ"מ x 50 מ')</td> <td>סקוטש 3M</td><td>5803</td><td></td></tr><tr><td>קופסאות פלסטיק חד פעמיות, מידות חיצוניות: 353 מ"מ (L) x 178 מ"מ (W) x 121 מ"מ ( H)</td> <td>מקסיפק</td><td>32771</td><td></td></tr></tbody></table>

עלות נמוכה גמיש מערכת הידרופונית להערכת תגובות צמח מולקולות קטנות בתנאים סטריליים

A Flexible Low Cost Hydroponic System for Assessing Plant Responses to Small Molecules in Sterile Conditions

מגוון רחב של לימודי בביולוגיה צמח מבוצעות באמצעות תרביות הידרופוני. בעבודה זו, מוצג במבחנה גידול הידרופוני מערכת המיועדת הערכת התגובות מפעל כימיקלים וחומרים אחרים עניין. מערכת זו היא היעילה ביותר בהשגת שתילים הומוגנית ובריא של C3 ו- C4 דגם מינים תודרנית לבנה , זיפן דגולה, בהתאמה. טיפוח סטרילי מונע אצות וזיהום מיקרואורגניזם, אשר ידועים גורמים מגבילים צמח רגיל לצמיחה ופיתוח בהידרופוניקה. בנוסף, מערכת זו היא מדרגית, המאפשר את היבול של חומר צמחי בקנה מידה גדול עם נזקים מכניים קלים, כמו גם את היבול של חלקים נפרדים של צמח במידת הצורך. פרוטוקול מפורט הוכחת כי מערכת זו יש הרכבה קלה, בעלות נמוכה, כפי שהיא משתמשת פיפטה מתלים כפלטפורמה העיקרי לגידול צמחים, מסופק. הכדאיות של מערכת זו אומתה באמצעות תודרנית השתילים כדי להעריך את ההשפעה של הסם AZD-8055, מעכב כימי של היעד של קינאז rapamycin (טור). טור עיכוב ביעילות זוהה מוקדם ככל 30 דקות לאחר טיפול AZD-8055 ב רוטס & שוטס. יתר על כן, צמחים AZD 8055-שטופלו מוצגים על פנוטיפ עמילן-עודף הצפוי. הצענו מערכת הידרופוני זו כמו שיטת אידיאלי עבור חוקרי הצמחים במטרה לפקח על הפעולה של הצמח inducers או מעכבי, כמו גם באשר להעריך פלקסים מטבולית באמצעות תיוג-איזוטופ תרכובות אשר, באופן כללי, מחייב שימוש יקר ריאגנטים.

קינאז TOR הוא מווסת הגדולות המשלבת חומרי מזון ואנרגיה איתות לקדם את התפשטות תאים וכן מגידול כל פרוקריוטים. מאמצים התירי פונקציות תור בצמחים כוללים את הדור של תודרנית הטרנסגניים שורות המכילות דיכוי מותנה תור דרך התערבות RNA או microRNA מלאכותי28,30,31, נתן את העובר פנוטיפ קטלני של TOR נוקאאוט צמחים32,33,<sup class="xref...

מערכת פשוטה רב-תכליתי, בעלות נמוכה במבחנה הידרופוני בהצלחה אופטימלי, הפעלת ניסויים בקנה מידה גדול בתנאים סטריליים. מערכת זו מקלה על היישום של חומרים כימיים פתרון וספיגה יעילה שלהם על ידי השורשים ללימודי מולקולרית, ביוכימיה ו פיזיולוגיים.

A wide range of studies in plant biology are performed using hydroponic cultures. In this work, an in vitro hydroponic growth system designed for ...

מערכת הידרופוניקה חוץ גופית פשוטה, רב-תכליתית ובעלות נמוכה עברה אופטימיזציה מוצלחת, ואפשרה ניסויים בקנה מידה גדול בתנאים סטריליים. מערכת זו מאפשרת יישום כימיקלים בתמיסה וספיגתם היעילה בשורשים למחקרים מולקולריים, ביוכימיים ופיזיולוגיים. הראינו שמערכת זו יעילה ביותר בהשגת שתילים הומוגניים לאורך ההתפתחות הראשונית, כמו גם בהפרדת שורשים ונבטים באמצעות זרעי Arabidopsis thaliana.הפריטים הבאים נחוצים לבניית מערכת ההידרופוניקה ולטיפוח צמחים בתנאים סטריליים ומבוקרים. 7% אתנול, 10% תמיסת אקונומיקה, פוליסורבט 20, מדיום MS כולל ויטמינים. MES מונוהידרט, אגר, אשלגן הידרוקסיד.מכסה מנוע זרימה למינרית, פלטה חמה, תא גדילה. קופסאות פלסטיק חד פעמיות, כלי פטרי מזכוכית סטרילית, סרט דבק, קצות פיפט סטריליים של 200 ו-300 מיקרוליטר, מספריים, פיפט רב-ערוצי 300 מיקרוליטר, פיפט 200 מיקרוליטר, להב אזמל, פינצטה ומדפי קצה פיפט של 200 מיקרוליטר. זה חיוני שלקצה הפיפט שטוח יהיה שטח למילוי במדיום המוצק.עקר את מתלי קצות הפיפט ללא כיסויים שישמשו כמיני טנקים בחיטוי בחום של 121 מעלות למשך 20 דקות. על מנת למנוע זיהום, כל החומרים שהוזכרו קודם לכן עוקרו בחיטוי. כאשר זה לא היה אפשרי, כמו במקרה של קופסאות הפלסטיק החד פעמיות, החומרים נוקו עם אתנול 7% לפני הכניסה לקולט האדים.אם מכסה המנוע מאפשר, ניתן להדליק אור UV למשך 10 דקות לפני הרכבת המערכת ההידרופונית. אטום את המשטח העליון של קצה הפיפט שטוח בעזרת סרט ההדבקה. במידת האפשר, הניחו להם תחת אור UV למשך 10 דקות.לאחר מכן, הוסף 108 מיקרוליטר של מדיום מוצק מומס בכל באר באמצעות פיפט רב ערוצי. אם אתה מכין מיכלים רבים, השתמש בפלטה חמה כדי למנוע ממדיום MS להתמצק. הניחו למדיום להתמצק לחלוטין, כ -30 דקות.במהלך תקופת ההתמצקות ניתן להדליק אור UV. מלאו את קופסת הטיפים לחלוטין במדיום תרבית נוזלי. הבטח את הקומפקטיות ההדוקה בין מדיה מוצקה לנוזלית.הסר סרטי דבק מהמשטח העליון של קצה הפיפט שטוח, והתקן אותו על המתלה בזהירות. המערכת ההידרופונית מוכנה כעת לקלוט את הזרעים המעוקרים. עיקור האקונומיקה הנוזלית המתואר כאן הוא שיטה מעשית לעיקור זרעים.אגרוף, מניחים 500 זרעי ארבידופסיס בצינור מיקרו של 1.5 מ"ל. השתמש בכמה צינורות מיקרו שצריך בהתאם למספר הצמחים הנדרשים לניסוי. שוטפים את הזרעים באתנול 7% למשך שתי דקות בתסיסה.הסר את האתנול בזהירות. הוסף מ"ל אחד של תמיסת אקונומיקה 10% המכילה שני מיקרוליטר של חומר ניקוי פוליסורבט 20. התסיסו במשך חמש דקות.הסר את התמיסה בזהירות. לבסוף, שטפו את הזרעים במים מזוקקים מעוקרים עד שכל שאריות האקונומיקה מוסרות לחלוטין, כחמש פעמים. פרוטוקול זה אפשרי עבור ארבידופסיס, אולם ניתן להשתמש במערכת זו גם עבור מיני צמחים אחרים.לשם כך, יש לשנות את הליך העיקור האמור בהתאם לדרישת המין. לאחר עיקור פני השטח, הזרעים הוטבלו במים מזוקקים סטריליים ורובדו בארבע מעלות בחושך במשך חמישה ימים כדי לסנכרן את הנביטה. חותכים מעט את הקצה של קצה פיפט 200 מיקרוליטר בעזרת אזמל סטרילי.זרעו את זרעי הערבידופסיס למדיום התרבות המוצק על המשטח העליון של קצה הפיפט שטוח. דאגו שהמדיום לא ישתחרר מהדירה, אחרת הזרעים יהיו צל והשתילים לא יגדלו כראוי. אחסן כמה שיותר מיני מיכלים בתוך קופסת פלסטיק חד פעמית כדי לשמור על לחות גבוהה והסביבה נקייה ממיקרואורגניזמים.אטום את קופסת הפלסטיק החד פעמית באמצעות סרט דבק. המערכות ההידרופוניות מוכנות כעת לכניסה לתא הגידול. מערכת הידרופונית זו פותחה בתחילה כדי להקל על מתן כימיקלים לצמחים, כגון תרכובות המסומנות באיזוטופים, שבאופן כללי יקרות מאוד ליישום בניסויים בקנה מידה גדול.כהוכחת רעיון, השתמשנו במעכב התחרותי ATP AZD8055, המכוון באופן ספציפי לאתר קשירת ה-ATP של חלבון המטרה רפמיצין קינאז. TOR קינאז הוא מווסת עיקרי המשלב חישת חומרים מזינים ואיתות אנרגיה כדי לקדם שגשוג וצמיחה של תאים. על מנת להעריך את התגובות העיקריות של עיכוב TOR בתיווך AZD, זרעי ארבידופסיס גודלו באופן הידרופוני עד לשלב ההתפתחותי הרצוי תחת תקופת צילום של 12 שעות.מדיום טרי המכיל שני AZD מיקרו-מולרי או 0.05% DMSO כבקרה הוחלף במיכלים ההידרופוניים בסוף הלילה. שתילים נקטפו בנקודות זמן שונות לאחר הטיפול, הופרדו לשורשים ונבטים קפואים בחנקן נוזלי, נטחנו לאבקה דקה ואוחסנו במינוס 80 מעלות עד לשימוש. דפוס הזרחן של החלבון הריבוזומלי S6 קינאז, RPS6, אחד היעדים הידועים של מסלול TOR.אימונובלוטינג מראה את כמות ה-RPS6 הכולל והזרחני בשורשים, גרף A ויורה, גרף B.דיכוי זרחון בנוכחות ADZ855 התרחש מיד 30 דקות לאחר הטיפול התרופתי הן בשורשים והן ביורה, מה שמדגים כי בתנאי הניסוי בהם נעשה שימוש, ADZ הוכח גם כמעכב TOR חזק המדכא במהירות את פעילות הקינאז שלו. קווי ארבידופסיס טרנסגניים עם ביטוי מופחת של גן TOR או רכיבים של קומפלקס TOR מציגים פנוטיפ עודף עמילן ברור. ניתוח איכותני של עמילן באמצעות תמיסת לוגול חושף את הדפוס הצפוי של הצטברות עמילן ופירוק במהלך המחזור.שתילים שלא קיבלו יישום של MSO או AZD855 לא הראו הצטברות גדולה יותר של עמילן בעלים שלהם בסוף הלילה, והצטברות עמילן במפעלי הביקורת, ה-MSO, הייתה עקבית עם הספרות. יתר על כן, צמחים שטופלו ב-AZD הציגו כמות גדולה יותר של עמילן שנותר בסוף הלילה בהשוואה לשתילי הביקורת. תוצאות אלה מצביעות על התועלת של המערכת ההידרופונית המוצעת בגידול שתילים המחקים תנאים פיזיולוגיים.עמילן מצטבר בעלים במהלך היום, ומגויס מחדש במהלך הלילה כדי לקיים פעילויות מטבוליות. בתנאים רגילים, רק חלק קטן של עמילן, בין 5 ל -10% מהכמות הכוללת לאחר סוף היום נשאר בסוף הלילה. תוצאות אלה נבדקות כי פנוטיפ עמילנים שנצפה תחת דיכוי TOR מתרחש לאורך כל המחזור.צמחים שגודלו באופן הידרופוני הושוו לשתילים המגדלים מצע גנני בתנאי אקלים דומים מאוד לגבי רמת הביטוי של החומצה האבציסית בעלי גורם קשירת יסוד מגיב שלוש, גן ABF3, המוצג באיור 5-A. הביטוי של ABF3 נמצא בקורלציה ישירה עם רמות ABA פנימיות, סוג של הורמונים הידוע כסמן בשל תפקידו בתגובות לחץ אביוטיות מרובות. למרות שצמחים שגודלו בהידרופון הציגו עלייה משמעותית בביטוי ABF3 בהשוואה לצמחים שגדלו באדמה, רמות הביטוי של אספרגין סינתטאז אחד ASN1, לא הושפעו מטיפולי MSO או AZD המוצגים באיור 5-B.עם זאת, הביטוי של טרהלוז פוספט סינתאז חמש, TPS5, בתוספת עלייה משמעותית לאחר שמונה שעות של דיכוי TOR. ASN1 ו-TPS5 מגיבים לרמות סוכר נמוכות וגבוהות בהתאמה, מה שמרמז על כך שצמחים אלה לא חוו לחץ גנטי. הצלחנו להשתמש במערכת זו כדי להעריך את היישום של מולקולות קטנות בצמחים.לסיכום, למערכת הידרופונית זו יתרונות רבים מכיוון שהיא מהירה מאוד וקלה להרכבה, ויש לה עלות נמוכה, מכיוון שהרכיבים העיקריים זולים, וניתן לעשות בהם שימוש חוזר נרחב. יתר על כן, מערכת זו היא רב-תכליתית, ומאפשרת מחקר של שתילים שלמים או הבחנות לאורך התפתחות הצמח, והיא ניתנת להרחבה גבוהה, ומאפשרת גידול של מספר עצום של צמחים בשטח קטן מאוד.

a-flexible-low-cost-hydroponic-system-for-assessing-plant-responses

Research

JoVE Journal

Environment

סביבה

השיטה הפשוטה היא ובלבד מאפשר מיצוי ניתוח מהיר של הורמונים צמחיים מרובים דגימות רקמה קטנות. הליך משתמשת מיצוי שלב אדי כצעד טיהור חגיגית. דוגמאות מנותחות על ידי GC / MS עם יינון כימי שמייצר בעיקר (M 1) יונים +.

ניטור הורמונים צמחיים במהלך התגובות מתח

מקור: Nathoo, N., et al. מערכת גידול משותף הידרופונית לניתוח סימולטני ושיטתי של אינטראקציות ואיתות מולקולריות של צמח/חיידק. J. Vis. Exp. (2017).סרטון זה מדגים מערכת גידול משותף הידרופונית לחקר אינטראקציות בין צמחים לחיידקים בתנאים סטריליים. שתילי צמחים מועברים למצע גידול סטרילי וחומצי, מודגרים ונבדקים לאיתור זיהום לפני החיסון באגרובקטריום. החיידקים הפעילים נצמדים לשורשי הצמח, מעבירים T-DNA לתאי הצמח ומקדמים שינויים מולקולריים המשפרים את ההתיישבות של החיידקים.

מערכת גידול משותף לחקר התגובות המולקולריות של מארחי צמחים וחיידקים המקיימים אינטראקציה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול קל לביצוע להקמת מערכת הידרופונית מוצלחת למחקרי תזונת צמחים. פרוטוקול זה נבדק בהרחבה ב-Arabidopsis וניתן להתאים אותו בקלות למיני צמחים אחרים כדי לחקור דרישות תזונתיות ספציפיות או את ההשפעה של אלמנטים לא חיוניים על צמיחה והתפתחות של צמחים.

הידרופוניקה: מערכה צדדית לחקר תגובות הקצאת צמח מזין לזמינות מזין וחשיפת אלמנטים רעילים

מוצג כאן היא טכניקה פשוטה עבור ברזולוציה גבוהה confocal זמן לשגות הדמיה של פיתוח שורש היפוקוטיל עד 3 ימים באמצעות מטרות צמצם גבוהה מספריים ו perfluorodecalin כמו מדיום טבילה.

חדר פשוט עבור לטווח ארוך הדמיה confocal של שורש ו היפוקוטיל פיתוח

מערכת cocultivation הידרופוני שתואר תומך צמחים שלם עם מסכי רשת מתכת cocultivates אותם עם חיידקים. רקמות הצמח, חיידקים, ומולקולות מופרדים אז ניתן לקצור בנפרד עבור ניתוחים במורד הזרם, בו זמנית מאפשר תגובות מולקולריות של שני המארחים צמח אינטראקציה חיידקים או microbiomes להיחקר.

הידרופוני Co- טיפוח מערכת לניתוח סימולטני ושיטתי של הצמח / מיקרובי אינטראקציות מולקולרית איתות

מאמר זה מדגים כיצד תרבות תודרנית לבנה השתילים בשטח פלטפורמה דו שכבתי microfluidic מגבילה את הבסיס העיקרי ואת שערות השורש למישור אופטי יחיד. פלטפורמה זו יכולה לשמש עבור הדמיה אופטית בזמן אמת מורפולוגיה שורש בסדר גם באשר דימות ברזולוציה של באמצעים אחרים.

הדמיה המורפולוגיה שורש השיער של תודרנית השתילים בשטח פלטפורמה Microfluidic דו שכבתי

כאן אנו מתארים ידרופוני צמח שיטת הצמיחה כדי נוכחות המינים ככמת ולהמחיש את התפלגות מרחבית של חיידקים במהלך הקולוניזציה הראשונית של שורשי הצמח ולאחר העברתם לסביבות צמיחה שונות.

ניטור מושבת חיידקי ותחזוקה על השורשים האראדותזיס thaliana במערכת ידרופוני צף

אנו מספקים שיטה לזיהוי מודולים של דיות שקרנים על ידי הקרנת בקנה מידה גדול של ספריה מורכבת.

זיהוי של הרגולטורים הרומן של דיות צמח על ידי הקרנת הדמיה תרמית בקנה מידה גדול בהליוציץ השנתי

אנו משתמשים בכלי מעבדה פשוטים כדי לבחון את ארכיטקטורת מערכת השורשים (RSA) של Arabidopsis ו- Medicago. העציצים גדלים באופן הידרופוני על גבי רשת ומפוזרים באמצעות מברשת אמנותית כדי לחשוף את ה-RSA. התמונות מצולמות באמצעות סריקה או מצלמה ברזולוציה גבוהה, ולאחר מכן מנותחות באמצעות ImageJ כדי למפות תכונות.

פרוטוקול פשוט למיפוי תכונות ארכיטקטורת מערכת שורש הצמח

אנו מציגים פרוטוקול למערכת ניסויית סמי-הידרופונית מבוססת זכוכית התומכת בגידול של מגוון צמחים מובחנים פילוגנטית עם או בלי מיקרואורגניזמים. המערכת תואמת למצעי גידול שונים ומאפשרת דגימת הפרשה שורשית לא הרסנית לניתוח במורד הזרם.

מערכת צנצנות זכוכית רב-תכליתית ליצירת פרופיל הפרשה סמי-הידרופוני של שורשים

למד מערכת הידרופונית פשוטה וזולה לגידול צמחים בתנאים סטריליים. השיטה מאפשרת ספיגה יעילה של מולקולות קטנות בשרשים Arabidopsis thaliana למחקרים מולקולריים ופיזיולוגיים בקנה מידה גדול.

עלות נמוכה גמיש מערכת הידרופונית להערכת תגובות צמח מולקולות קטנות בתנאים סטריליים

גלה סרטונים נוספים