Name: מסך 2-היברידית שמרים אצווה כדי להשוות בין אינטראקציות חלבון (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 23 s
Description: למדו את שיטת מסך 2-היברידית שמרים אצווה להשוואת פרופילי אינטראקציות חלבון מרובים. השיטה משתמשת בריצוף עמוק לזיהוי אינטראקטומים דיפרנציאליים בביולוגיה מולקולרית ותאית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לצוות בתוך המכון לגנטיקה אנושית על הגדרות ספריית הכנה ורצף. אנו מודים עינת שניר על המומחיות שלה בהכנת שברי ספרייה גנומית של הספריה פלסמיד Y2H כאן. עבודה זו נתמכה על ידי מכוני הבריאות הלאומיים: NIH R21 EB021870-01A1, על ידי ה-NSF מחקר פרויקט מענק: 1517110.

<ol><li>Fields, S., Song, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+genetic+system+to+detect+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A novel genetic system to detect protein-protein interactions.</a> Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).</li>
<li>Bruckner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+two-hybrid%2C+a+powerful+tool+for+systems+biology%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology.</a> International Journal of Molecular Sciences. 10 (6), 2763-2788 (2009).</li>
<li>Vidal, M., Fields, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+yeast+two-hybrid+assay%3A+still+finding+connections+after+25+years%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The yeast two-hybrid assay: still finding connections after 25 years.</a> Nature Methods. 11 (12), 1203-1206 (2014).</li>
<li>Pashkova, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DEEPN+as+an+Approach+for+Batch+Processing+of+Yeast+2-Hybrid+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">DEEPN as an Approach for Batch Processing of Yeast 2-Hybrid Interactions.</a> Cell Reports. 17 (1), 303-315 (2016).</li>
<li>Rajagopala, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+Protein-Protein+Interactome+Networks+Using+Yeast+Two-Hybrid+Screens%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Mapping the Protein-Protein Interactome Networks Using Yeast Two-Hybrid Screens.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 883, 187-214 (2015).</li>
<li>Weimann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Y2H-seq+approach+defines+the+human+protein+methyltransferase+interactome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A Y2H-seq approach defines the human protein methyltransferase interactome.</a> Nature Methods. 10 (4), 339-342 (2013).</li>
<li>Yachie, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pooled-matrix+protein+interaction+screens+using+Barcode+Fusion+Genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Pooled-matrix protein interaction screens using Barcode Fusion Genetics.</a> Molecular Systems Biology. 12 (4), 863(2016).</li>
<li>Trigg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CrY2H-seq%3A+a+massively+multiplexed+assay+for+deep-coverage+interactome+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">CrY2H-seq: a massively multiplexed assay for deep-coverage interactome mapping.</a> Nature Methods. , (2017).</li>
<li>Estojak, J., Brent, R., Golemis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+two-hybrid+affinity+data+with+in+vitro+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Correlation of two-hybrid affinity data with in vitro measurements.</a> Molecular and Cellular Biology. 15 (10), 5820-5829 (1995).</li>
<li>Rajagopala, S. V., Hughes, K. T., Uetz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benchmarking+yeast+two-hybrid+systems+using+the+interactions+of+bacterial+motility+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Benchmarking yeast two-hybrid systems using the interactions of bacterial motility proteins.</a> Proteomics. 9 (23), 5296-5302 (2009).</li>
<li>James, P., Halladay, J., Craig, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+libraries+and+a+host+strain+designed+for+highly+efficient+two-hybrid+selection+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genomic libraries and a host strain designed for highly efficient two-hybrid selection in yeast.</a> Genetics. 144 (4), 1425-1436 (1996).</li>
<li>Barbas, C. F. 3rd, Burton, D. R., Scott, J. K., Silverman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+DNA+and+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Quantitation of DNA and RNA.</a> CSH Protoc. 2007, pdb ip47(2007).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22485921">SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis of Proteins.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (4), (2006).</li>
<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li>
<li>Alegria-Schaffer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blotting+using+chemiluminescent+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Western blotting using chemiluminescent substrates.</a> Methods in Enzymology. 541, 251-259 (2014).</li>
<li>Plank, J. Practical application of Phenol/Chloroform extraction. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://bitesizebio.com/3651/practical-application-of-phenolchloroform-extraction/">http://bitesizebio.com/3651/practical-application-of-phenolchloroform-extraction/</a> (2018).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> Journal of Visualized Experiments. (62), (2012).</li>
<li>Harper, J. W., Adami, G. R., Wei, N., Keyomarsi, K., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+p21+Cdk-interacting+protein+Cip1+is+a+potent+inhibitor+of+G1+cyclin-dependent+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The p21 Cdk-interacting protein Cip1 is a potent inhibitor of G1 cyclin-dependent kinases.</a> Cell. 75 (4), 805-816 (1993).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף

כאן אנו מספקים מדריך כיצד לבצע מבחני Y2H אצווה באמצעות שיטות אופטימיזציה. ישנם כמה צעדים קריטיים במסגרת ההליך כדי לסייע להבטיח כי האוכלוסייה של שמרים כי להימצא תחת הבחירה הוא נציג של הספרייה ההתחלה, כי מספיק של האוכלוסייה שמרים המוצא משמש בתהליך הבחירה כדי להגביל את השתנות . חשוב לציין, אמות-מידה אלה הם קל יחסית להשיג לצד התאמת את שיטות וחומרים מסורתיים Y2H assay, ובכך גישה זו נגיש ברוב מעבדות מאובזרים עבור תקן ביולוגיה מולקולרית. DEEPN מאפשר בחירה ספריית טרף מאותה אוכלוסייה תוך שימוש פלסמידים שונים פיתיון. לפיכך, קבוצת ...

הבנה מלאה של התהליכים הביולוגיים תא מסתמך על מציאת הרשתות אינטראקציית חלבון העומדים בבסיס המנגנונים המולקולריים שלהם. גישה אחת כדי לזהות אינטראקציות חלבון הוא וזמינותו (Y2H) 2-היברידית שמרים, אשר עובד על ידי הרכבת פקטור שעתוק chimeric מתפקדת ברגע חלבון שני, תחומי עניין לאגד בזו1. מסך Y2H טיפוסי מבוצע על-ידי יצירת אוכלוסייה של שמרים כי בתים בשני ספריה של פלסמידים קידוד חלבונים שמעצבת דבוקה מפעיל גנים ברמת השעתוק (למשל., "טרף" חלבון כימרי) ולא על פלסמיד נתון "פיתיון" המורכבת של החלבון עניין התמזגו לתחום איגוד ה-DNA (למשל, התחום Gal4 DNA-איגוד המאגד רצף הפעלת נגד הזרם-Gal4). אחד היתרונות העיקריים של הגישה Y2H היא כי קל יחסית זול לבצע במעבדה טיפוסי מצויד עבור עבודה שוטפת ביולוגית מולקולרית2. עם זאת, כאשר מבוצעת באופן מסורתי, משתמש דוגמאות בודדות מושבות שעולות בעת הבחירה עבור השפעה חיובית הדדית Y2H. זה קשות מגביל את המספר של ספריית "טרף" שיבוטים זה יבדקו. בעיה זו היא הופכת למורכבת יותר כאשר השפע של טרף אינטראקציה מסוימת היא גבוהה מאוד ביחס לאחרים, צמצום הסיכוי של גילוי האינטראקציה של פלסמידים לטרף השפע נמוכה.
פתרון אחד לשימוש העיקרון Y2H ב כיסוי מקיף של פרוטאום הוא השימוש בגישה בתבנית מטריצה שבה מערך המכיל טרף בודדים הידועים פלסמידים יכולים דיגיטלית להיחקר. עם זאת, גישה כזו דורשת תשתית אינו נגיש בקלות או חסכונית לחוקרים בודדים אשר מעוניינים מגדיר את interactome של מספר קטן של חלבונים או תחומים3. בנוסף, ספריות טרף מאוד מורכב יכול לקודד שברים מרובים של חלבונים שמעצבת להרחיב גודל כזה מערכים מטריקס גדלים מעשית. חלופה אחת היא לבצע מבחני עם ספריות מורכבים בקבוצות להעריך את הנוכחות של אינטראקציה שיבוטים שימוש מסיבי מקביל בתפוקה גבוהה רצף4. זה ניתן ליישם assay הנוכחות של פלסמידים טרף העולות מושבות מרובות באמצעות טיפוסי Y2H מעוצב הגישה שמרים אילו תאים דיור בזוג אינטראקציה של חלבונים פיוז'ן רשאים לגדול על צלחת5,6. זה הרעיון הכללי יכול להיות הדגישה להגדיל השאילתה של שני פיתיון מרובים, טרף רכיבים באותו זמן7,8.
עדיין, חקירות רבות דורשות שקל יותר עדיין מתרכז יותר מאמץ רק כמה חלבון "פיתיונות', יכולים ליהנות יותר על-ידי שאילתת ממצה, חצי כמותית של ספריה טרף מורכבת אחת. יש שפותחה ואנו לאימות גישה לביצוע מחקרים אינטראקציה חלבון בהיקף נרחב באמצעות עיקרון Y2H אצווה תבנית4. זה משתמש קצב התרחבות פלסמיד מסוים טרף כמייצג העוצמה היחסית של האינטראקציה Y2H9. רצף עמוק של פלסמידים כל בתוך אוכלוסיה נתון הצמיחה רגילה או תנאי הגידול סלקטיבי מייצר מפה מלאה של שיבוטים המניבים אינטראקציות Y2H חזקות או חלשות. הרפרטואר של interactors יכול להיות שהושג, בהשוואה ישירות על פני פלסמידים מרובים פיתיון. זרימת העבודה וכתוצאה מכך כינה DEEPN (דינמי העשרה עבור הערכה של חלבונים רשתות) וכך ניתן לזהות interactomes דיפרנציאלית מספריות טרף אותו לזהות חלבונים, המאפשר השוואה בין חלבון אחד לעומת אחר.
. הנה, נדגים DEEPN להציג שיפור שיטות מעבדה זה להקל על השימוש בו, אשר מתוארים באיור1. שיפורים משמעותיים כוללים:
דור של אוכלוסיות השמרים טרף. אחת מהדרישות מפתח של DEEPN מייצר אוכלוסיות של שמרים עם פלסמידים שונים פיתיון שיש מאותה התפלגות של ספריות טרף פלסמיד. אוכלוסיות בסיסית המקבילה של הספרייה פלסמיד טרף חיוניים לייצור מדויק השוואות בין interactomes של פיתיונות שונים. זו מושגת בצורה הטובה ביותר כאשר פלסמיד ספריית שוכן כבר בקרב אוכלוסיה שמרים הפלואידי, לגור פלסמיד הפיתיון נתון של האוכלוסייה הזאת מושגת על ידי הזדווגות לייצר דיפלואידי. כאן, אנו מספקים מדריך ברור באיך להכין כזה אוכלוסיות באמצעות ספריות מסחריים בבניין שמרים הפלואידי. אמנם מצאנו שיטות לייצר מספר רב של diploids, היעילות הכוללת ההזדווגות של מסחרי ספריית המכילים שמרים זנים אלו היה נמוך. לכן, אנחנו נבנה זן חדש אשר יכול בית ספריות טרף המניבה diploids הרבה יותר לכל ההזדווגות התגובה.
ניו סט פתיונות פלסמידים. פלסמידים הנוכחי רבים המבטאים "פיתיון" פיוז'ן חלבונים מורכבת של החלבון של עניין לתחום ה-DNA מחייב הם מבוססי 2µ, ומאפשר להם להגביר את מספר העותק שלהם. מספר עותק זה יכול להיות משתנה מאוד באוכלוסייה, להוביל השתנות בתגובה תעתיק Y2H. זה בתורו יכול להטות את היכולת לאמוד את עוצמת האינטראקציה חלבון נתון בהתבסס על התגובה צמיחה של תאים תחת בחירת. זו יכולה להיות חלקית כתובת על-ידי שימוש של פלסמיד עותק נמוכה, אשר חלקם תוארו קודם לכן כגון זמינים מסחרית pDEST3210. ואנחנו נבנה על חדש פיתיון פלסמיד (pTEF-GBD) מייצרת Gal4 DNA-מחייב תחום היתוך חלבונים בתוך פלסמיד מבוססי צנטרומר עותק נמוך TRP1 נושא את הגן ההתנגדות Kanr המאפשר גם שיבוט של פיתיון קטעים שני במעלה הזרם, במורד הזרם של התחום מחייב Gal4 DNA.
ספריית קטע חדש בצפיפות גבוהה Y2H. אנו נבנה על פלסמיד חדש לספריות טרף Y2H הבית, השתמשו בו כדי לבנות ספרייה Y2H מורכב מסיבים של אקראי הוטו שברי DNA גנומי האפייה. ניתוח רצף הראו כי בספריה זו היה מעל 1 מיליון רכיבים שונים, הרבה יותר מורכב מאשר שמרים שתואר לעיל גנומית Y2H פלסמיד ספריות11. עם הספרייה החדשה, הצלחנו להראות זרימת העבודה DEEPN יציבה מספיק כדי להכיל את ספריות מורכב עם הרבה פלסמידים שונים באופן אמין, לשחזור.

<table><tbody><tr><td>פלטפורמת ריצוף עמוק</td> <td>של Illumina HiSeq 4000</td><td>Illumina</td><td></td></tr><tr><td>נוגדנים חד-שבטיים נגד HA</td><td>Biolegend</td><td>901514</td><td>נוגדן ראשוני לזיהוי ביטוי של HA במבנים pGal4AD</td></tr><tr><td>נוגדנים אנטי-myc פוליקלונליים</td><td>QED Biosciences</td><td>Inc 18826</td><td>נוגדן ראשוני לזיהוי ביטוי של MYC במבני pTEF-GBD NarI</td></tr><tr><td></td><td>New England BioLabs</td><td>R0191S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>ניו אינגלנד BioLabs</td><td>R3101S</td><td></td></tr><tr><td>BamHI-HF</td><td>ניו אינגלנד BioLabs</td><td>R3236S</td><td></td></tr><tr><td>XhoI</td><td>ניו אינגלנד BioLabs</td><td>R0146S</td><td></td></tr><tr><td>פוליאתילן גליקול 3350, אבקה</td><td>J.T. Baker</td><td>U2211-08</td><td></td></tr><tr><td>סלמון זרע DNA</td><td>Trevigen, Inc נמכר על ידי Fisher Scientific</td><td>50-948-286</td><td>DNA נשא לטרנספורמציה של שמרים סעיף 3.2.1.</td></tr><tr><td>Kanamycin Monosulfate</td><td>מחקר מוצרים בינלאומיים</td><td>K22000</td><td></td></tr><tr><td>LE Agarose</td><td>GeneMate</td><td>E-3120-500</td><td>המשמשים לייצור DNA agarose ג'לים</td></tr><tr><td>נתרן כלוריד</td><td>מוצרי מחקר בינלאומיים</td><td>S23025</td><td></td></tr><tr><td>טריפטון</td><td>מוצרי מחקר בינלאומיים</td><td>T60060</td><td></td></tr><tr><td>D-סורביטול</td><td>מוצרי מחקר בינלאומיים</td><td>S23080</td><td></td></tr><tr><td>ליתיום אצטט דיהידראט</td><td>MP ביומדיקל</td><td>155256</td><td></td></tr><tr><td>סידן כלורי</td><td>ThermoFisher</td><td>C79</td><td></td></tr><tr><td>EDTA נתרן מלח</td><td>מחקר מוצרים בינלאומי</td><td>E57020</td><td></td></tr><tr><td>אבקת תמצית שמרים</td><td>מוצרי מחקר בינלאומי</td><td>Y20020</td><td></td></tr><tr><td>שמרים בסיס חנקן (אמוניום גופרתי) ללא חומצות</td> <td>אמינומוצרי מחקר בינלאומיים</td><td>Y20040</td><td></td></tr><tr><td>CSM-Trp-Leu+40ADE</td><td>Formedium</td><td>DCS0789</td><td></td></tr><tr><td>CSM-Trp-Leu-His+40ADE</td><td>Formedium</td><td>DCS1169</td><td></td></tr><tr><td>CSM-Leu-Met</td><td>Formedium</td><td>DCS0549</td><td></td></tr><tr><td>CSM-Trp-Met</td><td>Bio 101, Inc</td><td>4520-922</td><td></td></tr><tr><td>L-Methionine</td><td>Formedium</td><td>DOC0168</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Adenine Research Products International</td><td>A11500</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Research Products International</td><td>G32045</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td>המשמש לייצור לוחות מדיה בסעיף 1</td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Research Products International</td><td>P20240</td><td></td></tr><tr><td>3-amino-1,2,4 Triazole</td><td>Sigma</td><td>A8056</td><td></td></tr><tr><td>2- מרקפטואהנול (BME)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>זימוליאז 100T</td><td>USBiological</td><td>Z1004</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן פוספט דו-בסיסי</td><td>סיגמא</td><td>P8281</td><td></td></tr><tr><td>פנול: כלורופורם: IAA</td><td>אמביון</td><td>AM9732</td><td></td></tr><tr><td>אמוניום אצטט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>238074</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>דקון מעבדות, INC</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>RNAse A</td><td>ThermoFisher</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr>מוצרי מחקר<td>אוריאה</td><td>בינלאומיים</td><td>U20200</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>מוצרי מחקר בינלאומיים</td><td>L22010</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Gibco</td><td>15506-017</td><td></td></tr><tr><td>ברומופנול כחול</td><td>אמרסקו</td><td>449</td><td></td></tr><tr><td>ערכת שיבוט הרכבה של גיבסון</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>E5510S</td><td>שיטת הרכבה מהירה לשיבוט פלסמידים בסעיף 2</td></tr><tr><td>NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>M0541S</td><td>משמש להגברה של מוצרים להרכבת גיבסון בסעיף 2.3 וכן הכנת מדגם לריצוף עמוק של DEEPN בסעיף 6.2.1</td></tr><tr><td>Ethidium Bromide</td><td>Amresco</td><td>0492-5G</td><td></td></tr><tr><td>ערכת טיהור PCR QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>משמשת לטיהור מוצרי PCR בסעיף 6.2.3</td></tr><tr><td>ערכת מיצוי ג'ל Qiaquick DNA</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>משמשת לטיהור pTEF-GBD מעוכל בסעיף 2.1</td></tr><tr><td>ערכת KAPA Hyper Prep</td> ערכת הכנה <td>KAPA Biosystems</td><td>KK8500</td><td>לריצוף עמוק</td></tr><tr><td>אופטימיזציה של קודון</td><td>http://www.jcat.de</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אופטימיזציה של קודון</td><td>https://www.idtdna.com/CodonOpt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>gBlocks</td><td>טכנולוגיות</td><td></td> DNA <td>משולבות שברי DNA המשמשים לשיבוט בסעיף 2.2</td></tr><tr><td>מחרוזות</td><td>מקטעי DNA של תרמופישר</td><td></td><td>המשמשים לשיבוט בסעיף 2.2</td></tr><tr><td>ערכת מיני-הכנה של GenCatch Plasmid DNA</td><td>EPOCH מדעי</td><td></td> החיים <td>המשמשים להכנת כמויות DNA בסעיף 2.3</td></tr><tr><td>Covaris E220</td><td>Covaris</td><td></td><td>אולטרה-סוניקטור בעל ביצועים גבוהים בסעיף 7</td></tr><tr><td>oligo nucelotide 5'- CGGTCTT CAATTTCTCAAGTTTCAG -3'</td><td>טכנולוגיות DNA משולבות או Thermofisher</td><td></td><td>המשמשות להגברה ורצף PCR 5 'הכנס pTEF-GBD במהלך בניית פלסמיד</td></tr><tr><td>oligo nucelotide 5'-GAGTAACG ACATTCCCAGTTGTTC-3'</td><td>טכנולוגיות DNA משולבות או Thermofisher</td><td></td><td>המשמשות להגברה ורצף PCR 5 'הכנס pTEF-GBD במהלך בניית פלסמיד</td></tr><tr><td>oligo nucelotide 5'-CACCGTAT TTCTGCCACCTCTCTC-3'</td><td>טכנולוגיות DNA משולבות או Thermofisher</td><td></td><td>המשמשות להגברה ורצף PCR 3 'הכנס pTEF-GBD במהלך בניית פלסמיד</td></tr><tr><td>oligo nucelotide 5'-GCAACCGC ACTATTTGGAGCGCTG-3'</td><td>טכנולוגיות DNA משולבות או Thermofisher</td><td></td><td>המשמשות להגברה ורצף PCR 3 'הכנס pTEF-GBD במהלך בניית פלסמיד</td></tr><tr><td>אוליגונוקלאוטיד 5'-GTTCCGATG CCTCTGCGAGTG-3'</td><td>טכנולוגיות DNA משולבות או Thermofisher</td><td></td><td>5' Pimer המשמש להגברת הכנסה של pGAL4AD</td></tr><tr><td>oligonucelotide 5'-GCACATGCT AGCGTCAAATACC-3'</td><td>טכנולוגיות DNA משולבות או Thermofisher</td><td></td><td>3' Pimer המשמש להגברת הכנסה של pGAL4AD</td></tr><tr><td>oligonucelotide 5'-ACCCAAGCA GTGGTATCAACG-3'</td><td>טכנולוגיות DNA משולבות או Thermofisher</td><td></td><td>5' Pimer המשמש להגברת הכנסה של pGADT7</td></tr><tr><td>oligonucelotide 5'- TATTTAGA AGTGTCAACAACGTA -3'</td><td>טכנולוגיות DNA משולבות או Thermofisher</td><td></td><td>3' Pimer המשמש להגברת הכנסה של זן שמרים pGADT7</td></tr><tr><td>PJ69-4A MatA</td><td>http://depts.washington.edu/yeastrc/ ג'יימס פ, האלאדיי ג'יי, קרייג EA: ספריות גנומיות וזן מארח המיועד לבחירה דו-היברידית יעילה ביותר בשמרים. גנטיקה 1996 144:1425-1436</td><td></td><td>MATA leu2-3,112 ura3-52 trp1-901 his3-200 gal4D, gal80D, GAL-ADE2 lys2::GAL1-HIS3 met2::GAL7</td></tr><tr><td>pTEF-GBD</td><td>ד"ר רוברט פייפר מעבדה</td><td></td><td>Gal4-DNA מחייב ביטוי doimain פלסמיד</td></tr><tr><td>pGal4AD (pPL6343)</td><td>ד"ר רוברט פייפר מעבדה</td><td></td><td>Gal4-הפעלה דומיין ביטוי פלסמיד</td></tr><tr><td>100 מ"מ צלחות פטרי</td><td>Kord-Vallmark נמכר על ידי VWR</td><td>2900</td><td></td></tr><tr><td>125 מ"ל בקבוק PYREX Erlenmeyer</td><td>Fisher Scientific</td><td>S63270</td><td></td></tr><tr><td>250 מ"ל בקבוק PYREX Erlenmeyer Fisher</td><td>Scientific</td><td>S63271</td><td></td></tr><tr><td>1,000 מ"ל בקבוק PYREX Erlenmeyer Fisher</td><td>Scientific</td><td>S63274</td><td></td></tr><tr><td>2,000 מ"ל בקבוק PYREX Erlenmeyer Fisher</td><td>Scientific</td><td>S63275</td><td></td></tr><tr><td>20 X 150 מ"מ צינור תרבית חד פעמי</td><td>Thermofisher</td><td>14-961-33</td><td></td></tr><tr><td>פיפט-אייד</td><td>דראמונד</td><td>4-000-100</td><td></td></tr><tr><td>5 מ"ל פיפטה סרולוגית</td><td>דנוויל</td><td>P7127</td><td></td></tr><tr><td>10 מ"ל פיפטה סרולוגית</td><td>דנוויל</td><td>P7128</td><td></td></tr><tr><td>25 מ"ל פיפטה סרולוגית</td><td>דנוויל</td><td>P7129</td><td></td></tr><tr><td>1,000 מ"ל PYREX גריפין</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>02-540P</td><td></td></tr><tr><td>1,000 מ"ל PYREX בקבוק אחסון מדיה לשימוש</td> חוזר <td>פישר סיינטיפיק</td><td>06-414-1D</td><td></td></tr><tr><td>1,000 מ"ל צילינדר מדורג</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>08-572-6G</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax 190</td><td>מכשירים</td><td></td> מולקולריים <td>המשמשים למדידת הצפיפות האופטית של תאים</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000</td><td>ספקטרופוטומטר המשמש לכימות כמות ה-DNA</td></tr><tr><td>UV אלקטרוני טרנס-אילומינטור</td><td>Ultra Lum</td><td>MEB 20</td><td>המשמש להדמיית DNA בג'ל אגרוז אתידיום ברומיד</td></tr><tr><td>P1000 גילסון פיפטמן</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>F123602G</td><td></td></tr><tr><td>P200 גילסון פיפטמן</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>F123601G</td><td></td></tr><tr><td>P20 גילסון פיפטמן</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>F123600G</td><td></td></tr><tr><td>P10 גילסון פיפטמן</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>F144802G</td><td></td></tr><tr><td>1250 ומיקרו; L טיפים פיפטה שמירה נמוכה</td><td>GeneMate</td><td>P-1236-1250</td><td></td></tr><tr><td>200 ומיקרו; טיפים לשימור פיפטות LLow</td><td>VWR</td><td>10017-044</td><td></td></tr><tr><td>10 ומיקרו; L XL קצות פיפטה שמירה נמוכה</td><td>VWR</td><td>10017-042</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל צינור חרוטי</td><td>VWR</td><td>490001-627</td><td></td></tr><tr><td>15 מ"ל צינור חרוטי</td><td>VWR</td><td>490001-621</td><td></td></tr><tr><td>מגרד תאים</td><td>דנוויל סיינטיפיק</td><td>TC9310</td><td></td></tr><tr><td>1.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה</td><td>ארה"ב מדעי</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>פלוקה אנליטי</td><td>318949-1L</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>J.T. Baker</td><td>5674-02</td><td></td></tr><tr><td>אפליקטורים מעץ</td><td>Solon Care</td><td>55900</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf microcentrifuge 5424</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-400-005</td><td>מיקרוצנטריפוגה</td></tr><tr><td>Sorvall ST16R</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75004381</td><td>צנטריפוגה ספסל</td></tr><tr><td>Amersham ECL Rabbit IgG, AB שלם מקושר HRP (מחמור)</td><td>GE Healthcare</td><td>NA934-1ML</td><td>נוגדן משני</td></tr><tr><td>Amersham ECL עכבר IgG, מקושר HRP Ab שלם (מכבשים)</td> <td>GE Healthcare</td><td>NA931-1ML</td><td>נוגדן משני</td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico מצע כימילומינסנט</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific 34080</td><td>פתרון זיהוי ECL</td></tr><tr><td>חממת איזוטמפ</td><td>Thermo Fisher חממה מדעית</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mutitron 2</td><td>INFORS HT</td><td></td><td>חממת טלטול</td></tr><tr><td>איזוטמפ בקרה דיגיטלית אמבט מים דגם 205</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td></td><td>אמבט מים</td></tr><tr><td>Y2H עכבר ספריית cDNA ב-Y187 (רקמת פאן)</td> <td>Clontech</td><td>630482</td><td>ספריית cDNA זמינה מסחרית ספריית cDNA</td></tr><tr><td>עכבר Y2H ב-Y187 (מוח עכבר)</td><td>Clontech</td><td>630488</td><td>ספריית cDNA זמינה מסחרית</td></tr><tr><td>pGADT7 AD וקטור</td><td>Clontech</td><td>630442</td><td>וקטור AD זמין מסחרית המאכלס ספריות cDNA רבות</td></tr><tr><td>pGBKT7 DNA-BD וקטור</td><td>Clontech</td><td></td><td>630443 זמין מסחרית DNA-BD וקטור</td></tr><tr><td>ביולאז DNA פולימראז</td><td>ביולין</td><td>BIO-21042</td><td>DNA פולימראז המשמש לסעיף 2.4</td></tr><tr><td>GeneMate GCL-60 Thermal Cycler</td><td>BioExpress</td><td>P-6050-60</td><td>pcr מכונת</td></tr><tr><td>TempAssure 0.5 מ"ל צינורות PCR</td><td>ארה"ב סיינטיפיק</td><td>1405-8100</td><td></td></tr></tbody></table>

מסך 2-היברידית שמרים אצווה כדי להשוות בין אינטראקציות חלבון

A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions

הקרנה עבור אינטראקציות חלבון-חלבון באמצעות שמרים 2-היברידית וזמינותו כבר זמן רב כלי יעיל, אך השימוש בה במידה רבה הוגבלה לגילוי של interactors גבוהה-זיקה כי הם מאוד מועשרים בספריה של מועמדים אינטראקציה. בתבנית מסורתית, שמרים 2-היברידית וזמינותו יכולות להניב מושבות רבות מדי לנתח כאשר ניצח ב לכתחילה נמוך שבו זיקה נמוכה interactors שעשויים להימצא. יתר על כן, ללא חקירה מקיפה ושלמה של הספרייה אותו נגד פלסמידים שונים פיתיון, ניתוח השוואתי אינה יכולה להיות מושגת. למרות חלק מבעיות אלו ניתן לטפל באמצעות ספריות טרף ערוכים, עלות והתשתיות הדרושים להפעלת מסכי כזה יכול להיות אסורה. כחלופה, אנו הסתגלו שמרים 2-היברידית וזמינותו לחשוף בו זמנית עשרות ארעי, אינטראקציות חלבון סטטי בתוך מסך אחד ניצול אסטרטגיה כינה DEEPN (העשרה דינמי עבור הערכה של חלבונים רשתות), אשר משלבת רצפי DNA תפוקה גבוהה וחישוביות לעקוב אחר ההתפתחות של אוכלוסיה של פלסמידים אשר קידוד שותפים אינטראקציה. כאן, אנו מתארים ריאגנטים מותאם אישית ופרוטוקולים לאפשר מסך DEEPN להורג בקלות וביעילות.

וזמינותו Y2H כבר בשימוש נרחב לאיתור אינטראקציות חלבון: חלבון, פותחו מספר עיבודים ומערכות. ברוב המקרים, שאותם שיקולי המסייעות להבטיח הצלחה עם הגישות הקודמות האלה חשובים עבור DEEPN. חלק חשוב אמות כוללות: הבטחת ביטוי של תחום ה-DNA מחייב חלבונים פיוז'ן, הבטחת רקע נמוך של כדין שלו + צמיחה diploids המכילה הפיתיון של האינטרס פלסמיד טרף ריק, יעילות גבוהה ההזדווגות של הפיתיון המכילים שמרים מאטה עם הספריה המכיל שמרים MATalpha, ואפילו בסופו של דבר, נמוך-לכתחילה תנאים המאפשרים האוכלוסייה לגדול בתנאים...

עיבוד אצווה של שמרים 2-היברידית מסכים מאפשר השוואה ישירה של הפרופילים האינטראקציה של מספר חלבונים הפיתיון עם סט מורכב של חלבונים פיוז'ן טרף. כאן, אנו מתארים שיטות מעודן, ריאגנטים החדש וכיצד ליישם ושימושם עבור מסכי כזה.

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the ...

שיטה זו משתמשת בעקרון של מערכת השמרים 2-היברידית בשתי האוכלוסיות כדי לזהות אינטראקציות חלבון-חלבון העונות על שאלות מפתח לגבי מגוון תהליכים מולקולריים ותאיים. טכניקה זו ממנפת ריצוף עמוק כדי לראות את האינטראקציות של חלבון אחד לעומת אחר. מכיוון שגישה זו מכוונת לבצע השוואות מקבילות, היא יכולה לזהות קבוצות של חלבונים המקיימים אינטראקציה עם חלבון אחד לעומת אחר או אישורים שונים של אותו חלבון או תוך כדי הקלדת גרסה מוטנטית הגורמת למחלה, כדי לחשוף אינטראקטומות דיפרנציאליות.פלסמיד חדש של שמרים 2-היברידיים pTEF-GBD נבנה עבור הליך זה כמתואר בפרוטוקול הטקסט. פלסמיד זה מייצר חלבוני היתוך בתחום קשירת DNA של Gal4 בתוך פלסמיד עותק נמוך מבוסס צנטרומר TRP1 הנושא את גן העמידות לקנמיצין המאפשר גם שיבוט של שברי פיתיון הן במעלה הזרם והן במורד הזרם של תחום קשירת ה-DNA Gal4. פלסמיד פיתיון זה שימש להפיכת שמרי MATa, וביטוי חלבוני היתוך פיתיון Gal4 אומת על ידי אימונובלוטינג עם נוגדנים נגד MIC.בנוסף, נוצרה ספרייה חדשה של שמרים 2-היברידיים בווקטור פלסמיד הטרף היעיל PGAL4 AD. ה-DNA הגנומי פוצל על ידי גזירה, גודל נבחר, שונה עם מתאמים והוכנס ל-PGAL4-AD כדי ליצור את ספריית השמרים ההיברידית saxairtab 2. כדי להתחיל בהליך ליצירת אוכלוסיות שמרים עם ספריות פיתיון וטרף, יש לחסן שלוש תרביות מיליליטר של כל אחד משנאי השמרים MATa הנושאים את הטריפ השונים המכיל פלסמידים פיתיון ומדיום טריפ CSM מינוס טריפ.כלול שתי תרביות נפרדות, המכילות את הפלסמיד הווקטורי בלבד, כדי לשמש כבקרות פרוצדורליות. דגרו על התרביות בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס ו-200 סל"ד למשך שש שעות. לאחר מכן יש לדלל כל תרבית לתרבית של 25 מיליליטר בבקבוק ארלנמאייר סטרילי ולדגור למשך הלילה.הפשירו שפל קפוא של תאי אלפא MAT המכילים את ספריית הטרף הנושאת lu2 בטמפרטורת החדר. השתמש בכל התאים המופשרים כדי לחסן 125 מיליליטר של CSM מינוס לו מינוס מדיום פגש בבקבוק ארלנמאייר סטרילי. גדל את התרבות ב-30 מעלות צלזיוס ו-200 סל"ד בן לילה.למחרת, לאחר אישור כי ה-OD600 של מחצלת הלילה תרביות טרנספורמנט נעות בין 1.0 ל-1.5, העבירו את התרביות לצינורות חרוטיים של 50 מיליליטר וצנטריפוגות שוות ערך ל-21 OD 600 של כל תרבית ב-4,696 פעמים גרם בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. השעו מחדש כל כדור של תאים מחצלת ב -10 מיליליטר מים סטריליים, העבירו את התרחיף לצינור חרוטי חדש של 50 מיליליטר וצנטריפוגה ב -4, 696 פעמים גרם בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. בעזרת פיפטה, הסר בעדינות את הסופרנטנט, מבלי לשבש את התאים הגלולים, והשהה מחדש את הגלולה בארבעה מיליליטר של מדיום YPDA חוצץ ב-pH 3.7.על כל 10 תגובות הזדווגות רצויות, גלולה 39 OD 600 שווה ערך לזן אלפא מחצלת הנושאת את הפלסמידים של הספרייה בצינור חרוטי של 50 מיליליטר. השעו מחדש את תאי האלפא של המחצלת ב-10 מיליליטר מים סטריליים וגלולה מחדש בצינור חרוטי חדש של 50 מיליליטר ב-4,696 פעמים גרם בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. בעזרת פיפטה, הסר בעדינות את הסופרנטנט, מבלי לשבש את התאים הגלולים, והשהה מחדש את הכדור ב-10 מיליליטר של מדיום YPDA חוצץ ב-pH 3.7.כדי להגדיר כל תגובת הזדווגות, הוסף את הדברים הבאים לצינור חרוטי חדש של 50 מיליליטר: מיליליטר אחד של תאים שעברו טרנספורמציה של MAT-A, מיליליטר אחד של ספריית MAT-alpha המכילה תאים, ומיליליטר אחד של YPDA חוצץ ב-pH 3.7. דגירה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס עם תסיסה מסלולית עדינה למשך 90 דקות. לאחר 90 דקות, צנטריפוגה את התאים ב -4, 696 פעמים גרם בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את הכדור בשני מיליליטר של YPDA-YPD אחד לאחד. צלחו את כל שני מיליליטר התאים על צלחת YPD של 100 מיליליטר ודגרו בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך כ-20 שעות. כדי לקצור את התאים, פיפטה שניים עד שלושה מיליליטר של CSM מינוס לו מינוס מדיום טריפ על כל צלחת YPD והשתמש במגרד תאים כדי לעקור את התאים.פיפטה את התאים שנעקרו לתוך צינור חרוטי של 50 מיליליטר. שטפו את הצלחת ארבע עד חמש פעמים עם שניים עד שלושה מיליליטר של CSM מינוס לו מינוס מדיום טריפ על ידי שימוש בפיפטה של 1,000 מיקרוליטר כדי לזרוק את המדיום ולהוציא אותו בעדינות על פני משטח צלחת ה-YPD. צנטריפוגה של התאים ב -4, 696 פעמים גרם בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.השליכו את הסופרנטנט מכל צינור חרוטי והשעו מחדש את התאים ב-40 מיליליטר של CSM מינוס לו מינוס מדיום טריפ על ידי פיפטינג למעלה ולמטה. כדי להעריך את מספר התאים הדיפלואידים שנוצרו, יש לדלל ארבעה מיקרוליטרים של התערובת הדיפלואידית ל-200 מיקרוליטר ו-2,000 מיקרוליטר של CSM מינוס לו מינוס מדיום טריפ, בהתאמה. צלח 200 מיקרוליטר מכל דילול על צלחת מעשן הסיגריות מינוס לו מינוס כדי לייצג דילול מלא של אחד עד 10,000 ואחד עד 100,000 של מלאי הדיפלואידים שנקטפו.דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך 36 עד 40 שעות. השתמש מיד בשארית כל 40 מיליליטר של השעיית תאים כדי לחסן 500 מיליליטר של CSM מינוס לו מינוס מדיום טריפ בבקבוק ארלנמאייר של ליטר אחד. מדוד את ה-OD 600 של כל תרבית.דגרו את הצלוחיות הללו ב-30 מעלות צלזיוס, עם טלטול ב-180 סל"ד, עד שהן מגיעות לרוויה, שלוקחת בדרך כלל 36 עד 40 שעות. עקוב אחר צמיחת התאים ב-24 שעות ו-36 שעות על ידי מדידת OD 600. לפני שתמשיך בהליך, אשר את יעילות ההזדווגות של שני זני השמרים.נדרש מספר מינימלי של 200 מושבות על צלחת הדילול של 1 עד 10,000. לאחר שהתרביות הגיעו לרוויה, השתמש בפיפטה כדי להסיר אלוקווד של 20 מיליליטר מכל תרבית ולחסן צלוחיות ארלנמאייר של שני ליטר. בקבוק אחד המכיל 750 מיליליטר של CSM מינוס לו מינוס מדיום טריפ ובקבוק שני המכיל 750 מיליליטר של CSM מינוס לו מינוס טריפ מינוס המדיום שלו.עם הרמה הנמוכה ביותר של שלושה אמינו 124 טריאזול שמבטל רקע, שנקבע קודם לכן כמתואר בפרוטוקול הטקסט. ערבבו היטב את התרבויות החדשות על ידי מערבולת. לאחר מדידת ה-OD 600 הראשוני, דגרו על התרביות ב-30 מעלות צלזיוס, תוך טלטול ב-180 סל"ד, עד לרוויה, המתרחשת בדרך כלל תוך 24 שעות עבור CSM לא נבחר מינוס תרבית טריפ, אך יכולה לקחת יותר מ-70 שעות עבור תרביות בבחירה עבור אינטראקציות שמרים 2-היברידיות.לאחר שהתרבויות הגיעו לרוויה, הסר 11 מיליליטר מכל תרבית על ידי פיפטה ושקע את התאים בסיבוב של חמש דקות ב -4, 696 פעמים גרם בטמפרטורת החדר. השליכו את הסופרנטנט והמשיכו במיצוי הדנ"א כפי שמודגם בסעיף הבא. כדי להתחיל בהליך מיצוי ה-DNA, השתמש בפיפטה כדי להשעות מחדש כל כדור תא שהוכן קודם לכן ב-500 מיקרוליטר של מאגר TE חזק.מעבירים לצינור מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר ומוסיפים 10 מיקרוליטר ציר זימולאי לכל צינור. במכסה אדים, הוסיפו שלושה מיקרוליטרים של אתנול בטא מרקטול לכל צינור וערבבו היטב. דגירה בחממה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 עד 36 שעות.לאחר מכן, חלץ את הדגימות פעמיים עם 500 מיקרוליטר של אלכוהול איזולימלי פנול כלורופורם כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הוסיפו שבעה מיקרוליטרים של נתרן כלורי מולארי ו-900 מיקרוליטר קר כקרח, 100% אתנול וערבבו בהיפוך. משקעים את ה-DNA על ידי סיבוב במיקרו-צנטריפוגה ב-21, 130 פעמים גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.השליכו את הסופרנטנט על ידי פיפטינג ושטפו כל כדור שלוש פעמים עם 900 מיקרוליטר של 70% אתנול. משקעים את ה- DNA על ידי צנטריפוגה ב 21, 130 פעמים גרם למשך שתי דקות. לאחר הסרת שאריות האתנול, יבש את הכדורים ב-42 מעלות צלזיוס למשך שבע דקות.השעו מחדש כל כדור ב-120 מיקרוליטר של TE חזק פי 0.1 באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 90 דקות. פיפטה 60 מיקרוליטר של ה-DNA המופק לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה סטרילי של 1.5 מיליליטר. הוסף 120 מיקרוליטר של TE חזק ו-3.5 מיקרוליטר של מלאי RN ace A, החלק לערבב ודגירה ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה.הוסף שבעה מיקרוליטרים של חמישה אמוניום אציטט מולארי ו-900 מיקרוליטר קר כקרח, 100% אתנול לכל צינור. מערבבים על ידי היפוך ומשקעים את ה-DNA, כפי שהודגם קודם לכן. השעו מחדש את ה-DNA שטופל ב-RNace-A ב-55 מיקרוליטר של TE חזק פי 0.1 באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 90 דקות.לכמת את ה-DNA על ידי ספיגה ב-260 ננומטר. השלב הבא הוא לבצע PCR על תוספות ה- CDNA. בצע שתי תגובות PCR של 50 מיקרוליטר לכל דגימת DNA.לכל תגובה הוסף מים, חמישה מיקרוגרם של דגימת DNA, 25 פיקמולים מכל פריימר קדימה ואחורה התואמים לפלסמיד ספריית הטרף, ו-25 מיקרוליטר של תערובת מאסטר 2x PCR בנאמנות גבוהה. הגבירו את התגובות עם תוכנית זו. דה-נטורציה של 30 שניות ב-98 מעלות צלזיוס, 25 מחזורים של D-natrine ב-98 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות, אנליזציה ב-55 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, וזמני הארכה של שלוש דקות ב-72 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן דגירה של חמש דקות ב-72 מעלות צלזיוס.נתח כל תגובת PCR על ידי אלקטרופורזה של 1% DNA agrose chill עם ג'ל המכיל אתידיום ברום ודמיין את הג'ל על ידי תאורת UV. דגימות ללא ברירה מראות מריחה כללית של DNA, אך לאחר הבחירה ניתן להבחין ברצועות בודדות. שלב דגימות PCR כפולות וטהר באמצעות ערכה בהתאם להוראות היצרן.כמת את ה-DNA על ידי ספיגה ב-260 ננומטר בספקטרופוטומטר. לאחר מכן, בצע ריצוף עמוק, ואחריו עיבוד ואימות ביואינפורמטיקה כמתואר בפרוטוקול הטקסט. ספריית השמרים האקראית החדשה המפוצלת 2-היברידית שימשה בהליך המודגם ותוספות הפלסמיד המוגברות על ידי PCR נותחו על ידי ריצוף DEEP ועיבוד ביואינפורמטיקה באמצעות תוכנת DEEPN והושוו לספרייה שפורסמה בעבר.תרשים זה מציג את סדר הדירוג של קנים לכל גן בספריות חלקי קנים לכל גן שנמצא על ידי ריצוף גנום השמרים. היסטוגרמה זו מציגה את מספר הפלסמידים הייחודיים לכל גן המקודד מקטע שנמצא הן באזור קידוד החלבון והן במסגרת הקריאה התרגומית המתאימה. מוצגת השוואה בין מספרי הפלסמידים השונים בכל ספרייה המקודדים גנים של שמרים והפרופורציה שנמצאים ואינם נמצאים במסגרת הקריאה התרגומית הנכונה או מוכנסים לאחור.בסך הכל, לספרייה החדשה יש עוד הרבה פלסמידים שונים. שיטות אלו מבטיחות שניתן להעביר את הספרייה באופן שחזורי לתאים המכילים חלבוני פיתיון שונים וכי הליך הבחירה יכול להניב קבוצות ניתנות לשחזור של גנים מועשרים, ולהבדיל אותם כחלבונים ספציפיים המקיימים אינטראקציה עם מועמדים. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך כשבוע אם היא מבוצעת כראוי.רוב העבודה הזו היא דגירה של תרביות תאים, והזמן המעשי בפועל הוא רק כמה שעות. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור ליצור אוכלוסיות של מספר רב של תאים דיפלואידים בודדים כדי שניתן יהיה להעביר את הספרייה באופן שחזורי לתאים המכילים את חלבוני הפיתיון השונים. חשוב גם לשים לב היטב לתנאי הדילול ולקצב הגדילה של תאים עבור אותן אוכלוסיות העוברות סלקציה לתנאים חיוביים של שמרים 2-היברידיים.בעקבות הליך זה, שיטות חישוביות המוסברות בעבודה הנלווית יזהו את החלבונים המועמדים המקיימים אינטראקציה ויספקו נתיב לאימות אינטראקציות אלה באמצעות בדיקת שמרים מסורתית 2-היברידית או שיטות ביוכימיות אחרות. לאחר צפייה בסרטון זה, אמור להיות לך מושג טוב מאוד כיצד ליצור באופן שחזורי אוכלוסיות שמרים דיפלואידיות המכילות את ספריית הפלסמיד של הטרף ולגדל אותן באצווה כדי לבחור אינטראקציות חיוביות של שמרים 2-היברידיות. אל תשכח שעבודה עם ממיסים אורגניים, במהלך פרוטוקול טיהור ה-DNA, עלולה להיות מסוכנת וצריכה להיעשות במכסה המנוע עם כפפות וחלוק מעבדה.

a-yeast-2-hybrid-screen-in-batch-to-compare-protein-interactions

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

מיתוס מאפשר זיהוי רגיש של אינטראקציות חולף ויציב בין חלבונים לידי ביטוי cerevisiae אורגניזם מודל Saccharomyces. זה כבר מיושם בהצלחה מחקר אקסוגניים ושמרים חלבונים בממברנה נפרד על מנת לזהות שותפים באינטראקציה שלהם באופן תפוקה גבוהה.

Split-יוביקוויטין ממברנה שמרים בהתבסס שני היברידי (מיתוס) מערכת: כלי רב עוצמה עבור זיהוי חלבונים אינטראקציות

פיתחנו מקיף, משוחדת הגנום כולו מסכי להבין גנים סמים גנים הסביבה אינטראקציות. שיטות סינון אלה אוספים מוטציה מוצגים.

מסכי הגנום תחרותי של ספריות שמרים המבורקדים

סרטון זה מדגים את הבדיקה הדו-היברידית של שמרים כדי לזהות אינטראקציות עצמיות ספציפיות של חלבונים. בבדיקה זו, החלבון המעניין מתויג לשני תחומים של גורם שעתוק המקודד את האנזים β-גלקטוזידאז. כאשר שני החלבונים מתקשרים זה עם זה, הדבר גורם לשעתוק ולתרגום ליצירת האנזים, אשר מזוהה לאחר מכן באמצעות בדיקה ביוכימית.

בדיקת שמרים דו-היברידית לקביעת הקשר העצמי של חלבונים בתאי שמרים

בסרטון זה, אנו מדגימים את בדיקת השמרים ההיברידית האחת, אשר מזהה חלבונים מרובים המקיימים אינטראקציה עם דנ"א המטרה. תאי השמרים שעברו טרנספורמציה מכילים את רצף דנ"א המטרה במעלה הזרם של הגן המדווח. בנוסף, הם מבטאים חלבונים של פקטור שעתוק. כאשר החלבונים יוצרים קומפלקסים ונקשרים לדנ"א המטרה, הגן המדווח מתבטא וניתן לזהותו באופן אנזימטי.

בדיקה היברידית שונה של שמרים-אחד לזיהוי אינטראקציות קומפלקס חלבונים הטרומריים-DNA

מאמר זה מתמקד בזיהוי של מערכי נתונים אינטראקציה גבוה בין המארח בטוח וחלבוני הפתוגן באמצעות שילוב של שתי שיטות מאונך: שמרים שני היברידיים ואחרי assay אינטראקציה תפוקה גבוהה בתאי יונקים הנקרא HT-GPCA.

גישה השוואתית כדי לאפיין את הנוף של אינטראקציות בין חלבונים מאכסן לפתוגן

באמצעות מערכי חלבון המכיל כמעט את כל ס proteome cerevisiae הוא חקר לחקירה משוחדת מהירה של אלפי אינטראקציות חלבון-חלבון במקביל. שיטה זו יכולה להיות מנוצלת למולקולת חלבון קטן, שינוי posttranslational, ומבחנים אחרים בתפוקה גבוהה.

חיטוט Microarrays חלבון פונקציונלי בצפיפות גבוהה לזיהוי חלבונים אינטראקציות

חלבונים מתקשרים זה עם זה ואינטראקציות אלה קובעות במידה רבה את תפקודיהם. ניתן לזהות שותפים לאינטראקציה עם חלבונים בתפוקה גבוהה in vivo באמצעות בדיקת כושר שמרים המבוססת על בדיקת השלמת שבר חלבון דיהידרופולאט רדוקטאז (DHFR-PCA).

הקרנת הגנום כל חלבונים אינטראקציה ידי חלבון-בר השלמה Assay (PCA) בתאים חיים

חלבונים מפעיל בקטריאלי חשובים לקביעת זיהומים מוצלחים. פרוטוקול זה מתאר את זיהוי ניסיוני של שותפים מחייבים חלבוניים של חלבון מפעיל חיידקים המארחים הצמח הטבעי שלה. זיהוי אינטראקציות מפעיל אלה באמצעות השנייה היברידי מסכי שמרים הפך לכלי חשוב נפרם אסטרטגיות פתוגניות מולקולריות.

Unravelling תפקידו של מפעיל בקטריאלי מ פתוגן צמחים ללא לעיבוד בעזרת שמרי מסך דו-היברידי

שמרים שונה אחד assay היברידית שתוארו כאן היא הרחבה של שמרים קלאסיים אחד היברידית (Y1H) assay ללמוד ולאמת את האינטראקציה מורכבים חלבון ה- DNA heteromeric במערכת heterologous עבור כל מחקר גנומי פונקציונלי.

A השתנה- Hybrid מערכת אחת עבור חלבון Heteromeric מורכבות- DNA אינטראקציה מחקרים

רצף עמוק של אוכלוסיות השמרים שנבחר עבור אינטראקציות חיוביות שמרים 2-היברידית פוטנציאל התשואות שפע של מידע אודות אינטראקציה שותף חלבונים. כאן, אנו מתארים את הפעולה של ביואינפורמטיקה ספציפי כלים ותוכנות מעודכן המותאם אישית כדי לנתח נתונים רצף כזה המסכים.

Informatic ניתוח של נתוני רצף אצווה שמרים 2-היברידית המסכים

האינטראקציות של ביומולקולות, כגון אינטראקציות חלבון-חלבון, הן הבסיס המולקולרי של פונקציות ביולוגיות. אם ניתן לבודד מוטנטים ריקים/לקויים שחסרים באופן ספציפי את האינטראקציה הרלוונטית, הם יעזרו מאוד להבין את הפונקציות של אינטראקציה זו. מאמר זה מציג דרך יעילה לבודד מוטציות ריקות/לקויות אינטראקציה.

בידוד מוטנטים ריקים/לקויים באמצעות בדיקת שמרים דו-היברידית

למדו את שיטת מסך 2-היברידית שמרים אצווה להשוואת פרופילי אינטראקציות חלבון מרובים. השיטה משתמשת בריצוף עמוק לזיהוי אינטראקטומים דיפרנציאליים בביולוגיה מולקולרית ותאית.

מסך 2-היברידית שמרים אצווה כדי להשוות בין אינטראקציות חלבון

גלה סרטונים נוספים