Informatic ניתוח של נתוני רצף אצווה שמרים 2-היברידית המסכים

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי אופי האינטראקטומות של חלבונים. היתרון העיקרי בטכניקה זו הוא שכל העיבוד הביואינפורמטי מופעל על ידי ממשק קל לשימוש. תוכנה זו משתמשת בממשק משתמש גרפי ידידותי למשתמש שביולוגים מולקולריים, ביולוגים של התאים וביוכימאים שאין להם מומחיות רבה בביואינפורמטיקה יכולים להשתמש בו כדי להשלים את הניתוח שלהם בקלות.

בדרך כלל, אנשים חדשים בעיבוד נתוני רצף נאבקים מכיוון שתוכנות המחשב מבלבלות ומסורבלות. חשבנו שהפיכת האינפורמטיקה לקלה תהפוך את הטכניקה כולה לנגישה ושימושית הרבה יותר. השלב הראשון בהליך זה הוא הורדה והתקנה של תוכנת MAPster כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

לאחר מכן, הזן את הקבצים והפרמטרים הנדרשים דרך ראשי לשונית. בחר את כפתור ה-Pairwise המתאים כדי להזין את הקבצים לניתוח DEEPN. סובב את Pairwise אפשרות למצב כבוי כדי לפעול בפורמט קריאה יחידה.

טען קבצים ל-MAPster על ידי גרירה ושחרור לחלון המתאים. מהגנומים המאונדקסים המפורטים בתיבת הגנום, בחר מקור גנום DNA התייחסות המתאים למקור של מוסיף ספריית הטרף Y2H. מכיוון ש- HISAT2 תומך בריבוי הליכים, תחת התיבה הליכי משנה, ציין את מספר תהליכי המחשב שיש להקדיש לתוכנית המיפוי.

ציין שם קובץ פלט, מומלץ שם קצר אך תיאורי ללא רווח או תווים מיוחדים מכיוון ששם קובץ זה ישמש לאורך כל תהליך DEEPN. באמצעות פתח ספריית פלט לחצן, ציין תיקיה לפלט הקבצים הממופים. לאחר בחירת הקבצים והפרמטרים המתאימים, השתמש בלחצן הוסף לתור כדי להוסיף את משימת המיפוי לתור המשימות.

לאחר הזנת כל המשימות לתור המשימות, לחץ על לחצן הפעל תור. התחל את הניתוח הזה על ידי פתיחת תוכנת DEEPN. מהחלון הראשי, בחר את פרטי ספריית הטרף המתאימים מתיבת הבחירה העליונה.

בחר תיקייה שאליה ניתן לעבור את הקבצים המעובדים על-ידי לחיצה על לחצן תיקיית עבודה וניווט לספריית התיקיות. לאחר בחירת תיקיית עבודה, DEEPN תיצור שלוש תיקיות משנה עם השמות שצוינו. לניתוח מוצלח, הקפד למקם את קבצי ה-SAM הנכונים בתיקיות הנכונות ולדעת אילו קבצים מופו ואילו קריאות לא מופו.

אם אתה משתמש בקבצי sam המכילים קריאות ממופות ולא ממופות, כגון אלה שהופקו עם הגדרות ברירת המחדל של תוכנית MAPster, מקם אותם בתיקיית sam_files. התחל את העיבוד על ידי לחיצה על כפתור ספירת גנים פלוס יצירת צומת. זמן העיבוד תלוי בגודל ובמספר קבצי נתוני הרצף ובמהירות העיבוד של המחשב בו נעשה שימוש.

לאחר ש-DEEPN עיבד את הנתונים, תיווצר קבוצה מלאה של תיקיות. השלב הבא הוא לבצע ניתוח ביוצר הסטטיסטיקה. פתחו את Stat_Maker ולחצו על כפתור אימות ההתקנה.

אם הוא פועל בפעם הראשונה, Stat_Maker יתקין אוטומטית את R, JAGS ו-Bioconductor על ידי משיכת משאבים אלה מהאינטרנט. ברגע ש-R, JAGS ו-Bioconductor יזוהו, Stat_Maker יהפכו לפעילים ויאפשרו קלט נוסף של המשתמש. לחץ על בחר תיקיה כפתור כדי לנווט לתיקיית העבודה ש-DEEPN עיבד.

Stat_Maker ימצא ויפרט באופן אוטומטי את הקבצים לניתוח סטטיסטי בחלון. גרור ושחרר את הקבצים המתאימים מחלון רשימת הקבצים למעלה לחלונות הקבצים למטה עבור כל מערך נתונים וקטורי ופיתיון ועבור כל תנאי גידול, שלא נבחרו ונבחרו. חשוב לציין, Stat_Maker דורש מערכי נתונים כפולים עבור וקטור ריק בלבד, שתי דגימות של אוכלוסיות שלא נבחרו ושתי דגימות של נבחרים.

זה נותן הערכה של השונות בתוך הניסוי. לחץ על לחצן הפעלה. בהתאם למהירות המחשב, החישוב ייקח בין חמש ל-15 דקות.

התוצאות מהפלט Stat_Maker ממוקמות בתיקיית משנה חדשה בתוך תיקיית העבודה הראשית שכותרתה Stat_Maker תוצאות. סקור את התוצאות. כדי לסקור את הנתונים על כל מועמד פוטנציאלי, פתח את תוכנת DEEPN, בחר את פרטי ספריית הטרף המתאימים ולאחר מכן בחר את תיקיית העבודה הנכונה באמצעות תיקיית העבודה.

לחץ על לחצן Blast Query כדי לטעון חלון חדש. בתיבת הטקסט העליונה, הקלד את שם הגן או מספר GenBank NM כדי לבחור את הגן המועמד. שם הגן תואם לשם הרשום בקובץ הפלט של יוצר הסטטיסטיקה.

הקלד Enter או Return, אשר יוזם אחזור של הגן המבוקש. בחר אילו ערכות נתונים ישמשו לניתוח באמצעות התפריטים בחר ערכת נתונים. בדרך כלל, אלה כוללים את הווקטור בלבד ודגימות פיתיון שגדלו בתנאים לא סלקטיביים ואת דגימת הפיתיון שגדלה בתנאי בחירה.

בתחילה, טעינת הנתונים ושם הגן יכולה לקחת קצת זמן עם תוכנית Blast Query, אך ברגע שמערך הנתונים נטען, זה יעבור הרבה יותר מהר. Blast_Query יציג את נקודות ההיתוך לאורך רצף העניין ועד כמה כל נקודת היתוך נפוצה. ניתן להציג זאת הן בתבנית טבלה באמצעות הכרטיסיה תוצאות והן בתבנית גרפיקה באמצעות הכרטיסיה התוויה.

כדי לייצא תוצאות אלה לקובץ csv, לחץ על לחצן שמור csv בפינה השמאלית העליונה. מחלון DEEPN, לחץ על כפתור קרא עומק תחת נתח נתונים. לאחר פתיחת חלון עומק הקריאה, הקלד את מספר ה-NM בתיבת הטקסט העליונה.

השתמש בתפריט הנפתח כדי לבחור את מערך הנתונים הרלוונטי המכיל את הגן המועשר המעניין. השתמש בטבלה משמאל ובתצוגה הגרפית מימין כדי לקבוע כמה קריאות נמצאו בנתונים התואמים לגן המעניין. תוכנית Stat Maker מייצרת קובץ הניתן לצפייה באקסל המסכם את המידע הרלוונטי הדרוש לזיהוי חלבונים מועמדים הפועלים באינטראקציה.

מוצג גם הניתוח המקביל האם הפלסמידים המתאימים למועמד הטרף מכילים את מסגרת הקריאה הפתוחה המתאימה. שאילתת הפיצוץ מעריכה כל גן ומסדרת את המיקומים השונים על פי שכיחותם במערך הנתונים המכומת על ידי ה-ppm של המספר הכולל של הצמתים שנמצאו במסד הנתונים. בדוגמה זו, המיקום הנפוץ ביותר שהוא In ORF ו-In Frame הוא מיקום 867, מה שמצביע על כך שנוקלאוטיד 867 של GenBank NCBI Reference Sequence NM_019648 הוא ההתחלה של שבר הטרף.

גרפיקה זו מציגה רצף היפותטי וכיצד לעצב את האוליגו בעל חמשת הראשונים כדי ללכוד את המסגרת הנכונה ונקודת ההיתוך בין תחום ההפעלה של Gal4 לרצף הטרף המעניין. חלון עומק קריאה זה מראה כמה רצפים נמצאו בנתונים התואמים למיקומי הנוקלאוטידים של הרצף המעניין. לאחר השליטה, עיבוד הנתונים יכול להיעשות תוך 10 עד 20 שעות, לרוב ללא השגחה.

מסכי DEEPN וניתוח האינפורמטיקה המתאים יסללו את הדרך לחוקרים במגוון רחב של תחומים לחקור רשתות אינטראקציה עם החלבון המעניין אותם. תוכנית MAPster נועדה להקל על מיפוי קבצי רצף מניסויי DEEPN. הוא גם מספק שיטה ידידותית למשתמש למיפוי קבצי רצף להתייחסות ל-DNA עבור מגוון יישומים, כגון RNA-Seq או ChIP-Seq.

למרות שתוכנת DEEPN נבנתה במיוחד לעיבוד נתוני שמרים דו-היברידיים אצווה, ניתן להשתמש בה גם לעיבוד נתוני RNA-Seq. תוכנית Stat Maker לא רק חוזה אילו גנים נותנים אינטראקציה דו-היברידית אותנטית של שמרים, אלא היא גם אוספת מספר פרמטרים אחרים, כגון קריאת מידע על מסגרת, ומאפשרת לחוקרים לסנן במהירות את הלהיטים המועמדים שלהם. לאחר זיהוי חלבונים אינטראקטיביים מועמדים, חשוב לאמת את האינטראקציות באמצעות מבחנים דו-היברידיים סטנדרטיים של שמרים, מבחנים ביוכימיים או שיטות קשורות.