Name: Informatic ניתוח של נתוני רצף אצווה שמרים 2-היברידית המסכים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-28T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: חקור ניתוח אינטראקטומים חלבוניים באמצעות ריצוף עמוק של אוכלוסיות שמרים. תוכנת MAPster מספקת ממשק ידידותי שמאפשר לחוקרים לעבד נתונים ביואינפורמטיים בקלות וביעילות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מכוני הבריאות הלאומיים: NIH R21 EB021870-01A1, על ידי ה-NSF מחקר פרויקט מענק: 1517110.

1. מיפוי Fastq קבצים
הערה: התוכנה DEEPN, כמו גם תוכניות רבות ביואינפורמטיקה להשתמש DNA רצף נתונים שבו כל רצף לקרוא מופה עבור המיקום בהפניה הדנ א. מגוון רחב של תוכניות מיפוי יכול לשמש עבור זה כולל MAPster הממשק כאן העושה את התוכנית HISTAT2 כדי לייצר .sam קבצים המשמשים בצעדים העוקבים.
<ol><li>למפות את הנתונים רצף הגירסה הנכונה של הגנום. עבור ספריות Y2H ממוצא העכבר, השתמש הגנום mm10 UCSC; עבור אלה באמצעות גנים אנושיים, להשתמש הגנום הפניה UCSC hg38, עבור גנים האפייה , השתמש הגנום הפניה UCSC SacCer3.</li>
	<li>
התקן MAPster.
	<ol>
<li>MAPster תוכנה להוריד ולהתקין. התוכנה ניתן למצוא באמצעות דפדפן אינטרנט במקומות הבאים: https://github.com/emptyewer/MAPster/releases. HISAT2 פועל במערכות מבוססות Unix, כגון Apple Macintosh. מסיבה זו, התוכנית MAPster תפעל רק במערכות תואם כגון אפל מקינטוש ולינוקס. הערה: דרישות המערכת עבור Mac אפל הם: OSX 10.10 +, > 4gb זיכרון RAM, > שטח דיסק 500 ג'יגה-בתים, גישה לאינטרנט לצורך הורדת הפניה הגנום. משתמשים, ייתכן שיהיה עליך להתייעץ עם המוסדיים אותו אדם אם הארגון שלהם כולל פרוטוקולי אבטחה הגבלת זכויות והרשאות של מנהל.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הזן את הקבצים הנדרשים ואת הפרמטרים באמצעות הכרטיסיה "ראשי" (איור 1). בחר "Pairwise" הלחצן המתאים כדי להזין קבצים כמו זוגות או אינטראקצית עם FASTQ כתבנית קובץ ברירת המחדל.
	<ol>
<li>לניתוח DEEPN, הפעל את האפשרות "Pairwise" כדי "לא פעיל" כדי להפעיל בתבנית קריאה יחיד.</li>
		<li>טעינת קבצים MAPster פשוט על-ידי גרירה ושחרור לתוך חלון המתאים.</li>
		<li>בחר הפניה מקור ה-DNA/הגנום שמתאים למקור של Y2H טרף ספריית התוספות. אינדקס הגנום של מספר אורגניזמים דגם המפורטים בתיבת "גנום", ניתן באופן אוטומטי להוריד מאתר אוניברסיטת ג'ונס הופקינס מרכז עבור ביולוגיה חישובית. הפניה הגנום יאוחסנו באופן מקומי לשימוש מאוחר יותר.</li>
		<li>לציין את מספר תהליכים במחשב הייתה מוקדשת התוכנית מיפוי תחת התיבה "חוטים", מאז HISAT2 תומך מרובת השרשור. MAPster חפש את המחשב ולהציע את המספר המרבי של מעבדים הזמינים כברירת מחדל.</li>
		<li>ציין שם של קובץ הפלט. שם קובץ זה ישמש לאורך כל התהליך DEEPN אז מומלץ שם קצר אך תיאורי ללא רווח או תווים מיוחדים. ציין תיקיה פלט הקבצים הממופים באמצעות לחצן "ספריית פלט פתוח".</li>
		<li>פעם אחת את הקבצים המתאימים ופרמטרים נבחרו, להוסיף את העבודה מיפוי לתור עבודות באמצעות הלחצן "הוסף את התור". שמות הקבצים בחלון הראשי יכול להיות מחיקתם והחלפתם הקבצים המתאימים למדגם חדש, ניתן להוסיף לתור אחרי מתן שם קובץ פלט התואם.</li>
		<li>לחץ על לחצן "הפעל תור" לאחר כל העבודות מוזנות תור המשימות. הערה: לאחר עבודה מיפוי הושם בתור, בחירת העבודה הזו גורמת קביעות הפרמטר להציג את החלון "העבודה פרמטרים" ואת הצהרת שורת הפקודה עם כל הארגומנטים יוצג בחלון "העבודה הפקודה". האפשרויות פלט כוללות בימוי אם כדי לשמור על קריאות להיכשל ליישר וציון מספר היישורים העיקרי המותר עבור כל קריאה. קובץ פלט המהווה ברירת מחדל של MAPster נמצא בתבנית סאם (למשל קובץ '.sam'). זה יכיל את כל פעולות רצף הקריאה מקבצי ה-fastq שצוין עבור הדגימה כולל אלה שהיו (מיפוי) ולא היו (לא ממופים) ממופים בהצלחה geome שצוין.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Bioinformatic עיבוד באמצעות תוכנת DEEPN
הערה: התוכנה DEEPN עוברת קומפילציה כעת לשימוש עם טרף ספריות המכיל רצפי cDNA העכבר, רצפים cDNA אנושי או רצפי דנ א גנומי cerevisiae ס . DEEPN מקבל את תבנית הקובץ .sam רגיל, באפשרותך לקבל קובץ סאם (.sam) המכיל קריאות ממופים והן שאינן ממופות או קבצים נפרדים עבור כל הקריאות שאינן ממופות וממופים.
<ol><li>DEEPN תוכנה להוריד ולהתקין. התוכנה ניתן למצוא באמצעות דפדפן אינטרנט במקומות הבאים: https://github.com/emptyewer/DEEPN/releases. בחר איזו גירסה תואמת את פלטפורמת המחשוב ויכולת להורדה. כדי להתקין, פתח את חבילת ההתקנה שהורדת. הערה: גרסאות DEEPN זמינים עבור PC, Mac, ו- Linux sysrems. מערכות PC ו- Mac צריך > שטח דיסק קשיח 500 Gb ו > 4gb זיכרון RAM.</li>
	<li>
פתח את התוכנה DEEPN. מהחלון הראשי (איור 2) בחר את המידע המתאים ספריית טרף מתיבת הבחירה העליונה. בחרו תיקייה לאן הקבצים המעובדים ללכת על-ידי לחיצה על לחצן "תיקיית עבודה" ניווט אל התיקיה/הספריה. אחד ניתן ליצור תיקיה/ספריה חדשה במידת הצורך. לאחר "תיקיית עבודה", DEEPN תיצור שלוש תיקיות המשנה רשאי unmapped_sam_files, mapped_sam_files ו- sam_files.
	<ol>
<li>אם שימוש בקבצי .sam המכיל קריאות ממופים והן לא ממופים כגון אלה הופק באמצעות הגדרות ברירת המחדל של התוכנית MAPster, למקם אותם בתוך תיקיית 'sam_files'. אחרת למקם קבצים .sam unmapped_sam_files ו mapped_sam_files בהתאם.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ליזום עיבוד על-ידי לחיצה על לחצן "ג'ין ספירה + צומת הפוך". הערה: עיבוד יתחיל עם מודול ג'ין ספירת ישתמש מיפוי עמדות לספור כמה קריאות שיתאימו לכל הגנים. הופכים את צומת ואז לחלץ צומת רצפים (רצפי התמזגו ישירות במורד הזרם מהתחום Gal4-הפעלה) מ הקריאות ולזהות אותם באמצעות האלגוריתם הפיצוץ. פעולה זו תיצור קבוצה מלאה של התיקיות בתמונה באיור3. זמן עיבוד תלוי גודל ואת מספר קבצי נתונים רצף ואת מהירות העיבוד של המחשב המשמש. פעמים טיפוסי נע בין 12 – 30 h עבור הנתונים (dataset) ניסיוני של 250 מיליון ~ קורא. ההליך לספור גן וההליך Junction_Make ניתן להתחיל בנפרד על-ידי לחיצה על לחצן "ג'ין ספירת" או על הכפתור "צומת הפוך".</li>
	<li>
הורד והתקן Stat_Maker (https://github.com/emptyewer/DEEPN/releases). זוהי חבילה ניתוח סטטיסטי מיועד datasets DEEPN שעובד כיום רק במערכות Unix Mac.
	<ol>
<li>פתח Stat_Maker ולחץ על הלחצן 'אימות התקנת' (איור 4). אם מפעיל בפעם הראשונה, Stat_Maker יתקין באופן אוטומטי R, ג'אגים ו- Bioconductor על ידי משיכת משאבים אלה מהאינטרנט. ברגע R, ג'אגים ו Bioconductor מזוהים, Stat_Maker תהפוך לפעילה, לאפשר את המשך קלט משתמש.</li>
		<li>לחץ על הלחצן "בחר את תיקיית" כדי לנווט אל תיקיית העבודה שעיבד DEEPN. Stat_Maker באופן אוטומטי לחפש ולפרט את הקבצים לשם ניתוח סטטיסטי בחלון.</li>
		<li>גרור ושחרר את הקבצים המתאימים מהחלון רשימת קבצים מעל לתוך החלונות קובץ מתחת עבור כל ערכת נתונים וקטוריים וגם פיתיון ועבור כל תנאי הגידול: שלא נבחרו (שלו + המדיה) ונבחר (שלו - המדיה). חשוב, Stat_Maker דורש datasets כפולים עבור ריק וקטור לבד, שתי דגימות של אוכלוסיות שלא נבחרו שתי דוגמאות שנבחרו. זה נותן הערכה של השתנות בתוך הניסוי.</li>
		<li>לחץ על לחצן "הפעל". בהתאם למהירות המחשב, חישוב יימשך בין 5 ל-15 דקות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>תוצאות סקירה מהפלט Stat_Maker, אשר מוצבים בתוך תיקיית משנה חדשה בתוך תיקיית העבודה הראשי עם התווית "Stat_Maker תוצאות". הערה: התוצאות נמצאים בקובץ ה-CSV (ערכים מופרדים באמצעות פסיק) שניתן לפתוח במשותף תוכניות גליונות אלקטרוניים. Stat_Maker לדרג כניסות הגן נוטים להיות מועשר באופן שונה בעת הבחירה עם הפיתיון עניין על ריק pTEF-GBD (איור 5). ייערכו גם הוא האחוז של קריאות עבור כל ערכת נתונים בהן תותב ג'ין נמצא במעלה הנהר, במורד הזרם, או בתוך מסגרת קריאה פתוחה, אם הגן נמצא גם בתוך מסגרת קריאה translational נכונה. לעתים קרובות, DEEPN ללכוד חזקים Y2H אינטראקציות של פיתיון עם חלקים cDNA נתון זה אל מחוץ למסגרת שקריאה תקינה של החלבון המתאים או על חלק cDNA זה במורד הזרם של המסגרת המתאימה פתוח-קריאה. סריקה ופלט משולב Stat_Maker מייעל את זיהוי, חיסול של הפיגועים האלה לא רלוונטי.</li>
	<li>
כדי לסקור את הנתונים לגבי כל מועמד פוטנציאלי, פתח את התוכנה DEEPN, בחר את המידע המתאים של ספריית הטרף ואז תיקיית העבודה הנכון באמצעות התיקיה"עבודה".
	<ol>
<li>לחץ על לחצן "הפיצוץ השאילתה". זה טוען חלון חדש (איור 6). בתיבת הטקסט העליונה, הקלד את שם הגן או מספר GenBank NM כדי לבחור את המועמד הגן עניין. שמות גנים אלה תואמים את שמות הרשומים בקובץ הפלט StatMaker. סוג הזן או להחזיר, אשר יוזם אחזור של הגן עניין.</li>
		<li>בחר אילו נתונים (datasets) ישמש עבור ניתוח שימוש בתפריטים "בחר ערכת נתונים". בדרך כלל, אלה כוללים את הווקטור בלבד, פיתיון גדל בתנאים לא בררניים ודוגמאות המדגם פיתיון גדל בתנאים הבחירה. בתחילה, datasets ייקח כמה רגעים כדי לטעון, עם זאת, השאילתה עוקבות של datasets אותו עם גנים שונים יעבור במהירות. Blast_Query יציג את נקודות היתוך לאורך הרצף של עניין, והוא שופע איך כל נקודת היתוך. זה ניתן להציג גם תבנית טבלה באמצעות הכרטיסיה "תוצאות" או עיצוב גרפי באמצעות הכרטיסיה "עלילה". תוצאות אלו ניתן לייצא לקובץ csv באמצעות לחיצה על לחצן "שמור. csv" בפינה הימנית העליונה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. אימות של מועמדים המזוהה על-ידי DEEPN
הערה: המטרה של DEEPN ו- Stat_Maker הוא לזהות גנים המועמד לתת השפעה חיובית הדדית Y2H. אימות אינטראקציות Y2H כזה יכול להיות בוצע באמצעות תבנית מסורתי Y2H בינארית באמצעות פלסמיד פיתיון את עניין לשייך את פלסמיד תחום "טרף" Gal4-הפעלה ריק כמו גם לשייך את פלסמיד טרף נושא השבר הגן/cDNA עניין. . זה לא ריאלי כדי לבודד את פלסמיד בפועל של עניין בתוך התערובת של DNA מבודד מן האוכלוסייה שמרים נתון לבחירה Y2H... עם זאת, אחד יכול שהמפתחות לשחזר מה השבר הגן/cDNA הוא זה מייצר את האינטראקציה Y2H, תחל עבור 5' ו 3' קצוות הרסיס ומעצבים להגביר את מקטע ה-DNA מבודד מן האוכלוסייה שמרים. סעיף זה מתאר כיצד למצוא בקצה 5' ו 3' של השבר טרף המועמד.
<ol><li>פתחו את התוכנה DEEPN ובחרו את הפרמטרים "בחר פרמטר" ואת תיקיית עבודה "בחר לעבוד תיקיית" המתאים לפרויקט. להפעיל את המודול Blast_Query על-ידי לחיצה על לחצן "הפיצוץ השאילתה".</li>
	<li>
הקלד את השם של הגן מעניינים או GenBank שלה "NM" מספר בתיבת הטקסט העליונה. בחר מתוך התפריט הנפתח את ערכת הנתונים התואם באוכלוסייה שמרים שנבחרו על הכל, עניין כדי לאחזר את הטבלה של צומת עמדות תחת הכרטיסייה 'תוצאות'. כברירת מחדל, Blast_Query יורה את עמדות שונות על פי שלהם שפע ב- dataset, לכמת על ידי ppm המספר הכולל של צמתי נמצאו בתוך מסד הנתונים.
	<ol>
<li>תמצאו הנפוץ ביותר למקם את זה "ב ORF" , "במסגרת". הערך עבור מיקום מקביל נוקלאוטיד מיקומו של הגן עם הרצף הפניה NCBI (מס 'NM') נמצאו בתיבת הטקסט העליונה. הרצף הזה יכול להיות שאוחזר GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/) או העתקת תיבת הטקסט התחתון בחלון Blast_Query. הערה: ניתן למצוא לדוגמה איור 6, בחלונית האמצעית. ב- dataset מרכז, 'תוצאות' הצג צומת הנפוץ ביותר: 'מיקום': 867; '#Junctions': 20033.821; 'התחלה שאילתה', 1; תקליטורים: ב ORF; ' מסגרת ': מסגרת. נוקלאוטיד 867 של הרצף הפניה GenBank NCBI NM_019648 הוא ההתחלה של השבר טרף.</li>
	</ol>
</li>
	<li>אם ההתחלה שאילתה הוא 1, עיצוב 5' סוף המפתח כדי לכלול את נוקלאוטיד המתאים למספר עמדה והרחבת 25 נוקלאוטידים במורד הזרם מהעמדה הזו (איור 7). אם השאילתה להתחיל הוא יותר מ 1, הוא מציין כי יש נוספת נוקלאוטידים בין התחום הפעלה Gal4 לבין הרצף טרף עניין ולהתחיל כי תחל צריכה נוסף במורד הזרם לפי הערך להפעיל שאילתה.</li>
	<li>מן החלון DEEPN לחץ על לחצן "קריאה עומק" תחת "לנתח נתונים". לאחר פתיחת החלון לקריאה עומק, הקלד NCBI רצף (ננומטר) מספר או ג'ין שם ההפניה לתיבת הטקסט העליונה. השתמש בתפריט הנפתח כדי לבחור את ערכת הנתונים הרלוונטיים המכיל את הגן מועשר עניין. השתמש בטבלה משמאל ולהציג הגרפיקה על הזכות לקבוע כמה קריאות נמצאו נתונים התואמים הגן עניין (איור 7ב').</li>
	<li>עיצוב 3' סוף פריימר זה ללכוד את הרצף של השבר ג'ין מחושב על ידי קריאה עומק. אם השפע של קריאות מעבר ORF ו קודון, עיצוב ומהצמיגים תכלול את stop codon והן את האזור רק במעלה הזרם stop codon. אם רצפי הגן לא להרחיב מעבר stop codon, השתמש בטבלה התוצאות למצוא הכי רחוקות 3' באזור זה ניתן להבחין ולהשתמש עמדה זו הרחוק 3' עמדה כדי למקם את המפתח. הערה: התוכנית לקריאה עומק סורקת במרווחי זמן כדי למצוא את רצפי התואמים את cDNA/ג'ין שצוין עניין. זה עוזר לחזות איפה בקצה 5' ו 3' של השבר הטרף הנפוץ ביותר עבור הגן הזה במדגם. תנודות העומק קריאה לאורכו של הרצף הן נורמליות, כפי שניתן לראות באיור7. העומק קריאה ברור בעבר stop codon, מציין כי השבר טרף חורג stop codon, ובכך ומהצמיגים 3' פשוט יכולה להתאים את האזור סביב stop codon.</li>
	<li>
לבצע תגובת ה-PCR 50 µL לכל הגנים. כל התגובה מכילה 25 pmol של כל פריימר ואחורה תואמים את פלסמיד טרף-ספרייה (ראה טבלה של חומרים). תגובות מכילים גם µL 25 של אמינות גבוהה 2 x PCR מיקס מאסטר, µg 5 של דנ א ומים עד 50 µL.
	<ol>
<li>להגביר את תגובות עבור 25 מחזורי עם סיומת פעמים של 3 דקות ב-72 מעלות, חישול טמפרטורה של 55 ° C ל 30 s, ו denaturing ב 98 ° C עבור 10 ס' לפני רכיבה על אופניים על ידי דנטורציה s 30 ב 98 ° C ופעל עם הדגירה 5 דקות ב- 72 מעלות צלזיוס.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Fields, S., Song, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+genetic+system+to+detect+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A novel genetic system to detect protein-protein interactions.</a> Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).</li>
<li>Rajagopala, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+Protein-Protein+Interactome+Networks+Using+Yeast+Two-Hybrid+Screens%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Mapping the Protein-Protein Interactome Networks Using Yeast Two-Hybrid Screens.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 883, 187-214 (2015).</li>
<li>Weimann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Y2H-seq+approach+defines+the+human+protein+methyltransferase+interactome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A Y2H-seq approach defines the human protein methyltransferase interactome.</a> Nature Methods. 10 (4), 339-342 (2013).</li>
<li>Yachie, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pooled-matrix+protein+interaction+screens+using+Barcode+Fusion+Genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Pooled-matrix protein interaction screens using Barcode Fusion Genetics.</a> Molecular Systems Biology. 12 (4), 863(2016).</li>
<li>Trigg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CrY2H-seq%3A+a+massively+multiplexed+assay+for+deep-coverage+interactome+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">CrY2H-seq: a massively multiplexed assay for deep-coverage interactome mapping.</a> Nature Methods. , (2017).</li>
<li>Pashkova, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DEEPN+as+an+Approach+for+Batch+Processing+of+Yeast+2-Hybrid+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">DEEPN as an Approach for Batch Processing of Yeast 2-Hybrid Interactions.</a> Cell Reports. 17 (1), 303-315 (2016).</li>
<li>Kim, D., Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HISAT%3A+a+fast+spliced+aligner+with+low+memory+requirements%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">HISAT: a fast spliced aligner with low memory requirements.</a> Nature Methods. 12 (4), 357-360 (2015).</li>
<li>Reinert, K., Langmead, B., Weese, D., Evers, D. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25939052">Alignment of Next-Generation Sequencing Reads.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 16, 133-151 (2015).</li>
<li>Pertea, M., Kim, D., Pertea, G. M., Leek, J. T., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcript-level+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+HISAT%2C+StringTie+and+Ballgown%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Transcript-level expression analysis of RNA-seq experiments with HISAT, StringTie and Ballgown.</a> Nature Protocols. 11 (9), 1650-1667 (2016).</li>
<li>Conesa, A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26813401">A survey of best practices for RNA-seq data analysis.</a> Genome Biology. 17, 13(2016).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף

חבילת התוכנות המתוארים כאן מאפשרת לעבד ולנתח תפוקה גבוהה DNA רצף נתונים ניסוי DEEPN לחלוטין. בתוכנית הראשונה בשימוש הוא MAPster, אשר לוקח את קריאות רצף ה-DNA בקבצים רגילים fastq וממפה את עמדתם על הפניה דנ א לעיבוד הזרם על ידי שורה שלמה של אינפורמטיקה תוכניות כולל את התוכנה DEEPN. השירות של הממשק MAPster ואת יכולתו תור משימות מרובות, לשלב קבצי קלט, פלט coveniently שם קבצים, בשילוב עם המהירות של HISAT2 הבסיסית תוכנית7 שהיא שולטת מספק של מיפוי כלי קל לשימוש עבור מגוון רחב של יישומים מעבר DEEPN. MAPst...

גישה אחת לגלות אינטראקציות חלבון הוא שמרים 2-היברידית (Y2H) וזמינותו, אילו תוכנות המנצלות לרעה את מהונדסים תאי שמרים לגדול רק כאשר חלבון עניין נקשר שבר של אינטראקציה שותפים1. זיהוי של אינטראקציות מרובות Y2H יכול להיעשות עכשיו עם העזרה של רצף תפוקה גבוהה מקבילים מסיבית. מספר תבניות כבר תיאר2,3,4,5 כולל אחד פיתחנו שבו אוכלוסיות מגודלים באצוות בתנאים בחר עבור שמרים המכיל פלסמידים לייצר אינטראקציה חיובית Y2H6. זרימת העבודה אנחנו פיתח, הנקרא DEEPN (דינמי העשרה עבור הערכה של חלבונים רשתות), מזהה interactomes דיפרנציאלית מספריות טרף אותו לזהות חלבונים המקיימים אינטראקציה עם חלבון (או קבוצת המחשבים) אחד vs. חלבון אחר או תחום mutant conformationally נפרדים. אחד הצעדים העיקריים בתהליך זה הוא ראוי עיבוד וניתוח של הנתונים רצף ה-DNA. מידע שאפשר לקרוא על ידי רק ספירת מספר קריאות עבור כל ג'ין גם לפני וגם אחרי הבחירה של Y2H אינטראקציות באופן מקביל ניסוי ה-RNA-seq. עם זאת, מידע מעמיק הרבה יותר יכול להיות מופק אלה נתונים (datasets) כולל מידע על תחום המשנה של חלבון נתון זה הוא מסוגל לייצר אינטראקציה עם Y2H. בנוסף, ואילו הגישה DEEPN היא ערך, ניתוח רבים דוגמת משכפל יכול להיות מסורבל ויקר. בעיה זו הביאו להקלה באמצעות מודל סטטיסטי שפותחה במיוחד עבור DEEPN datasets איפה המספר של משכפל מוגבל6. כדי להפוך עיבוד וניתוח של ה-DNA רצף נתונים (datasets) מהימן, מלא, עמיד, או נגיש לחוקרים ללא מומחיות ביואינפורמטיקה, פיתחנו חבילת תוכניות שיכולות לכסות את כל השלבים של ניתוח.
הסוויטה לעמוד לבד תוכנות הפועלות במחשבים שולחניים כולל MAPster, DEEPN Stat_Maker. MAPster הוא ממשק משתמש גרפי המאפשר שכל קובץ fastq בתור עבור מיפוי הגנום באמצעות תוכנית ' HISAT2 '7, הפקת קובץ .sam תקן לשימוש ביישומים במורד הזרם. DEEPN יש כמה מודולים. זה מקצה וסופרת קריאות המתאים גן מסוים דומה כימות סוג RNA-seq בעזרת המודול "ספירת ג'ין". אותה גם מחלצת את רצפי המתאים בצומת שבין התחום תעתיק Gal4 ואת הרצף טרף, collates את המיקום של צמתים אלה כדי לאפשר בדיקה שלהם על ידי השוואתי טבלאות וגרפים (באמצעות המודול 'Junction_Make') המודול 'Blast_Query' מאפשר בדיקה קלה, כימות, השוואה של הרצף צומת Gal4 לצומת. Stat_Maker מעריך את הקריאות לפי ג'ין העשרת נתונים סטטיסטית כדרך של סדר עדיפויות להיטים Y2H סביר. כאן, אנו נתאר כיצד להשתמש מהתוכנות הללו, לנתח באופן מלא את רצף ה-DNA נתונים Y2H DEEPN הניסוי. גירסאות של DEEPN זמינים לפעול במערכות PC, Mac, ו- Linux. בתוכניות אחרות, כגון התוכנית מיפוי MAPster, מודול הסטטיסטיקה DEEPN Stat_Maker להסתמך על subroutines המופיעה תחת Unix, הינם זמינים רק במערכות Mac ו- linux.

<table><tbody>תוכנת<tr><td></td><td></td> Mapster <td></td><td></td> https://github.com/emptyewer/MAPster/releases</tr><tr><td>DEEPN</td><td>https://github.com/emptyewer/DEEPN/releases</td>Statmaker https://github.com/emptyewer/DEEPN/releases מערכת מחשב מינימלית Apple Mac Intel Core i5 ומעלה - 4 Gb RAM או <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> טוב יותר</td></tr> <tr><td></td><td>-</td><td></td> <td>500 ג'יגה-בייט דיסק spce או טוב יותר</td></tr> <tr><td></td><td>-</td><td></td> <td>מערכת הפעלה 10.10 ומעלה</td></tr><tr><td></td><td>Intel i5-7400 ומעלה</td><td></td> של Dell <td></td></tr><tr><td>-</td><td></td> <td>4 ג'יגה-בייט RAM או טוב יותר</td> - 500 ג'יגה-בייט דיסק spce ומעלה - Windows 7 ואילך<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

informatic ניתוח של נתוני רצף אצווה שמרים 2-היברידית המסכים

Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

אנחנו הסתגלו שמרים 2-היברידית וזמינותו לחשוף בו זמנית עשרות אינטראקציות חלבון ארעי וסטטיים בתוך מסך אחד ניצול רצפי DNA קצר-קריאה תפוקה גבוהה. Datasets רצף וכתוצאה מכך יכול לא רק לעקוב אחרי איזה גנים באוכלוסיה כי הם מועשרים במהלך הבחירה עבור אינטראקציות חיוביות שמרים 2-היברידית, אלא גם לתת מידע מפורט אודות תחומי משנה רלוונטיים של חלבונים מספיק עבור אינטראקציה. כאן, אנו מתארים חבילה מלאה של תוכניות עצמאיות המאפשרות שאינם מומחים לביצוע כל ביואינפורמטיקה, צעדים סטטיסטיים כדי לעבד ולנתח DNA רצף fastq קבצים אצווה שמרים 2-היברידית וזמינותו. השלבים בעיבוד מכוסה על ידי תוכנות אלה כוללים: קריאות רצף 1) מיפוי והספירה המתאים לכל חלבון המועמד מקודד בתוך ספרייה 2-היברידית טרף שמרים; 2) תוכנית ניתוח סטטיסטי המעריכה את הפרופילים העשרה; ו 3) כלים לבחון את המסגרת translational והמיקום בתוך אזור קידוד של כל מועשר פלסמיד מקודד חלבונים שמעצבת את עניין.

מיפוי נתונים fastq: הצעד הראשון למעשה כל הגדרות היישומים כולל DEEPN הפלט הראשוני הוא קובץ של רצף קצר קורא את למפותם על ידי יישור כדי גנומית, transcriptomic, או אחר מפנה דנ א8. לאחרונה, התוכנית יישור HISAT2 פותחה המשתמשת באלגוריתמים אינדקס המדינה-of-the-art כדי להגדיל באופן משמעותי את מהירות7,של מיפוי9. HISAT2 רץ ביעילות במחשב שולחני, יכול מפה בגודל בדרך כלל לקרוא קובץ בתוך דקות. זה אפשר ...

רצף עמוק של אוכלוסיות השמרים שנבחר עבור אינטראקציות חיוביות שמרים 2-היברידית פוטנציאל התשואות שפע של מידע אודות אינטראקציה שותף חלבונים. כאן, אנו מתארים את הפעולה של ביואינפורמטיקה ספציפי כלים ותוכנות מעודכן המותאם אישית כדי לנתח נתונים רצף כזה המסכים.

Informatic ניתוח של נתוני רצף אצווה שמרים 2-היברידית המסכים

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי אופי האינטראקטומות של חלבונים. היתרון העיקרי בטכניקה זו הוא שכל העיבוד הביואינפורמטי מופעל על ידי ממשק קל לשימוש. תוכנה זו משתמשת בממשק משתמש גרפי ידידותי למשתמש שביולוגים מולקולריים, ביולוגים של התאים וביוכימאים שאין להם מומחיות רבה בביואינפורמטיקה יכולים להשתמש בו כדי להשלים את הניתוח שלהם בקלות.בדרך כלל, אנשים חדשים בעיבוד נתוני רצף נאבקים מכיוון שתוכנות המחשב מבלבלות ומסורבלות. חשבנו שהפיכת האינפורמטיקה לקלה תהפוך את הטכניקה כולה לנגישה ושימושית הרבה יותר. השלב הראשון בהליך זה הוא הורדה והתקנה של תוכנת MAPster כמתואר בפרוטוקול הטקסט.לאחר מכן, הזן את הקבצים והפרמטרים הנדרשים דרך ראשי לשונית. בחר את כפתור ה-Pairwise המתאים כדי להזין את הקבצים לניתוח DEEPN. סובב את Pairwise אפשרות למצב כבוי כדי לפעול בפורמט קריאה יחידה.טען קבצים ל-MAPster על ידי גרירה ושחרור לחלון המתאים. מהגנומים המאונדקסים המפורטים בתיבת הגנום, בחר מקור גנום DNA התייחסות המתאים למקור של מוסיף ספריית הטרף Y2H. מכיוון ש- HISAT2 תומך בריבוי הליכים, תחת התיבה הליכי משנה, ציין את מספר תהליכי המחשב שיש להקדיש לתוכנית המיפוי.ציין שם קובץ פלט, מומלץ שם קצר אך תיאורי ללא רווח או תווים מיוחדים מכיוון ששם קובץ זה ישמש לאורך כל תהליך DEEPN. באמצעות פתח ספריית פלט לחצן, ציין תיקיה

informatic-analysis-of-sequence-data-from-batch-yeast-2-hybrid-screens

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

בפרוטוקול זה, הגן ביטוי שמרים...

Microarray ניתוח עבור Saccharomyces cerevisiae</em

פיתחנו מקיף, משוחדת הגנום כולו מסכי להבין גנים סמים גנים הסביבה אינטראקציות. שיטות סינון אלה אוספים מוטציה מוצגים.

מסכי הגנום תחרותי של ספריות שמרים המבורקדים

מאמר זה מתמקד בזיהוי של מערכי נתונים אינטראקציה גבוה בין המארח בטוח וחלבוני הפתוגן באמצעות שילוב של שתי שיטות מאונך: שמרים שני היברידיים ואחרי assay אינטראקציה תפוקה גבוהה בתאי יונקים הנקרא HT-GPCA.

גישה השוואתית כדי לאפיין את הנוף של אינטראקציות בין חלבונים מאכסן לפתוגן

פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה תפוקה גבוהה על המסך באופן פונקציונלי עבור חלבון מבוססת ירושה cerevisiae ס.

הקרנה תפוקה גבוהה של חלבון מבוססת ירושה cerevisiae ס

כאן, אנו מציגים פרוטוקול בעזרת RNA-seq לנטר את רמות ה-mRNA לאורך זמן במהלך התגובה שתקבעו של cerevisiae ס תאים. בשיטה זו ניתן להתאים לנתח ביטוי גנים במהלך כל תגובה תאית.

מדידת רמות ה-mRNA לאורך זמן במהלך שמרים ס' cerevisiae ובשפתיים התגובה

אנו מתארים שיטה לשילוב cytometry זרימה ורצף תפוקה גבוהה כדי לזהות אזורים שכפול מאוחר של הגנום.

G2-seq: תפוקה גבוהה המבוססת על רצף טכניקה לזיהוי מאוחר לבצע שיכפול אזורים בגנום

עיבוד אצווה של שמרים 2-היברידית מסכים מאפשר השוואה ישירה של הפרופילים האינטראקציה של מספר חלבונים הפיתיון עם סט מורכב של חלבונים פיוז'ן טרף. כאן, אנו מתארים שיטות מעודן, ריאגנטים החדש וכיצד ליישם ושימושם עבור מסכי כזה.

מסך 2-היברידית שמרים אצווה כדי להשוות בין אינטראקציות חלבון

אנו מציגים את פרוטוקול מסך משתיק קול פשוט בהתכה שמרים. שיטה זו היא יעילה ללא מוטגן, סלקטיבי מוטציות מתרחשות לעיתים קרובות באתר גנומית יחיד.  הפרוטוקול מתאים לבידוד מדכאי על פגמים צמיחה בתרבות נוזלי שנגרמות על ידי מוטציה או תרופה.

מסך משתיק קול עמוק רצף-בסיוע, ספונטני ב ביקוע שמרים שמר הביקוע

צוואר בקבוק במחזור ' עיצוב-לבנות בדיקה ' של הנדסת חיידקים היא המהירות שבה אנחנו יכולים לבצע מסכי פונקציונלי של זנים. אנו מתארים שיטת תפוקה גבוהה לסינון המתח המוחל על מאות אלפי תאים שמרים לכל ניסוי העושה שיטה ברצף RNA מבוסס droplet.

תפוקה גבוהה שמרים להתאמץ פנוטיפים עם רצפי רנ א מבוססי Droplet

העשרה וריצוף של DNA מתהום המקושר לחלבון (eSPAN) פותחה כדי לזהות את השפע היחסי של חלבון הקשור לכרומטין על שני גדילי DNA משכפלים, ובכך לחשוף תובנות מולקולריות לגבי שכפול הכרומטין ותהליכיו המקושרים. פרוטוקול זה מתאר פרוצדורות eSPAN בתאי גזע עובריים (ES) של שמרים ועכברים.

ניתוח ייחודי לגדיל של חלבונים בשכפול גדילי DNA באמצעות העשרה וריצוף של שיטת DNA מתהווים הקשור לחלבונים

חקור ניתוח אינטראקטומים חלבוניים באמצעות ריצוף עמוק של אוכלוסיות שמרים. תוכנת MAPster מספקת ממשק ידידותי שמאפשר לחוקרים לעבד נתונים ביואינפורמטיים בקלות וביעילות.

Informatic ניתוח של נתוני רצף אצווה שמרים 2-היברידית המסכים

גלה סרטונים נוספים