Decellularization ומתודולוגיה Recellularization עבור האדם הורידים saphenous גדולות

שיטה זו מסבירה הליך מפורט להנדסת רקמות ורידים ספנוסים. אנו גם מדגימים הכנה של מערכי דה-סלולריזציה וביוריאקטור לרה-סלולריזציה באמצעות מכשירים פשוטים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שנדרשת דגימת דם פשוטה לצורך תאית מחדש, ובכך מבטלת איסוף מח עצם כואב והליכי תרבית תאים גוזלי זמן.

עבור זלוף וכביסה של Triton-X 100, הכן את הגדרת הדסלולריזציה אחת. לתא של שני ליטר, הדביקו את כל שלושת חלקי הצינור A.הדביקו צינור אחד לקיר שבו הקצה נוגע בתחתית התא לכניסת חומר הניקוי. הדביקו את שני הצינורות האחרים לקיר הנגדי במרחק של חמישה עד 10 סנטימטרים ביניהם, תלוי באורך הווריד.

יש להדביק לפחות חמישה סנטימטרים מהצינורות הללו לרצפת החדר. חבר את צינור הכניסה של חומר הניקוי לצינור B באמצעות מחברי הפיתוי הזכר והנקבה. לאחר מכן חבר את צינור B לצינור F, ואת צינור F לצינור C. חבר את צינור C לכניסת הווריד.

כעת, הנח את השפופרת F לתוך הקסטה של המשאבה הפריסטלטית. קח צינור C נוסף וחבר קצה אחד לשקע הווריד. הנח את הקצה השני בצנצנת זכוכית המצוידת בשקע צינור תחתון וממוקמת 45 סנטימטרים מעל החדר, והדבק אותו כדי לאבטח.

זה משמש כשקע חומר הניקוי. לאחר מכן, דחף קצה אחד של צינור G לתוך יציאת הצינור של צנצנת הזכוכית, והנח את הקצה השני לתוך תא הוורידים. לאחר מכן, הכן את הגדרת הדה-סלולריזציה השנייה עבור זלוף TnBP כמפורט בפרוטוקול הטקסט.

הכינו גם את מערך הדה-סלולריזציה השלישי לזלוף ה-DNA כמפורט בטקסט, ומקמו אותו ב-37 מעלות צלזיוס. כדי להכין את הביו-ריאקטור של הרסלולריזציה, הכנס את צינור H ליציאה אחת של מכסה ארבע יציאות כדי לשמש כמוצא הווריד. לתוך היציאה השנייה, הכנס את צינור I שישמש ככניסת המדיה.

ולתוך היציאה השלישית, הכנס את צינור J לכניסת הווריד. לאחר מכן, הכנס את הקצה השני של צינור H ליציאה הרביעית כדי לשמש כשקע המדיה. חבר את מחברי ההפחתה לקצוות הפנימיים של הצינורות H ו-J.כופף את הקצה השני של הצינור J לצורת U וקשר אותו בתפר.

כעת, הנח צינור של 60 מיליליטר עם בסיס שטוח לכוס של 250 מיליליטר. לאחר מכן, חבר קצה אחד של צינור K לכניסת הווריד וחבר את הקצה השני לצינור E.חבר את צינור E לצינור שני K, ולאחר מכן לכניסת המדיה. לאחר מכן הנח את מערך המכסה המוכן לתוך הצינור הקיים בבקבוק.

לבסוף, עקר את הביוריאקטור על ידי חיטוי. בצע שני מחזורי הקפאה-הפשרה על וריד ספנוס אנושי כמפורט בפרוטוקול הטקסט לפני חיתוך ביופסיה באורך שני מילימטרים במספריים. תקן את הביופסיה בפורמלדהיד למשך 24 עד 48 שעות בטמפרטורת החדר.

קושרים כל קצה של הווריד לדוקרנים של מחבר פיתוי זכר ונקבה בעזרת תפר. חבר את הווריד למערך דה-סלולריזציה אחד ומלא את החדר בליטר אחד של תמיסה שתיים. כעת, העבר למשך 15 דקות במהירות של 35 מיליליטר לדקה ורוקן את תכולת ההתקנה.

לאחר מכן, הוסיפו ליטר אחד של תמיסה ארבע והזדגו למשך ארבע שעות ב-35 מיליליטר לדקה. רוקנו את התכולה, הוסיפו 500 מיליליטר תמיסה שתיים, החליפו למשך חמש דקות, ושוב רוקנו את התוכן. נתק את הווריד ממערך הזלוף הראשון, וחבר אותו למערך הזלוף השני.

לאחר מכן, הוסיפו ליטר אחד של תמיסה חמש, הפעילו את המערבל וחלחלו במשך ארבע שעות במהירות של 35 מיליליטר לדקה. נתק את הווריד ממערך הזלוף השני, ושטוף את החלק החיצוני של הווריד פעמיים עם 20 מיליליטר מים טהורים במיוחד. לאחר מכן השתמש במזרק כדי לשטוף את פנים הווריד פעמיים עם 20 מיליליטר מים טהורים במיוחד למשך חמש עד 10 דקות.

לאחר החדרה עם הגדרת זלוף שלוש כמתואר בפרוטוקול הטקסט, חבר את הווריד למערך הזלוף הראשון. מלאו ליטר אחד של תמיסה שתיים וחלחלו למשך הלילה ב -35 מיליליטר לדקה. חזור על תהליך הזלוף ארבע פעמים להסרה מוחלטת של חומר גרעיני.

לאחר הזילוף, רוקנו את ההתקנה, מלאו ליטר אחד של תמיסה שתיים, והחליפו למשך 24 שעות ב-35 מיליליטר לדקה. לאחר 24 שעות, רוקנו שוב את ההתקנה ומלאו בליטר אחד של מים טהורים במיוחד. לחלחל למשך 24 שעות נוספות ב -35 מיליליטר לדקה.

לבסוף, חזור על הזלוף באותם תנאים אך עם פתרון שבע. לאחר אימות של דה-סלולריזציה כמתואר בפרוטוקול הטקסט, יש לעקר את הווריד על ידי הנחתו בצינור של 50 מיליליטר המכיל 50 מיליליטר של תמיסה שמונה. מערבבים ב-80 סיבובים לדקה בשייקר למשך שעה ב-37 מעלות צלזיוס.

עבדו בארון זרימה למינרי כדי לשמור על סטריליות, השתמשו כעת במלקחיים סטריליים כדי להעביר את הווריד הסטרילי לצינור חדש של 50 מיליליטר המכיל 50 מיליליטר של תמיסה סטרילית שבע, המכילה 500 מיקרוליטר אנטי אנטי. מערבבים את הווריד כמו קודם למשך 12 שעות, ומחליפים את התמיסה שבע לפחות פעמיים בין לבין. בעזרת מלקחיים סטריליים מעבירים את הווריד לצינור חדש של 50 מיליליטר, מוסיפים 50 מיליליטר של מדיה אנדותל ומערבבים במשך 11 שעות.

כעת, חבר את הווריד על ידי קשירתו לכניסת ויציאת הווריד של הביוריאקטור עם תפר סטרילי ומלקחיים, והדק את מערך המכסה לבקבוק ה-250 מיליליטר. מלאו את הביוריאקטור באותו מדיום אנדותל. הוסף הפרין ב -50 יחידות למיליליטר והחדיר למשך שעה בשני מיליליטר לדקה בחממה.

אסוף 15 עד 25 מיליליטר של דם טרי מהתורם בצינורות ואקוטטיינר מצופים הפרין ודלל אותו אחד לאחד עם תמיסת סטין. מאוחר יותר, הוסף גורם גדילה אנדותל כלי דם שמקורו בבלוטה אנדוקרינית, גורם גדילה בסיסי של פיברובלסט וחומצה סליצילית עדינה. לאחר ריקון המדיום האנדותל מהביו-ריאקטור, הוסיפו לתוכו את הדם וחלחלו למשך 48 שעות בשני מיליליטר לדקה באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם חמישה אחוז פחמן דו חמצני.

כ-12 שעות לאחר מכן, עבדו בארון הזרימה הלמינרי כדי להוציא טיפת דם מהביו-ריאקטור ולמדוד את רמת הסוכר באמצעות מכשיר לניטור רמת הסוכר בדם. אם הרמה נמוכה משלושה מילימול לליטר, הוסף גלוקוז כדי להביא אותו לטווח של שבעה עד תשעה מילימול לליטר. לאחר 48 שעות בחזרה באינקובטור, רוקנו את הדם מהביו-ריאקטור בארון הזרימה הלמינרית.

הוסף 30 מיליליטר תמיסה סטרילית שבעה, חלחל למשך חמש דקות ונקז את התמיסה. חזור על תהליך זה עד שהצבע האדום של הדם יאבד. לבסוף, הוסיפו 30 עד 45 מיליליטר של מדיום אנדותל וחלחלו למשך 96 שעות בחממה בשני מיליליטר לדקה.

נתק את הווריד המחודש מהביו-ריאקטור בארון הזרימה הלמינרית, חתוך קצוות של חמישה מילימטר של הווריד בעזרת מספריים והשליך. קח ביופסיה כמו קודם, הניח בפורמלדהיד ובצע אימות של התאיות כמתואר בפרוטוקול הטקסט. המורפולוגיה הגסה של וריד רגיל נראית בצבע אדום בוהק.

הצבע האדום הולך לאיבוד במחזורי דה-סלולריזציה מתקדמים, ולאחר חמישה מחזורי טיפול, נראה חיוור ולבן. הווריד שחזר על ידי זלוף של דם היקפי ומדיום אנדותל נראה שוב בצבע אדום בוהק. מוצגת כאן תמונה מייצגת של צביעת המוטוקסילין ואאוזין של וריד נורמלי המראה נוכחות של גרעינים כחולים רבים.

עם זאת, גרעינים כחולים לא נראו בצביעת המוטוקסילין ואאוזין של הווריד הנטול תאים. בווריד הסלולרי המוזרם בדם ובמדיום אנדותל, צביעת המוטוקסילין ואאוזין הראתה נוכחות של התקשרות תאים בלומן. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד לבצע דה-סלולריזציה של וריד ספנוס על ידי חומרי ניקוי ורסלולריזציה עם דם היקפי ומדיום אנדותל.

טכניקה זו של דה-סלולריזציה באמצעות זלוף של Triton-X 100, TnBP ו-DNA בלחץ הייתה מוצלחת וניתנת לשחזור בהסרת גרעינים מוורידים ספניים אנושיים. למרות שטכניקה זו אורכת 20 יום, אחסון הווריד הנטול תאים כמוצר לאחר המדף יקצר את זמן ההליך לשמונה ימים. רסלולריזציה של ורידים באמצעות הדם ההיקפי של המקבל עשויה להיחשב רלוונטית מבחינה קלינית.

ה-Recellularized של Vein's עם פרוטוקול דומה הראה הבטחה בהשתלה קלינית על ידי מתן אספקת דם פונקציונלית לאחר הניתוח. עם שינויים קלים, ניתן להשתמש בפרוטוקול זה לכל סוג וריד, וכשתל מותאם אישית במרפאות לכל ניתוחי כלי הדם.