בידוד, הרחבה, אינדוקציה Adipogenic CD34 + CD31 + תאי אנדותל של אדם עם פגיעה ו התת-עורית שומן

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום ההשמנה, כגון זיהוי הגורמים והמנגנונים העיקריים המונעים תגובה אדיפוגנית חזקה במהלך שיפוץ רקמת השומן. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת בידוד של תאי CD34+CD31+אנדותל מרקמת שומן אנושית החל מכמויות קטנות של רקמה. הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כשרצינו לזהות תאים בכלי דם של שומן אנושי המגיבים לגירוי אדיפוגני.

הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, מכיוון שקשה לתרגל את שלבי בידוד התאים בשל הגישה המוגבלת לעתים קרובות לרקמת שומן אנושית טרייה. לאסוף רקמת שומן אנושית ותת עורית מנבדקים אנושיים העוברים ניתוח בריאטרי. מיד לאחר מיצוי הרקמה, שמור את רקמת השומן האנושית והתת עורית בבקבוקונים נפרדים המכילים את תמיסת המלח המבודדת של האנק עם 50 מיקרוגרם למיליליטר של סטרפטומיצין פניצילין בטמפרטורת החדר.

לאחר שהדגימה מגיעה למעבדה לאחר מיצוי הרקמה, יש לנקות בזהירות ולהסיר חלקים פיברוטיים וצרובים של הרקמה באמצעות מספריים ופינצטה עם 70% אתנול. שקלו את רקמת השומן וחלקו אותה לחמישה גרם לעיכול הקולגנאז. השתמש בשני זוגות מספריים כדי לטחון דק חמישה גרם מרקמת השומן בחמישה מיליליטר של תמיסת קולגנאז בבקבוקון נצנוץ בטמפרטורת החדר.

הוסף עוד 10 מיליליטר תמיסת קולגנאז לרקמה הטחונה למשך 15 מיליליטר בסך הכל. עכל את הדגימות במשך שעה בחום של 37 מעלות צלזיוס באמבט מים עם ניעור מתמשך. לאחר העיכול, שפכו את הדגימות למזרק הקצה הקהה של 20 מיליליטר.

סנן את הדגימה דרך רשת ניילון של 250 מיקרון לתוך הצינור החרוטי של 50 מיליליטר כדי להפריד אדיפוציטים ותאי כלי דם סטרומליים מרקמה לא מעוכלת. שטפו את בקבוקון הנצנוץ עם 10 מיליליטר KRBBS, ושפכו את הכביסה דרך המסנן כדי לאסוף תאים שיוריים לפני הדגירה של הדגימות המסוננות למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, השתמש במזרק של 20 מיליליטר ובמחט פיפטינג בגודל 20 על שישה אינץ' כדי להסיר שכבת שבר כלי דם סטרומלית ולהעביר אותה לצינור חרוטי נקי של 50 מיליליטר.

הוסף 10 מיליליטר KRBBS ואפשר לדגימות לשבת על הספסל במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. שמור את שברי כלי הדם משני המחסנים על קרח להמשך עיבוד. סובב את שברי כלי הדם הסטרומליים ב -500 פעמים G למשך חמש דקות ב -4 מעלות צלזיוס.

הסר את הדגימות מהצנטריפוגה ושפך בזהירות את הסופרנטנט, תוך שמירה על הגלולה המכילה את תאי שבר כלי הדם הסטרומליים. השעו מחדש בעדינות את כדורי התא בחמישה מיליליטר PBS. לאחר סיבוב הדגימות שוב, הסירו את הסופרנטנט, השעו מחדש את התאים במיליליטר אחד של PBS וספרו את התאים.

גלולה את הדגימות בפעם השלישית, ותלה מחדש את הגלולה ב-100 מיקרוליטר של מאגר בידוד CD34. מוסיפים 10 מיקרוליטר קוקטייל CD34 ומדגרים את הדגימה למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן הוסיפו חמישה מיקרוליטר של חרוזים מגנטיים ודגרו את הדגימה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, הוסף 2.5 מיליליטר של מאגר בידוד CD34 לכל דגימה, והנח את הדגימות למגנט למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. הפוך את המגנט למשך חמש שניות כדי לשפוך את מאגר הבידוד. לאחר חזרה על תהליך זה ארבע פעמים, הסר את הצינור מהמגנט והוסף שני מיליליטר של מאגר בידוד CD34.

לאחר צנטריפוגה נוספת, השעו מחדש את כדורי התא CD34+ במיליליטר אחד של מאגר בידוד CD34 וספרו את התאים. גלול שוב את התאים, והשהה מחדש את הגלולה ב-250 מיקרוליטר של מאגר B ו-250 מיקרוליטר של מאגר כביסה. לאחר מכן, השעו מחדש ביסודיות את חרוזי CD31 על ידי מערבולת הצינור, ולאחר מכן הוסיפו 20 מיקרוליטר של חרוזי CD31 לגלולת התא המושעה מחדש ודגרו את הדגימה עם נדנוד למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.

לפני הפרדת התאים, הוסף מיליליטר אחד של מאגר כביסה כדי לאזן את המסננת. לאחר מכן, מרחו את התערובת המוכנה של תאים תלויים מחדש בחרוזי CD31 על המסננת. שוטפים את המסננת עם חמישה מיליליטר מאגר כביסה בתנועה סיבובית לנפח כולל של 20 מיליליטר.

חבר את המחבר לצינור חרוטי סטרילי של 50 מיליליטר וסגור את מנעול הלור. לאחר חיבור המסננת למחבר, הוסף מיליליטר אחד של מאגר כביסה לאורך דופן המסננת, ולאחר מכן הוסף מיליליטר אחד של מאגר D מופעל לאורך דופן המסננת. סובבו את הדגימה בעדינות, ודגרו אותה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של מאגר כביסה והפרד את התאים מהחרוזים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה 10 פעמים. פתח את מנעול הלור ואפשר לתאים המנותקים לזרום לתוך הצינור החרוטי של 50 מיליליטר. שוטפים את המסננת 10 פעמים עם מיליליטר אחד של מאגר כביסה בכל פעם.

השליכו את המחבר והמסננת, וצנטריפוגה את הדגימות ב-300 פעמים G למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. לבסוף, השעו מחדש את גלולת התא בשני מיליליטר של מדיה EGM2 שלמה לתרבית. גדל את התאים בצלחות שטופלו בתרביות רקמה עם שש בארות עם מדיה מלאה של EGM2 בחממת פחמן דו חמצני של 37 מעלות צלזיוס, 5%.

החלף את המדיה כל שלושה עד ארבעה ימים עד שהתאים מגיעים למפגש של 80 עד 90%. לאחר מכן, זרעו כ-100 עד 200 אלף תאים לתוך צלחות של שש בארות, הבטיחו בארות כפולות לכל מחסן, ותרבו אותם במצע EGM2 שלם למשך יומיים. לאחר יומיים, שאפו מכל אמצעי גדילה.

החלף את המדיה בשני מיליליטר של מדיה DMEM/F-12 עם 5% FBS ו-50 מיקרוגרם למיליליטר של סטרפטומיצין פניצילין עבור תאי הבקרה. עבור תאי הטיפול, החלף את המדיה בשני מיליליטר של מדיה אדיפוגנזה. דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור פחמן דו חמצני לח של 5% למשך 13 יום, והחליפו את המדיה המתאימה כל שלושה עד ארבעה ימים.

מוצגות תוצאות מייצגות המציגות את המורפולוגיה האופיינית דמוית אבן האנדותל של תאי CD34+CD31+לאחר שני מעברים בתרבית. כמו כן הוכחה יכולתם של תאים ליצור צינוריות כאשר הם מתורבתים במטריג'ל כצפוי. ספיגה אחידה של LDL אצטיל המסומן באופן פלואורסצנטי מראה נוכחות של אוכלוסיית תאים הומוגנית עם זהות אנדותל.

מוצג כאן צביעת שמן אדום O של טיפות שומן ניטרליות בתאי CD34+CD31+לאחר 13 ימים של אינדוקציה אדיפוגנית. תגובות מייצגות של תאים ממאגרים אומנטליים ותת-עוריים של שלושה נבדקים אנושיים שונים הוכחו כממחישות את השונות הגדולה בתגובה לאינדוקציה אדיפוגנית בין מחסני שומן של אותו תורם ובין תורמים. תמונה זו מציגה צביעת שומנים תוך-תאיים פלואורסצנטיים בתאי CD34+C31+לאחר אינדוקציה אדיפוגנית למשך 13 יום.

התמונה מציגה תאים עם ליפידים חד-לוקולריים, ליפידים רב-לוקולריים וללא הצטברות שומנים. PCR בזמן אמת מראה את הביטוי של סמן הפאן אדיפוציט אדיפונקטין וסמני הבז' החומים CIDEA ו-UCP-1. תוצאות אלו מאשרות כי תאים לאחר אינדוקציה אדיפוגנית מבטאים סמנים מולקולריים התואמים לפנוטיפ אדיפוציט בז' לבן מעורב.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך חמש שעות אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להשתמש ברקמת שומן אנושית טרייה שנאספה ולא אוחסנה יותר משעתיים. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו ציטומטריית זרימה, אימונוהיסטוכימיה ו-RT-PCR כדי לזהות תת-קבוצות ספציפיות של תאים מגיבים, וביטוי של סמני אדיפוציטים בוגרים שניתן להשתמש בהם כדי לזהות פנוטיפ אדיפוציט חום בז'.

לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום ההשמנה לחקור את התפקידים של רקמת השומן, תאי כלי הדם ואדיפוגנזה בבני אדם. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד, לתרבית ולהרחיב תאי CD34+31+. אל תשכח שעבודה עם רקמות אנושיות עלולה להיות מסוכנת ביותר, ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות, כגון תקנות בטיחות ביולוגית, בעת ביצוע הליך זה.

ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול במחלות נלוות הקשורות להשמנה, כגון עמידות לאינסולין, מכיוון שהיא מזהה תגובה אדיפוגנית של תאים להתערבות טיפולית פוטנציאלית.