Name: ערכי צבע מוחלטים מבחני של תאיים לקטט בקנה מידה קטן ו פירובט ב נמטודות Caenorhabditis elegans (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: למדו שיטה לכימות לקטט ופירובט ב-Caenorhabditis elegans באמצעות ערכי צבע מוחלטים. שיטת השקעת חלבונים מבטיחה דיוק גבוה במדידות מטבוליטים בתאי הנמטודה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מבחינה כלכלית נתמך על ידי מענק מחקר מיוחד מאוניברסיטת Bunka Daito אל Sumino Yanase.

1. מסונכרנים תרבות של C. elegans
<ol><li>לפני זריעה, תרבות Escherichia coli (e. coli) זן OP50 בין לילה ב- 37 מעלות צלזיוס ב 300 מ ל מרק לוריא-Bertani (LB) בינוני נוזלי. לאחסן את OP50 בתרבית ב-4 ° c<ol>
<li>כדי להפוך את LB מרק נוזלי בינוני, השתמש 10 גר' טריפטון, 5 גר' תמצית שמרים, 10 גרם של NaCl ו 1.5 מ ל 1 N NaOH ולאחר להוסיף 1 ליטר מים יונים. אוטוקלב. הערה: OP50 ו- C. elegans זנים זמינים מן המרכז גנטיקה Caenorhabditis (אוניברסיטת מינסוטה, סנט פול, MN, ארה ב).</li>
	</ol>
</li>
	<li>כדי להפוך את הצמיחה נמטודות בינוני (NGM) אגר, השתמש דור 3 של NaCl, 2.5 גר' peptone, 17 גרם אגר, 975 מ ל מים יונים. אוטוקלב. מגניב עד 55 ° C, אז sterilely להוסיף, סדר, 1 מ"ל של 1 מ' MgSO4, 1 מ"ל של 1 מ' CaCl2, 1 מ"ל של 5 מ"ג/מ"ל כולסטרול EtOH ב, 25 מ של 1 מ' אשלגן פוספט pH 6.0 ב 90-מ מ פטרי....<ol>
<li>עבור 1 מ' אשלגן פוספט pH 6.0, להשתמש 108.3 גר'2פו ח'4 ו- g 46.6 של K-2-HPO-4, ולהוסיף מים יונים אוטוקלב ל' 16.</li>
	</ol>
</li>
	<li>מורחים 1-2 מ ל OP50 בתרבית על לוחות אגר NGM. כדי להפוך את שכבה דקה של OP50, דגירה הלוחות ללילה בטמפרטורת החדר לפני הוספת כל נמטודות. הערה: NGM אגר הלוחות ש-op50 חוסנו ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר במשך 2-3 שבועות.</li>
	<li>להוסיף לפחות 100 תולעים על גבי צלחת אגר NGM עם OP50 והתרבות 20 ° C עד השלב למבוגרים. לפחות שלושה לוחות דרושים.</li>
	<li>לאסוף ביצים בתוך הרחם, להעביר אנדרוגינוסים gravid של שלושה NGM אגר צלחות כל עם 5 מ של מאגר S בצינור חרוטי 15-mL ולאחר לשטוף את התולעים 3 פעמים עם 15 מ"ל S המאגר באמצעות צנטריפוגה ב x 300 גרם ל 30 s בטמפרטורת החדר.<ol>
<li>כדי להפוך את מאגר S, 5.9 גרם של NaCl ולהשתמש 50 מ של 1 מ' אשלגן פוספט pH 6.0, להוסיף 1 ליטר מים יונים. אוטוקלב6.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להמיס תולעים פתרון תת-כלורי אלקליין axenization, לרשימת תפוצה ביצה בידוד (0.5 מ של אקונומיקה טריים או שווה ערך: 5-6% נתרן תת-כלורי, 0.1 מ"ל של NaOH 10 מ', כ- 4.5 מ ל S מאגר)6, ולעמוד הפתרון למשך 10-15 דקות- בטמפרטורת החדר עם ערבוב על-ידי היפוך. הערה: בתוך 15 דקות, תולעים בוגרות, צריך לפזר, עוזב פתרון מעורפל של ביצים שחרור מכל פגרי שלהם (הביצים המשוחררת יש לאשר באמצעות מיקרוסקופ סטריאוסקופי). במקום 0.1 מל ' של 10 N NaOH, 0.2 מ ל 5 N NaOH יכול גם לשמש.</li>
	<li>לאחר טיפול תת-כלורי, לשטוף בגדר ביצה 3 פעמים עם 15 מ"ל S המאגר, resuspend ב 5-6 מ"ל S המאגר. בוקעות הביצים שפורסמו במהלך הדגירה לילה ב- 20 ° C במאגר S ללא e. coli לתרבות גיל-סינכרונית של הזחלים הבמה L1.</li>
	<li>כדי לקבוע את המספר המשוער של הזחלים הבמה L1, לספור את התולעים באמצעות מיקרוסקופ סטריאוסקופי ב- µL 10 S מאגר לאחר resuspending את הזחלים לפחות 3 פעמים, לחשב את הממוצע. לאחר מכן, להעביר את הזחלים הבמה L1 חמש פלטות אגר NGM עם OP50 (1500-3000 תולעים לכל לוח באמצעות צלחת פטרי 90-מ מ), תרבות ב- 20 ° C עד שהם גדלו לבמה למבוגרים צעירים, כאשר להפריה מתחילה, מספר הביצים מוטלות (בדרך כלל לאחר בתלת-ממד ays).</li>
</ol>2. מיצוי של שבר הסלולר של C. elegans
<ol><li>לאסוף את הצעירים למבוגרים הבמה (בעלי חיים בן יום-5) תולעים של צלחות אגר NGM חמש עם מאגר S (איור 1 א').<ol>
<li>כדי לבחור רק תולעים חיים באמצעות שיטת סוכרוז6 לציפה על 30% (w/v) סוכרוז, מערבבים את התולעים הושעו ב 3-4 מ ל S מאגר עם אמצעי אחסון שווה של סוכרוז קרח 60% (w/v) צינור חרוטי 15-mL. לסובב את הצינור ב x 1,500 גרם 15 s ב 4 ° C ולהסיר הצפים תולעים לתוך צינור טריים על-ידי הזזתם מהקיר של הצינור עם פיפטה פסטר.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לשטוף את התולעים 3 פעמים עם מאגר S על ידי צנטריפוגה ב x 1,500 גרם ל 30 s-4 מעלות צלזיוס. בדוק את עוצמת הקול הרטוב של תולעים שטף לאחר צנטריפוגה באמצעות טיפ micropipette 1,000 µL (איור 1B).</li>
	<li>להוסיף את התולעים שטף אמצעי שווה של חומצת חומץ טריכלור 10% (w/v) קרה כקרח (TCA; הריכוז הסופי של 5%) עבור חלבון משקעים (איור 1C). במקום TCA, חומצה על-כלורית (PCA) או חומצה metaphosphoric יכול לשמש.</li>
	<li>Homogenize התולעים עם precipitant באמצעות קווים 40 של כבעלי מהמגן טפלון (פוטר-Elvehjem רקמות grinder) עם סיבוב בבית עד 1,300 סל"ד על קרח.</li>
	<li>להעביר את homogenate microtube 1.5-mL טריים עם פיפטה פסטר, sonicate באמצעות מהמגן אולטראסוניות במשך 3 דקות (3 פעמים של 1 דקות) עם מחזור 20% על קרח.</li>
	<li>להבהיר את homogenate על ידי צנטריפוגה ב x 8000 g 10 דקות ב 4 º C. לנטרל את supernatants עם 4 מ KOH (נפח 0.25 ל-10% TCA) במשך 20 דקות על קרח, צנטריפוגה ב x 8000 g 10 דקות ב 4 º C. ניתן לאחסן את תגובת שיקוע (כמדגם מבחן) ב- 80 ° C עד מבחני הבאים.</li>
</ol>3. לקטט Assay באמצעות ערכת Assay ערכי צבע מוחלטים
<ol><li>מודדים את ריכוז חומצת החלב הדגימות הבדיקה באמצעות ערכת assay ערכי צבע מוחלטים (טבלה של חומרים). לבצע בדיקות דופלקס על הדגימות הבדיקה. להוסיף 5 או 10 µL של הדגימות מבחן צלחת 96-ובכן, לכוונן את עוצמת הקול כדי µL 50 לכל טוב עם המאגר Assay לקטט מסופק עם הקיט.</li>
	<li>על עקומת סטנדרטי לקטט, לדלל 100 מ מ L (+)-לקטט רגיל עד 1 מ"מ עם מאגר Assay לקטט. להוסיף 0, 2, 4, 6, 8 ו 10 µL של 1 מ מ L (+)-לקטט סטנדרטי, אשר מסופק עם הקיט, לתוך סדרה של וולס.</li>
	<li>להוסיף 50 µL של תערובת התגובה (מכיל 46:2:2 של לקטט מאגר Assay, מיקס האנזים לקטט לקטט בדיקה ב דימתיל סולפוקסיד, נטול מים; ריאגנטים כל מסופק עם הקיט) או ערבוב שליטה רקע (מכיל 48:2 של לקטט מאגר Assay ו לקטט בדיקה) כל טוב דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30-60 דקות, בעוד הדגימות מוגנים מפני אור.</li>
	<li>למדוד את ספיגת כל הבאר-570 nm שימוש בקורא microplate להפחית את ספיגת של המיקס שליטה רקע מ ספיגת של המיקס התגובה.</li>
	<li>מגרש העקומה סטנדרטי לקטט. לחשב את ריכוזי חומצת החלב הבדיקה דגימות מן העקומה סטנדרטי לקטט.</li>
</ol>4. פירובט Assay באמצעות ערכת Assay ערכי צבע מוחלטים
<ol><li>למדוד את הריכוז של פירובט ב- supernatants (הבדיקה דוגמאות) באמצעות ערכת assay ערכי צבע מוחלטים (טבלה של חומרים). לבצע בדיקות דופלקס על הדגימות הבדיקה. להוסיף 10 µL של הדגימות הבדיקה, µL 90 של ריאגנט עובד (מכיל 94:1 של אנזים מיקס, ריאגנט לצבוע, אשר מסופקים עם הקיט) לתוך צלחת 96-ובכן, דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות, בעוד הדגימות מוגנים מפני אור.</li>
	<li>למדוד את ספיגת כל הבאר-570 nm באמצעות קורא microplate.</li>
	<li>התווה את עקומת סטנדרטי של פירובט. לחשב את ריכוזי פירובט הבדיקה דגימות מן העקומה סטנדרטי פירובט.</li>
</ol>5. שיטת עבור הנורמליזציה עם תכולת החלבון
<ol><li>מודדים את ריכוז חלבון supernatants (הבדיקה דוגמאות) באמצעות ערכת assay ערכי צבע מוחלטים (טבלה של חומרים). עם זאת, שלב זה אינו מוגבל ערכת assay, גישות אחרות יכול להיות מנוצל כדי למדוד את ריכוז חלבון.</li>
	<li>לנרמל את הערכים של ריכוזים ו לקטט פירובט בין הדגימות הבדיקה באמצעות ריכוז חלבון הכוללת כל. הערה: ריכוז חלבון הדגימות מבחן מזוהה במידה מספקת גם לאחר חלבון משקעים, הוא מנוצל עבור השלב נורמליזציה בין הדגימות.</li>
</ol>

<ol><li>Warburg, O. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/13298683">On the origin of cancer cells.</a> Science. 123, 309-314 (1956).</li>
<li>Matoba, S., et al. <a target="_blank" href="http://science.sciencemag.org/content/312/5780/1650.full">p53 regulates mitochondrial respiration.</a> Science. 312, 1650-1653 (2006).</li>
<li>Yanase, S., Suda, H., Yasuda, K., Ishii, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+p53%2FCEP-1+is+associated+with+lifespan+extension+through+an+age-related+imbalance+in+the+energy+metabolism+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+to+Cells%22%5BJournal%5D)">Impaired p53/CEP-1 is associated with lifespan extension through an age-related imbalance in the energy metabolism of C. elegans.</a> Genes to Cells. 22 (12), 1004-1010 (2017).</li>
<li>Page, A. P., Johnstone, I. L. The C. elegans. Research Community. The cuticle. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPage%2C+AP+%22WormBook%22">WormBook</a>. , (2007).</li>
<li>Hulme, S. E., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemistry+and+the+worm%3A+Caenorhabditis+elegans+as+a+platform+for+integrating+chemical+and+biological+research%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Chemistry and the worm: Caenorhabditis elegans as a platform for integrating chemical and biological research.</a> Angewandte Chemie International Edition. 50, 4774-4807 (2011).</li>
<li>Lewis, J. A., Fleming, J. T. Basic culture methods. <a target="_blank" href="https://www.elsevier.com/books/caenorhibditus-elegans-modern-biological-analysis-of-an-organism/epstein/978-0-12-564149-4">Methods in Cell Biology, Volume 48, Caenorhabditis elegans: Modern Biological Analysis of an Organism</a>. Epstein, H. F., Shakes, D. C. , Academic Press, Inc. 3-29 (1995).</li>
<li>Senoo-Matsuda, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+defect+in+the+cytochrome+b+large+subunit+in+complex+II+causes+both+superoxide+anion+overproduction+and+abnormal+energy+metabolism+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A defect in the cytochrome b large subunit in complex II causes both superoxide anion overproduction and abnormal energy metabolism in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276 (45), 41553-41558 (2001).</li>
<li>Butler, J. A., Mishur, R. J., Bhaskaran, S., Rea, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+metabolic+signature+for+long+life+in+the+Caenorhabditis+elegans+Mit+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">A metabolic signature for long life in the Caenorhabditis elegans Mit mutants.</a> Aging Cell. 12, 130-138 (2013).</li>
<li>Marbach, E. P., Weil, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+enzymatic+measurement+of+blood+lactate+and+pyruvate%3A+Use+and+significance+of+metaphosphoric+acid+as+a+common+precipitant%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rapid enzymatic measurement of blood lactate and pyruvate: Use and significance of metaphosphoric acid as a common precipitant.</a> Clinical Chemistry. 13 (4), 314-325 (1967).</li>
<li>Mishur, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+metabolites+extend+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial metabolites extend lifespan.</a> Aging Cell. 15, 336-348 (2016).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

כאשר ניצול ערכות אלה assay ערכי צבע מוחלטים, השלב הקריטי ביותר מדגם החילוץ כדי לזהות לקטט הסלולר ו פירובט במדויק ב- C. elegans הוא התהליך של חלבון המדידות המגון (איור 1). . זה לא הכרחי כדי להשתמש מהמגן טפלון, כמו אחרים לטקס (למשל., דאונס, צמצום מטחנות רקמות או חרוז מילס) מתאימים אף הם החילוץ בקנה מידה קטן של תולעים. אנחנו לא זיהה לקטט הסלולר ו פירובט בדגימות מבחן זה חולצו באמצעות מהמגן לפני חלבון משקעים. יתר על כן, רמות ו לקטט פירובט ירד באופן דרסטי בחודש השבר cytosolic מופ...

ריכוז ו לקטט פירובט נחשבים נרחב intermediates של חילוף החומרים האנרגיה, קשורים לארצות הברית גליקוליזה, חומצה tricarboxylic (TCA) מחזור ו תחבורה אלקטרונים בשרשרת בתאים של אורגניזמים אירוביים. סדרה של תגובות בגליקוליזה נישחק גלוקוז כדי פירובט, אשר שוכנת בצומת דרכים מטבולית, ניתן להמיר פחמימות באמצעות גלוקונאוגנזה, חומצות שומן, חילוף החומרים האנרגיה באמצעות אצטיל קואנזים a, את אלנין חומצה אמינית. מחזור TCA מתרחשת תחת הנוכחות של מספיק חמצן מומס, והוא היסוד עבור ההמרה של גלוקוז לאנרגיה. במיוחד, משינוי של חילוף חומרים משני הוא תופעה מעניינת שבה גליקוליזה משמשת בעיקר לייצור אנרגיה והוא אירובי נשימה מיטוכונדריאלי, אשר מערבת את מחזור TCA ושרשרת אלקטרון תחבורה, downregulated סרטן בתרבית של תאי1,2. הראנו לאחרונה את רמת חומצת החלב ואת היחס הסוגר לקטאט/פירובט (L/P) ירד במהלך ההזדקנות באורגניזם מודל Caenorhabditis elegans (C. elegans). כמו כן, מצאנו כי גידול בתרבית של משתיק קול p53 ortholog CEP-1 C . elegans יש תפקיד חשוב בהתיקונים הקשורות לגיל של חילוף החומרים האנרגיה דרך ההפעלה של מטרות תעתיק3.
במבחני ביולוגיים, כגון מדידת ריכוזים ו לקטט פירובט בתאים, הרגישות דיוק, גודל המדגם, זמן הדגירה של ערכי צבע מוחלטים/fluorimetric assay ערכות שופרו באופן דרמטי. בשל חידושים טכנולוגיים, עתה אנו מסוגלים לנתח מטבוליטים שונים של מטבוליטים ביניים ללא תרבות בקנה מידה גדול של C. elegans, אשר קשה בהתחשב גודלו הקטן. באופן כללי, הרגישות של וזמינותו ערכי צבע מוחלטים היא בסדר גודל קטן יותר מזה של וזמינותו fluorimetric; עם זאת, הגישה ערכי צבע מוחלטים מתאימה יותר בסביבה של מעבדות נפוצות. יתר על כן, שיטת החילוץ המכילה משקעים המגון וחלבון הוא קריטי עבור קביעת כמותית של ריכוזים ו לקטט פירובט בתאי C. elegans כי תחום זה תולעים נימיות שלד חיצוני קרא את הקוטיקולה, בניגוד בתרבית של תאים בתרבית קווים4,5. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול לנתח ריכוזים ו לקטט פירובט באמצעות ערכות assay ערכי צבע מוחלטים מסחרי הכולל טיפים להפקת מדגם של C. elegans.

<table><tbody><tr><td>ערכת בדיקה קולורימטרית/פלואורמטרית לקטט&nbsp;</td><td>BioVision</td><td>#K607-100</td><td>בדיקות קולורימטריות/פלואורימטריות 100; אחסן ב-20oC</td></tr><tr><td>EnzyChrom Pyruvate ערכת בדיקה</td><td>BioAssay Systems</td><td>#EPYR-100</td><td>בדיקות קולורימטריות/פלואורומטריות 100; יש לאחסן ב-20oC</td></tr><tr><td>BCA Protein Assay</td><td>Kit Thermo Scientific</td><td>#23225</td><td>מבחן קולורימטרי; יש לאחסן ב &nbsp; טמפרטורת החדר</td></tr><tr><td>חומצה טריכלורואצטית</td><td>Wako Pure Chemical</td> <td>#207-04955</td><td>יש לאחסן בטמפרטורת</td></tr><tr><td>החדר הומוגנייזר טפלון&nbsp;</td><td>Iwaki/Pyrex</td><td>#358034 (Wheaton)</td><td>במקום Iwaki/Pyrex, זמין על ידי Wheaton</td></tr></tbody></table>

ערכי צבע מוחלטים מבחני של תאיים לקטט בקנה מידה קטן ו פירובט ב נמטודות caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

לקטט פירובט intermediates מפתח של מסלולים מטבוליים אנרגיה תאיים בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. פיקוח על היחס לקטאט/פירובט בתאים מסייעת כדי לקבוע אם קיים חוסר איזון בחילוף החומרים האנרגיה הקשורות לגיל בין זרחון חמצוני מיטוכונדריאלי גליקוליזה אירובי. כאן, אנו מראים את הניצול של ערכות assay ערכי צבע מוחלטים מסחרי ו לקטט פירובט באורגניזם מודל C. elegans. לאחרונה, הרגישות והדיוק של ערכות ערכי צבע מוחלטים/fluorimetric assay שופרו במידה רבה על ידי מחקר ופיתוח בניצוחו של ריאגנט יצרנים. ריאגנטים משופרת אפשרו את השימוש מבחני בקנה מידה קטן עם צלחת 96-ובכן C. elegans. באופן כללי, וזמינותו fluorimetric עדיפה על רגישות וזמינותו ערכי צבע מוחלטים; עם זאת, הגישה ערכי צבע מוחלטים מתאים יותר לשימוש במעבדות נפוצות. בעיה חשובה נוספת ב אלה מבחני לקביעת כמותית היא חלבון משקעים של הומוגני C. elegans דגימות. בשיטה שלנו חלבון משקעים, precipitants משותף (למשל., חומצת חומץ טריכלור, חומצה על-כלורית, חומצה metaphosphoric) משמשים עבור הכנת הדוגמא. מדגם assay נטול חלבון מוגש על-ידי הוספת ישירות קר precipitant (ריכוז הסופי של 5%) במהלך המגון.

באמצעות מבחני את ערכי צבע מוחלטים לקביעת ריכוזים ו לקטט פירובט כמותית, הראנו את הדיוק של אלה מבחני לעומת דוחות הקודם ב- C. elegans7,8. כאן, התהליך של חלבון משקעים במהלך חילוץ מדגם היה השלב המכריע ביותר כדי להפיק ערכים מדויקים. עבור חלבון משקעים, precipitants נפוצות (למשל., TCA, PCA, או חומצה metaphosphoric) ניתן להשתמש כדי להכין את הבדיקה דוגמאות (איור 1). ב- C. elegans, עם ...

נתאר החילוץ בקנה מידה קטן שונה ואת מבחני ערכי צבע מוחלטים של ו לקטט פירובט ב תולעים נימיות C. elegans. כאשר ניצול מסחרי assay ערכות, פיתוח טכני של הרגישות והדיוק שלהם חשובה. חלבון משקעים החילוץ הוא השלב הקריטי ביותר של הקביעה כמותית של מטבוליטים תאיים.

ערכי צבע מוחלטים מבחני של תאיים לקטט בקנה מידה קטן ו פירובט ב נמטודות Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

מחקר זה יכול לעזור לענות על כל שאלה בהם ספירת ביוכימיה ותחום המתודולוגיה כגון ניתוח של זכויות פיתוח nematode. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא משקעים בחלבון בהסגרה ושתייה והומוגניזציה של התולעים. התחל ניסוי זה על ידי גידול זן E.coli OP50 ב 300 מיליליטר של מדיום נוזלי מרק LB ב 37 מעלות צלזיוס לילה.אחסן OP50 מוצלח בארבע מעלות צלזיוס. פיפטה שני מיליליטר של OP50 מתורבת על מינימום שלושה NGM שהוכן בעבר, או Nematode צמיחה מדיה אגר צלחות להתפשט ביד מערבל את הצלחת. הדגירה את הצלחות בטמפרטורת החדר לילה כדי ליצור שכבה דקה של OP50.לאחר מכן, השתמש בקיסם סטרילי כדי לבחור חתיכת אגר מצלחת עם תולעים, כדי להוסיף לפחות 100 תולעים לכל צלחת OP50 NGM. תרבות לפחות שלוש צלחות עם התולעים ב 20 מעלות צלזיוס, עד התולעים להגיע לשלב למבוגרים, אשר אושר תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי. אתר הרמפרודיטים gravid מלא ביצים באמצעות מיקרוסקופ סטריאוסקופי.לאחר הוספת חמישה מיליליטר של S-buffer לצלחות, להשתמש פיפטה פסטר להעביר את התולעים מכל שלוש הצלחות לצינור חרוט 15 מיליליטר. לשטוף את התולעים שלוש פעמים על ידי הוספת 15 מיליליטר של S-buffer ולאחר מכן צנטריפוגה ב 300 פעמים G בטמפרטורת החדר במשך 30 שניות. אם אמצעי האחסון של S-buffer חורג מחמישה מיליליטר, הסר את המאגר העודף לאחר הצנטריפוגה.לזיכוי מוצלח ובידוד ביצים בתפזורת, ממיסים את התולעים ב-0.5 מיליליטר של תמיסת היפו כלורט אלקליין. מערבבים על ידי היפוך ודגירה בטמפרטורת החדר במשך 10 עד 15 דקות. צנטריפוגה ב 1, 400 סל"ד במשך 30 שניות כדי להסיר את הפתרון.השתמש 15 מיליליטר של S-חיץ לשטוף את גלולת הביצה. לאחר צנטריפוגה זה להסיר את supernatant ולחזור על זה לשטוף לפחות שלוש פעמים. לאחר הכביסה האחרונה, אנו להשעות את גלולה בחמישה עד שישה מיליליטר של S-buffer, ללא E.coli ו דגירה הביצים לילה ב 20 מעלות צלזיוס לבקוע אותם ולהשיג תרבות סינכרונית H של זחלי שלב L1.פיפטה 10 מיקרוליטרים של S-buffer המכיל תולעי L1 על שלוש תלושי כיסוי. ספור את הזחלים תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי וחשב את הממוצע כדי לקבוע את המספר המשוער של זחלי שלב L1. לבסוף, להעביר את הזחלים שלב L1 לחמישה צלחות אגר NGM עם OP50 ולגדל אותם ב 20 מעלות צלזיוס עד השלב הצעיר למבוגרים, שבמהלכו הפריה עצמית מתרחשת וכמה ביצים מונחות.שימו לב לתולעים כל יום מתחת למיקרוסקופ ואז אספו את הצעירים, או תולעים בני חמישה ימים. כדי לבחור רק תולעים חיות, הוסף את התולעים התלויות בשלושה עד ארבעה מיליליטר של S-buffer לצינור חרוט 15 מיליליטר. לאחר מכן מוסיפים נפח שווה של 60% סוכרוז קר כקרח ומערבבים.צנטריפוגה הצינור ב 1, 500 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס במשך 15 שניות. לאחר מכן השתמש פיפטה פסטר בזהירות להזיז את התולעים מקיר הצינור, ולאחר מכן להסיר את התולעים הצפות לתוך צינור טרי. ממלאים את הצינור ב- S-buffer כדי לשטוף את התולעים, וצנטריפוגה ב 1500 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס במשך 30 שניות.הסר את המאגר וחזור על שטיפה פעמיים נוספות. לאחר הכביסה השלישית, הסר בזהירות את העל-טבעי, הקפד לא להסיר תולעים, ולהשתמש בקצה פיפטה של 1,000 מיקרוליטר כדי למדוד את הנפח הרטוב של התולעים השטופות. למשקעי חלבון, השתמשו בפיפיאט פסטר כדי להוסיף את התולעים השטופות לנפח שווה של חומצה קריכלורואצטית קרה כקרח של 10% בהומוגניזציה המונחת על קרח.הומוגניזציה באמצעות 40 משיכות פסאל עם סיבוב, עד 1, 300 סל"ד. השתמש homogenizer קולי עם 20% מחזור החובה כדי sonicate הומוגנית. השתמש פיפטה פסטר להעביר את הומוגנטי ל 1.5 צינור מיליליטר להציב על קרח.לאחר העברת homogenate לצינור מיקרו צנטריפוגה, צנטריפוגה ב 8, 000 זמן G בארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות כדי להבהיר את זה. מעבירים את העל-טבעי לצינור טרי ומוסיפים ארבעה אשלגן כלורי טוחן ודגירה על קרח במשך 20 דקות כדי לנטרל אותו. ואז צנטריפוגה זה ב 8, 000 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.מעבירים את העל-טבעי לצינור טרי ומאחסנים ב-80 מעלות צלזיוס עד לצורך בבדיקות נוספות. כדי למדוד את ריכוז הלקטאט, השתמש בערכת בדיקה צבעונית כדי לבצע ניתוחים כפולים עבור דגימות הבדיקה. הוסיפו 10 מיקרוליטרים של דגימות הבדיקה לכל באר של צלחת של 96 בארות, ולאחר מכן הוסיפו מאגר בדיקת לקטט לכל דגימה כדי להתאים את עוצמת הקול ל-15 מיקרוליטרים.לדלל 100 מילימולר L + לקטט רגיל עם מאגר מיסי לקטט למילימולר אחד. לאחר מכן, לתוך סדרה של בארות, להוסיף אפס, שתיים, ארבע, שש, שמונה, ו 10 microliters של תקן L + לקטט מדולל. מוסיפים 50 מיקרוליטרים של תערובת תגובה לכל באר, ו דגירה בטמפרטורת החדר מוגנת מפני אור לפחות 30 דקות להתפתחות הצבע.לבסוף, השתמש בקורא מיקרופלסטיק כדי למדוד את הספיגה של כל באר ב 570 ננומטר. הפחת את הספיגה של תערובת בקרת הרקע מהספיגה של תערובת התגובה. לאחר מכן להתוות את העקומה הסטנדרטית לקטט, ולחשב את ריכוזי לקטט מן העקומה על ידי הכפלת כל ריכוז על ידי 2.25.השתמש בערכת בדיקה צבעונית כדי למדוד את ריכוז הפירובט בדגימות הבדיקה, ולבצע בדיקות דופלקס. הוסף 10 microliters של דגימות הבדיקה בארות שונות של צלחת 96 באר, ולהוסיף 90 microliters של reagent עובד לכל מדגם. הדגירה מכוסה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.לאחר מכן מניחים את הצלחת אצל קורא המיקרופלסטיק כדי למדוד את הספיגה של כל באר ב-570 ננומטר. להתוות את העקומה הסטנדרטית פירובט, ולחשב את ריכוזי פירובט מן העקומה הסטנדרטית על ידי הכפלת כל ריכוז על ידי 2.25. ולבסוף, כדי למדוד את ריכוז החלבון בדגימות הבדיקה, השתמש בערכת בדיקה צבעונית כמתואר בפרוטוקול הטקסט.לאחר משקעים חלבון, בדיקות colorimetric יכול לשמש לקביעה כמותית של ריכוזי לקטט פירובט. ניסוי זה מראה את הדיוק של אסיונות צבעוניים בניגוד לדיווחים קודמים ב- C.Elegans. יתר על כן, אלה assays רגישים מספיק כדי למדוד ריכוזי לקטט פירובט אפילו בדגימות בקנה מידה קטן בתקופה קצרה של זמן.כדי לזהות במדויק לקטט ופירובט ב C.elegans, חיוני לבצע משקעים חלבון במהלך הומוגניזציה של התולעים. כמות הלקטאט והפירומט שזוהו גבוהה יותר כאשר דגימות הן חלבון זירז במהלך הומוגניזציה, לעומת שבר ציטוסולי שלם או לאחר הומוגניזציה כאשר לא זוהה לקטט או פירובט בכלל.

small-scale-colorimetric-assays-intracellular-lactate-pyruvate

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

סרטון זה מציג כימוטקסיס בנמטודה C. elegans ומציג פרוטוקול לדוגמה הבודק סלידה כימוטקטית מנחושת גופרתית.

ג. אלגנס בדיקת כימוטקסיס: שיטה לבדיקת כימוסנסציה בתולעים

סרטון וידאו זה מתאר בדיקה קולורימטרית למדידת לקטט בליזטים של תאים באמצעות האנזים לקטט דהידרוגנאז. אנזים זה ממיר לקטט לפירובט, יחד עם המרה של NAD ל-NADH שמגיב עם צבעי טטרזוליום ונותן תוצר צבעוני שניתן למדוד ספקטרופוטומטרית כדי לכמת את הלקטט.

בדיקה קולורימטרית לכימות לקטט בדגימות בדיקה

סרטון זה מתאר בדיקה קולורימטרית למדידה כמותית של פירובט בשברים התאיים של Caenorhabditis elegans. תוך ניצול מי חמצן המופקים מהתגובה האנזימטית של פירובט אוקסידאז עם פירובט תאי, צבע כרומוגני מחומצן כדי לייצר תוצר צבעוני, הנמדד באמצעות קולורימטריה כדי לקבוע את ריכוז הפירובט.

בדיקת פירובט להערכת רמות פירובט בשברים תאיים של תולעים

אנו מציגים שיטות ביוכימיות ומיקרוסקופיות חזקות...

הערכה ביוכימית ותפוקה גבוהה מיקרוסקופית של מסת שומן ב<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

שריר שלד הוא חיוני לתנועה, והוא חנות החלבון העיקרית של הגופים. מדידות בריאות שרירים בתוך סי אלגנס מתוארות. שינויים פוטנציאליים למבנה שרירים ובתפקודם הוערכו באמצעות ה- GFP מקומי וצבעים קטיוני.

שיטות להערכת subcellular תאים של שריר ב C. elegans

פרוטוקול מתואר לזיהוי in vivo של השפעות של מעכבי מיטוכונדריה באורגניזם המודל Caenorhabditis elegans ולזיהוי תרכובות משפרות פוטנציאליות. ניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי לסנן ספריות תרופות עבור תרכובות המווסתות את תפקוד המיטוכונדריה.

Screenable<em&gt; In vivo</em&gt; Assay עבור מיטוכונדריאלי מאפנני שימוש הטרנסגניים Bioluminescent<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

אנו מציגים התנהגות הקלטה הקלטה ופרוטוקול המאפשר ניתוח אוטומטי של נמטודות, Caenorhabditis elegans 'העדפת תרכובות מסיסות באסאי מבוסס האוכלוסייה. מאמר זה מתאר את הבנייה של תא התנהגות, פרוטוקול assay התנהגותי, וניתוח וידאו השימוש בתוכנה.

ניתוח אוטומטי של אוכלוסיה מבוססת נמטודות מבוססי Assay העדפה

מדריך צעד אחר צעד כדי לחקור אובדן של חומציות lysosomal במעי של C. elegans באמצעות לצבוע חיוני רגיש pH 5 (6) - carboxy - 2', 7'-dichlorofluorescein diacetate...

הערכת Alkalinization Lysosomal ב המעי של חיים Caenorhabditis elegans

פרוטוקול זה מתאר כיצד למדוד חדירות המעי של האלגיה. שיטה זו מועילה למחקרים ביולוגיים בסיסיים על בריאות המעיים הקשורים לאינטראקציה בין בקטריה מעיים למארחים שלהם ולהקרנה כדי לזהות פרוביוטיקה וחומרים כימיים כדי לרפא תסמונת המעיים הדולף ומחלות המעי דלקתיות.

מדידת ההשפעות של חיידקים וכימיקלים על חדירות המעי של האלמרנים

מחקר זה מציג פרוטוקולים עבור שתי גישות ניתוח פעילות לוקומוטור חצי אוטומטי ב C. elegans קומפלקס I מחלות גז-1(fc21) תולעים, כלומר, ZebraLab (בדיקת תפוקה בינונית) ו- WormScan (בדיקה בעלת תפוקה גבוהה) ומספקים ניתוח השוואתי בין מגוון רחב של שיטות מחקר לכימות התנהגות נמטודה ותפקוד עצבי שרירי משולב.

ניתוח השוואתי של שיטות ניסיוניות לכימות פעילות בעלי חיים בקאנורבדיטיס אלגנס מודלים של מחלות מיטוכונדריאליות

הוראת המדעים הביולוגיים יכולה להיות מגרה יותר עבור התלמידים באמצעות שימוש בניסויים. כתב יד זה מציג שני פרוטוקולים שונים אך משלימים שניתן להשתמש בהם בכיתה כדי לעודד תלמידים לנסח ולבדוק השערות הקשורות לתזונה עתירת קלוריות, רעב והזדקנות.

שימוש בצבעים זולים כדי להמחיש הצטברות גליקוגן ושלמות המעי ב - Caenorhabditis elegans

למדו שיטה לכימות לקטט ופירובט ב-Caenorhabditis elegans באמצעות ערכי צבע מוחלטים. שיטת השקעת חלבונים מבטיחה דיוק גבוה במדידות מטבוליטים בתאי הנמטודה.

ערכי צבע מוחלטים מבחני של תאיים לקטט בקנה מידה קטן ו פירובט ב נמטודות Caenorhabditis elegans

גלה סרטונים נוספים