השוואה ברזולוציה גבוהה של תדרים קוניוגציה

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום המיקרוביולוגיה על התדירות שבה ניתן להפיץ דנ"א פלסמיד בין חיידקים שונים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי על ידי הפחתת הרקע, אנו יכולים לזהות הבדלים קטנים בתדירות ההתייחדות עם רזולוציה גבוהה. הדגמת ההליך תהיה Kosuke Yanagiya, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי.

כדי לחשב את תדירות ההזדווגות לפי המספר הסביר ביותר, סנן להזדווג מיליליטר אחד מתרבות תורמים לילה עם מיליליטר אחד מתרבות נמען לילה במשך 45 דקות ב 30 מעלות צלזיוס, כפי שהודגם רק. בעוד התרבות השיתוף היא דגירה, באופן סדרתי לדלל את התרבויות התורם והמקבל המקורי עבור ציפוי ב- triplicate על מרק לוריא התורם, או LB, בתוספת kanamycin, או נמען LB בתוספת צלחות ג'נטמיצין לתרבות של יומיים ב 30 מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, תן שימוש חוזר בתרבות על המסנן ב- LB סטרילי המכיל קנאמיצין וג'נטמיצין לדילול סדרתי בצלחת תרבות תאים 96 באר quadruplicate.

לאחר יומיים ב 30 מעלות צלזיוס, לספור באופן ידני את יחידות יוצרי המושבה, או CFUs, על הלוחות אגר התורם והמקבל ואת מספר בארות שבו transconjugants לגדול על ידי מיקרוסקופ אור. כדי לחשב את המספר הסביר ביותר ואת החריגה שלו, פתח את תוכנית חישוב MPN. הזן את השם והתאריך של הניסוי, את מספר סדרות הבדיקה ואת המספר המרבי של דילולים בשורה השביעית של גליון התכנתים של קובץ הגיליון האלקטרוני.

בטבלאות נתוני הקלט המיוצרות באופן אוטומטי, הזן את הנוסחה בעמודה D של גורם הדילול, 0.01 באמצעי האחסון במיליליטר או בעמודת GW וארבע בעמודה N של מספר הצינורות. הזן את מספר הבארים שבהם transconjugants גדל בכל דילול מדגם ולחץ לחשב תוצאות כדי להשיג את התוצאות כמספר הסביר ביותר למיליליטר, ואת העליון והתחתון 95%ביטחון גבולות. לאחר מכן חלקו את מספר הטרנסקונוגנטים במספר התורמים ומושבת הנמענים ויוצרים יחידות למיליליטר כדי לחשב את תדירות ההטיה של הפלסמידים.

בניסוי מייצג זה, תדירות ההטיה של שתי הפלזמידים גדלה בשיעורי ערבוב גבוהים יותר עם הבדל מרבי בתדירות ההטיה שנצפתה בין אפס ל -400 סל"ד לתרבויות שהוצגו לפלסמיד pBP136:gfp, ובין אפס ל -200 סל"ד לתרבויות שהוצגו לפלסמיד pCAR1:gfp. כדי לקבוע את הצפיפות של תאי הנמען הנדרשים להשוואת ההסתברות להטיה, בדיקות הזדווגות בוצעו עם צפיפות תורמים ונמען שונה. בניסוי מייצג זה, pBP136:gfp transconjugants זוהו ב 100% של בארות המכילות פעם אחת 10 ל- CFU השלישי של התורם ו 1 פעמים 10 כדי החמישית עד אחת 10 כדי CFU השביעי של הנמען, ואלה עם פעם אחת 10 ל CFU השני של התורם ו 1 פעמים 10 כדי השישי עד 10 כדי CFU השביעי של הנמען המציין שצפיפות התאים הייתה גבוהה מדי.,

הזדווגות עם 10 CFU של תורם ו 10 כדי השישי או 10 כדי CFU החמישי של הנמען, עם זאת, הביא לירידה במספר בארות חיוביות transconjugant. לפיכך, 10 עד CFU החמישי של הנמען היה צפוי להידרש להזדווגות עם תא תורם יחיד. ההזדווגות עם pCAR1:gfp בצפיפות שונה של זנים תורמים ונמענים הדגימה ממצאים דומים, אם כי בסך הכל אחוזי בארות חיוביות transconjugant היו נמוכים בהרבה מאלה של pBP136:gfp.

בהנחה שתאי התורם והמקבל יכולים לצרף זה לזה באופן דומה, ההסתברות ליזום התייחדות עבור התורם pCAR1 הייתה נמוכה יותר מאשר עבור התורם pBP136. בהתבסס על תוצאות אלה, ההערכה היא כי 10 עד CFU השביעי של הנמען נדרש עבור תא תורם יחיד ממוין על ידי FACS. לאחר ספירת המספרים של בארות חיוביות transconjugant, אחוז בארות חיוביות transconjugant עבור pBP136:gfp נקבע להיות גדול יותר מזה עבור pCAR1:gfp, המדגים הבדל של יותר מ 36 גרם בהסתברות של ההטיה יזמית התורם בין שתי פלסמידים אלה.

בעת ניסיון ההליך, חשוב לזכור תמיד לדלל את תערובות חיידקים בזהירות.