בגישה מוטגנזה מכוונת רוויה הרומן: אפיון צעד בודד של חלבון תקינה מחייב אתרים ב- RNA באמצעות Phosphorothioates

המטרה הכוללת של גישה זרחנית זו ב-RNA היא לבצע מוטגנזה רוויה בשלב אחד. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה המולקולרית כגון ויסות גנים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שבשלב אחד ניתן להשיג מוטגנזה רוויה של אתר קשירת חלבון ב-RNA.

שלב מפתח בפרוטוקול מוטגנזה של רוויה חד-שלבית זה הוא לסמם את תבנית ה-DNA בנוקלאוטידים מסוג לא בר בתוך אתר קשירת החלבון. ראשית סנתז פריימר T7 על ידי סינתזה כימית על סינתיסייזר DNA. לאחר מכן, סנתז אוליגונוקלאוטיד מסומם המתאים לאתר קשירת החלבון.

בדוגמה זו, הרצף המסומן בקו תחתון מכיל את המשלים ההפוך של אתר קשירת החלבון הקטלני של הדרוזופילים, כאשר כל אתר סימום מיוצג על ידי X.השתמש ביחס של 90% נוקלאוטיד מסוג פרא ל-10% נוקלאוטיד מסוג לא פרא עבור כל אתר סימום. הרצף בירוק משלים את רצף הפריימר T7 והוא מקדם T7 לשעתוק במבחנה. השלב הבא בפרוטוקול זה הוא סינתזה של RNA נפרדים עם כל נוקלאוטיד זרחני ואחריו תיוג רדיו 5-prime-end של ה-RNA.

לסנתז RNA עבור כל זרחן בתגובת שעתוק של 20 מיקרוליטר. לכל צינור מיקרו-צנטריפוגה, הוסף את הדברים הבאים:מאגר שעתוק T7, אוליגונוקלאוטיד T7 מיקרומולרי אחד, אוליגונוקלאוטיד מסומם מיקרומולרי אחד, 10 מילי-מולרי DTT , שני מילי-מולרי GTP, מילי-מולרי אחד כל אחד של ATP, CTP ו-UTP, ושתי יחידות למיקרוליטר של T7 RNA פולימראז. הוסף 0.167 מילימולר של אלפא-תיו ATP לצינור אחד ו-0.05 מילימולר של אלפא-תיו UTP לצינור השני.

דגרו על תערובות תגובת סינתזת ה-RNA ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. לאחר שעתיים, הוסף 2.5 מיקרוליטר של אלפא פוספטאז בעל יכולת חום ו-2.5 מיקרוליטר של מאגר פוספטאז 10X לכל דגימת RNA. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 עד 30 דקות כדי להסיר פוספטים 5 ראשוניים.

השבת את האנזים פוספטאז אלקליין על ידי חימום בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס למשך שתיים עד חמש דקות. השלבים הנותרים כוללים שימוש ברדיואקטיביות ויש לבצע אותם תוך שימוש באמצעי זהירות מתאימים ומגן פרספקס להגנה מפני רדיואקטיביות. כדי לתייג את הקצה ה-5 ראשוני של ה-RNA הזרחני, השתמש במיקרוליטר אחד של T4 פולינוקלאוטיד קינאז ומיקרוליטר אחד של Gamma P32 ATP בנפח תגובה של 10 מיקרוליטר.

דגרו את תערובת התגובה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 עד 60 דקות. השבת את האנזים T4 פולינוקלאוטיד קינאז על ידי חימום ב-65 מעלות צלזיוס למשך 20 עד 30 דקות. הפעל את התגובות בג'ל פוליאקרילאמיד 10%.

אתר RNA על הג'ל על ידי אוטורדיוגרפיה וכרת את פרוסת הג'ל המכילה RNA עם תווית רדיו. מועכים את פרוסת הג'ל בצינור מיקרו-צנטריפוגה על ידי לחיצה על הצד עם קצה פיפטה, ולאחר מכן מוסיפים מאגר חלבון K. סובב את הצינורות בטמפרטורת החדר משעתיים ללילה.

לאחר מכן צנטריפוגה את תמיסת הג'ל, אספו את תמיסת החיץ והשליכו את הג'ל. חלץ כל תמיסה פעמיים בנפח שווה של פנול כלורופורם. לאחר מכן, חלץ את התמיסה פעם אחת עם כלורופורם.

אוספים את השלב המימי ומוסיפים לו 0.1 נפח של נתרן אצטט תלת מולרי pH 5.2, tRNA או גליקוגן נשא ו -2.5 נפחי אתנול. שמור את הדגימות במינוס 80 מעלות צלזיוס למשך שעה. צנטריפוגה את הדגימות במיקרו-צנטריפוגה במהירות גבוהה ב-16,873 פעמים גרם למשך חמש עד 10 דקות.

הסר את תמיסת האתנול המאגר בזהירות מבלי להפריע לכדור ה-RNA. שוטפים את הכדורים עם 70% אתנול וצנטריפוגה למשך שתיים עד חמש דקות. הסר את האתנול בזהירות וייבש את הכדורים באוויר.

השעו מחדש כל כדור ב-20 עד 50 מיקרוליטר של מים שטופלו ב-DEPC. יש לאחסן בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס עד לשימוש. הרעיון של חלוקה עקב הפרעה מודגם כאן.

במהלך תהליך קשירת החלבון, מולקולות RNA מתחלקות בין השבר הקשור לחלבון לבין השבר הלא קשור. אם נוקלאוטיד ספציפי במיקום נתון מפריע לקשירת החלבון, הוא יופרע באופן מועדף מהחלק הקשור לחלבון. לאחר מכן, יוד משמש לפיצול ה-RNA באתרים של שילוב זרחן.

כדי להתחיל בהליכים אלה, הגדר את תגובות הקישור של חלבון-RNA כאשר כל תגובה מכילה 10 מילי-מולרי Tris-HCl, DDT מילי-מולרי אחד, 50 מילי-מולרי אשלגן כלורי, 0.5 יחידות למיקרוליטר של מעכב RNase, 0.09 מיקרוגרם למיקרוליטר של אלבומין בסרום בקר אצטיל, EDTA מילי-מולרי אחד, 0.15 מיקרוגרם למיקרוליטר של tRNA, RNA בעל תווית רדיו 5-prime-end ושישה מיקרוליטרים של ריכוז מתאים של החלבון. דגרו את תגובות קשירת החלבון בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך 20 עד 30 דקות. הפרד את שבר ה-RNA הקשור לחלבון מהשבר הלא קשור על ידי קשירת מסנן ניטרוצלולוזה.

החל את תגובת הכריכה על מסנן ניטרוצלולוזה המחובר לסעפת ואקום בטמפרטורת החדר. רק קומפלקס חלבון ה-RNA יישמר על המסנן בזמן ש-RNA לא קשור זורם דרך המסנן. חותכים את החלק של מסנן הניטרוצלולוזה המכיל את ה-RNA הרדיואקטיבי שנשמר לחתיכות קטנות יותר כדי להתאים לצינור מיקרו-צנטריפוגה ולהוסיף מספיק מאגר חלבון K כדי לטבול את חלקי המסנן.

הסר RNA מחלקי המסנן למשך שעתיים-שלוש או למשך הלילה. לאחר מכן, העבירו את התמיסה מכל צינור לצינור חדש וחלצו עם פנול כלורופורם וכלורופורם כפי שהודגם קודם לכן. אוספים את השלב המימי ומוסיפים לו 0.1 נפח נתרן אצטט תלת מולארי, pH 5.2 ו -2.5 נפחי אתנול ודוגרים במקפיא.

לאחר צנטריפוגה, שטיפה וייבוש ה-RNA כפי שהוצג קודם לכן, השעו מחדש את ה-RNA במים שטופלו ב-DEPC. יש לבצע את כל השלבים הכרוכים ביוד במכסה המנוע. כדי לבקע RNA באתרי שילוב זרחן, הוסף לכל דגימת RNA יוד של מילי-מולרית אחת ב-20 מיקרוליטר של מים שטופלו ב-DEPC המכילים עד 10 מיקרוגרם של tRNA נשא.

דוגרים בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. זרז RNA שסוע על ידי הוספת נתרן אצטט ואתנול כפי שהוצג קודם לכן. השעו מחדש RNA שסוע בצבע טעינה לג'לים לדנטורציה.

לאחר החימום, טען את הדגימות בג'ל פוליאקרילאמיד 15-20% דה-נטורינג והפרד את שברי ה-RNA באמצעות אלקטרופורזה. חשוף את ג'ל הפוליאקרילאמיד לסרט רנטגן וגלה רצועות בשבר הקשור לעומת המאגר הכולל באמצעות אוטורדיוגרפיה. סכימה זו ממחישה את הרעיון של חלוקה עקב הפרעות.

בנתיב T, שבר ה-RNA הכולל, עוצמת הלהקה שווה בערך לכל המיקומים המסוממים. בשבר ה-RNA הקשור לחלבון, במיקומים 1, 4 ו-7, לנוקלאוטיד אין השפעה על הקשירה. עם זאת, במיקומים 3 ו-6, הוא מפריע לקשירה ואינו נכלל בשבר הקשר.

בעמדה 5, ההפרעה היא חלקית. השוואות של נתיבים זוגיים עבור כל נוקלאוטיד מאפשרות ניתוח של כל ארבעת הנוקלאוטידים. אוטורדיוגרף זה מראה שני זוגות נתיבים מג'ל דנטורינג.

נתיב T הוא RNA כולל ונתיב B הוא RNA קשור לחלבון. הקו האנכי מסמן את אתר הקישור הקטלני. עבור זוג אלפא-תיו-אלין, רצועות 1, 2, 3 ו-5 קיימות בשבר ה-RNA הכולל אך נעדרות או מופחתות משמעותית בשבר ה-RNA המאוגד.

עבור צמד אלפא-תיו-אולין, רצועות 7 ו-8 פחות אינטנסיביות יחסית בשבר הקשום. שאריות שאינן נכללות באופן מועדף מהחלק הקשור חשובות לקשירת חלבון. לאחר שה-RNA מסונתז ומסומן 5-prime-end, ניתן לבצע טכניקה זו תוך 12 שעות אם היא מבוצעת כראוי.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור כי רמה מתאימה של שילוב זרחנים וקביעת ריכוז החלבון המתאים לקשירה הם שיקולים חשובים. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו בדיקות פונקציונליות מתאימות או בדיקות in vivo כדי לאמת את התוצאה של גישת המוטגנזה ולהבין את הרלוונטיות הביולוגית. טכניקה זו מספקת אלטרנטיבה לשיטות אחרות שהן יקרות יותר או מייגעות יותר או שניהם.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לתכנן ולסנתז ספריית מוטנטים, לבצע תגובות קשירה, לזהות נוקלאוטידים מוטנטיים בכל מאגר ולנתח כמותית את ההשפעה של נוקלאוטידים מסוג לא פרא בכל מיקום שנבדק. אל תשכח שעבודה עם פוליאקרילאמיד ורדיואקטיביות עלולה להיות מסוכנת ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות, כגון שימוש בכפפות, פליטה נכונה ומגנים רדיואקטיביים בעת ביצוע הליך זה.