השיטה קבע עותק משוכפל: בגישה תפוקה גבוהה באופן כמותי מידה Caenorhabditis elegans תוחלת החיים

זוהו מאות גנים שתפקודם משפיע על האופן שבו אורגניזם מזדקן. אבל רבות ממערכות היחסים שלהם אינן מובנות היטב. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלת מפתח בתחום ההזדקנות.

כלומר, מהם יחסי הגומלין הגנטיים בין גנים של gerA? היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא עלייה בתפוקה, מספר הפרדבציות הגנטיות שניתן למדוד כמותית בו זמנית גדל לפחות בסדר גודל. ניתן לשרטט ולנתח נתוני תוחלת חיים, שנאספו בהליך זה באמצעות תוכנה שאנו מספקים עם פרסום זה.

בנוסף לספק תובנה לגבי תוחלת החיים, ניתן ליישם שיטה זו גם על פנוטיפים אחרים הקשורים לגיל, כגון עמידות בפני לחץ ושינויים בקופת החולים. להליך זה, צור חותמת חדשה של ספריית המשנה RNAi. ראשית, ציטט כל באר של צלחת של 96 בארות, עם 200 מיקרוליטר LB עם אמפיצילין, באמצעות צינור 12 ערוצים.

עקר משכפל צלחות בעל 96 פינים על ידי טבילה רציפה של הפינים ב-50% אקונומיקה ואחריה מים טהורים במיוחד. לאחר מכן טובלים את הקצוות באתנול, ומדליקים בזהירות את הקצוות. לאחר מכן, הסר בזהירות את מכסה נייר הכסף של צלחת ספריית מלאי גליצרול קפואה עם 96 בארות, וטחן בעדינות אך בחוזקה את קצות משכפל הצלחות המעוקר לבארות של מלאי הגליצרול שעדיין קפוא.

לאחר מכן יש לחסן את התרביות ולאטום את הצלחת המחוסנת בקרום החדיר. אפשר לתרביות לצמוח בן לילה על הספסל. למחרת, עקרו את משכפל הצלחות, והסירו בזהירות את החותם מתרבית הלילה, וטבלו את קצות סיכות המשכפל.

לאחר מכן, יש לחסן צלחת מלבנית של אמפיצילין וטטרציקלין אגר עם הסיכות. הפעל לחץ אחיד, והשתמש בתנועה מעגלית קטנה כדי להעביר את החיידקים מבלי לתת לכתמים להיות צפופים מדי. לאחר מכן, דגרו את הצלחות למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

למחרת, על כל 10 לוחות העתק הדרושים, טען כל באר של צלחת 96 בארות עמוקה עם 1.5 מיליליטר LB באמפיצילין. לאחר מכן, חסנו את הבארות בחיידקים המתורבתים. לאחר מכן, אטמו את הצלחת בקרום נושם, תרבית אותה במשך 20 שעות בניעור.

בארות בקרה צריכות להיות מפוזרות על פני 96 הבארות, כך שכאשר לוח תת-הספרייה של 96 הבארות מחולק לקבוצות של 24, לכל חלוקה של 24 בארות יש אחת מכל אחת מהבקרות. למחרת, טען 120 מיקרוליטר של התרבית, לצלחות של 24 בארות, באמצעות פיפטה רב-ערוצית בת שש בארות, עם מרווח קצה מתכוונן. לאחר מכן, צלחות יבשות חשופות במכסה זרימה למינרי עד שכל הנוזלים נספגים.

אל תתנו להם להתייבש יתר על המידה. הקפד לשמור על המיקוד שלך בעת ציטוט תרביות נוזליות, כדי להבטיח שתרבית החיידקים הנכונה מוכנסת לבאר המתאימה בצלחת של 24 בארות. ניסויי סט העתק מתחילים בקבוצה של צלחות עצמאיות בעלות 24 בארות, שכל אחת מהן זרעה עם אותם שיבוטי RNAi של חיידקים.

עבור ניסויי תוחלת חיים, 15 עד 20 בעלי חיים L1 מתווספים לכל צלחת היטב, ומאפשרים להם לגדול לשלב L4. ב-L4, FUdR מתווסף לכל הבארות על פני שכפולים. מאוחר יותר באותו יום, ניתן לקחת צלחת משוכפלת מהסט ולרשום אותה כנקודת הזמן הראשונה.

כדי להשיג תוחלת חיים, מוסיפים נוזל לבארות הצלחת כדי לגרום לתנועת בעלי חיים. בעלי חיים שלא מתחילים לזוז נדחפים בעדינות בעזרת קיסם תולעים. לאחר מכן נרשם המספר הכולל של בעלי החיים ומספר החיות המתות.

לאחר מכן מושלכת הצלחת מהתצפית הראשונה. בנקודת הזמן הבאה של התצפית, לוחית שכפול נוספת נלקחת מהסט, ומנוקדת באופן דומה. זה חוזר על עצמו במרווח הניקוד שנקבע.

כל פעם עם צלחת חדשה מהסט המשוכפל. המשיכו לקלוע סט צלחות עד שאף בעל חיים לא נשאר בחיים. ראשית, סנכרנו אוכלוסיית בעלי חיים עם אותה שיטת הכנה מבוססת אקונומיקה המשמשת לבדיקת תוחלת החיים המסורתית.

לאחר מכן, באמצעות פיפטה מרווח מתכווננת של שש בארות, ומאגר ריאגנטים, זרעו 15 עד 20 בעלי חיים L1 לכל באר של צלחות 24 הבארות המוכנות. בזמן זריעת הצלחות, מערבבים מעת לעת את חיות L1 לתמיסה כדי לשמור על פיזור אחיד. כעת, תנו לבעלי החיים להתפתח ל-L4. יש לדעת את העיתוי של פיתוח L4 עבור פרוטוקול זה.

עקוב מעת לעת אחר התפתחות התולעים. כאשר בעלי חיים מגיעים ל-L4, הוסיפו 24 מיקרוליטר של 50x FUdR לכל באר, והחזירו את הצלחות לחממה. שימוש בחיות L4 הוא קריטי.

אם הרמפרודיטים מגיעים לבגרות רבייה לפני הוספת FUdR, צאצאיהם ישרדו ויאכלו את המזון. לעומת זאת, הוספת FUdR מוקדם מדי מובילה לבעלי חיים קרועים. בנקודות הזמן הרצויות, השתמש בלוחית שכפול אחת כדי להשיג כדאיות.

לשם כך יש להציף את הבאר בתמיסת M9. לפני ציון הכדאיות בכל יום, חיישו בארות שאין בהן מזון, נראות מזוהמות או שיש בהן בעלי חיים עם פגמים מורפולוגיים או התפתחותיים. עבור כל באר, רשום את סך כל בעלי החיים לבאר, ובדוק את מצב התולעים שאינן זזות, על ידי נגיעה עדינה של כל אחת מהן בראשה עם קיסם תולעים.

לאחר ספירת כל המתים שאינם זזים בצלחת, השליכו את הצלחת. עבור הליך זה, גדל טרנספורמציה e. קולי לילה ב-LB עם אמפיצילין.

למחרת, רכזו את החיידקים על ידי צנטריפוגה ב-3,000 גרם למשך 15 עד 20 דקות. השעו מחדש את החיידקים ב-1/10 מהנפח ההתחלתי. לאחר מכן, ציטטו 200 מיקרוליטר של חיידקי פי 10 על לוחות של שישה סנטימטרים.

הכן שלוש או ארבע צלחות לכל תנאי בדיקה, וכלול שתי צלחות נוספות במקרה של זיהום. יבש את הצלחות באצווה זרימה למינרית, עד שכל הנוזלים נספגו או התאדו. לאחר הייבוש, אחסן את הצלחות בקופסת פלסטיק למשך הלילה בטמפרטורת החדר כדי לגרום לייצור RNA דו-גדילי.

לאחר מכן, אחסן את הצלחות עד שבועיים בארבע מעלות צלזיוס. עבור בעלי החיים, אספו בעלי חיים בוגרים ב-M9. שטפו אותם פעמיים עם M9. חוזר על הסיבוב בשאיפה. לאחר מכן, השעו מחדש את C.elegans בארבעה מיליליטר של M9, והוסיפו שני מיליליטר של תמיסת היפוכלוריט.

כעת, מערבל מיד את התולעים למשך שלוש דקות, עם טלטול תקופתי ונמרץ. לאחר מכן, תחת מיקרוסקופ מנתח, חפש ענן ביצים. אם הענן לא נראה, מערבל את התולעים למשך 10 עד 20 שניות נוספות.

לאחר מכן, שטפו במהירות את הביצים עם M9, פעמיים, כמו קודם. ולהשעות את הביצים השטופות בשלושה מיליליטר M9. לאחר מכן, העבירו את הביצים לצינור חדש של 15 מיליליטר, ודגרו בצינור ב-20 מעלות צלזיוס בסיבוב עדין, ואפשרו לעוברים לבקוע למשך הלילה. למחרת, קבע את צפיפות תמיסת L1 המוכנה על ידי חישוב המספר הממוצע של L1s למיקרוליטר בשלוש טיפות של 10 מיקרוליטר.

טען את צלחות זרעי החיידקים המוכנות עם 50 בעלי חיים L1, כל אחד. הגדר את הצלחות באינקובטור של 20 מעלות צלזיוס, עד שהעוברים מתפתחים לשלב L4. התפתחות תקינה מ-L1 ל-L4 אורכת כ-40 שעות.

לאחר מכן, כדי למנוע ייצור צאצאים, הוסף 160 מיקרוליטר של 50x FUdR לכל צלחת. לאחר מכן הסר את הזכרים, מכיוון שתוחלת החיים נמדדת בדרך כלל רק עם הרמפרודיטים. לאחר השלמתו, ארזו מחדש את הצלחות לאינקובטור של 20 מעלות צלזיוס.

עד שכל התולעים מתות, מדרג את הכדאיות שלהן על בסיס יומי. לשם כך, גע בעדינות בכל נמטודה שאינה זזה על הראש עם חוט פלטינה או ריסים. בעלי חיים שאינם מגיבים מתים, ויש להוציא אותם מהצלחת.

שימו לב לכל חריגה במהלך שגרה זו. סט העתק ושיטות מסורתיות לבדיקת תוחלת החיים של C.elegans מניבים תוצאות דומות עם בעלי חיים מסוג N2 מסוג בר. לדוגמה, הפלת RNAi מבוססת הזנה של mml-1 או mxl-2 הפחיתה משמעותית את תוחלת החיים הרגילה.

זה נמדד הן על ידי בדיקת תוחלת חיים מסורתית, והן על ידי בדיקת קבוצת העתק. ניתן לזהות גם אריכות ימים ממושכת. כפי שניתן לראות כאן, RNAi עבור mdl-1 או mxl-1 הגדיל משמעותית את תוחלת החיים של C.Elegans כאשר נמדד על ידי כל אחת מהמתודולוגיה.

באמצעות שיטת קבוצת העתקים, ניתן לכמת בו זמנית שינויים בתוחלת החיים על פני יותר מ-100 תנאים, מה שלא יהיה סביר בגישה מסורתית יותר. לדוגמה, מסך RNAi מבוסס הזנה בכל הגנום זיהה 159 גנים הדרושים לתוחלת החיים המוגברת המוענקת על ידי איתות דמוי אינסולין daf-2 מופחת. הקשר בין איתות דמוי אינסולין לגנים אלה תואר עוד יותר על ידי מדידת תוחלת הבריאות של בעלי החיים.

הבריאות צוינה על ידי c. Elegans מכות כאשר הוא מושעה בתמיסה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש ב-RNAi מבוסס הזנה כדי למדוד את תוחלת החיים של C.Elegans.

אבל RNAi הוא רב תכליתי וניתן ליישם אותו עבור פנוטיפים רבים ושונים. לאחר השליטה, שיטת קבוצת ההעתקים מאפשרת להעריך את תוחלת החיים של למעלה מ-100 שיבוטי RNAi בכל יום, אם היא מבוצעת כראוי. ניתן לצבור נקודות זמן מוקדמות ומאוחרות במהירות.

כל בעלי החיים בבאר יהיו חיים ונעים, או מתים. הניקוד לוקח הכי הרבה זמן כשבעלי חיים מתחילים למות. מדהים את הקמת הניסויים העצמאיים עם זה בחשבון.