Name: זיפרגליים Balanus improvisus כמודל ימית - Culturing, ביטוי גנים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: למד שיטת גידול שנתית לזיפרגליים Balanus improvisus לחקר אוסמורגולציה וטכנולוגיות נגד אבנית. השיטה מאפשרת ייצור של עד 50,000 נאופליי בשבוע וחילוץ RNA איכותי לניתוח ביטוי גנים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי מענק 2017-04559 לבין מועצת המחקר השבדי (VR) הפרוייקט נתמך של האיחוד האירופי על חוף הים אנדרס בלומברג. בפרט, הקמת המתקן culturing, במהלך השנים, בתמיכתם מענקים כדי לכל ר Jonsson של מימון חברות הטיולים הבאות: SSF (שבדי קרן למחקר אסטרטגי) דרך התוכנית מדעי הים וטכנולוגיה, MISTRA דרך התוכנית צבע ימית. Berntsson קנט היה פלייבק בשלבים המוקדמים של הגדרת את culturingfacility. נוספים למימון הקמת המתקן culturing הגיע ממרכז ביולוגיה אבולוציונית ימית (www.cemeb.science.gu.se), אשר הוא נתמך על ידי מענק ליניאוס מן שוודית המחקר מועצות FORMAS ו VR.

<ol><li>Darwin, C. <a target="_blank" href="https://www.biodiversitylibrary.org/bibliography/2104#/summary">A monograph of the sub-class Cirripedia, with figures of all species. The Balanidae (or sessile cirripedes); the Verrucidae, etc., etc., etc</a>. , Ray Society. London, UK. (1854).</li>
<li>Lind, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+aquaporins+from+the+euryhaline+barnacle+Balanus+improvisus+reveals+differential+expression+in+response+to+changes+in+salinity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Analysis of aquaporins from the euryhaline barnacle Balanus improvisus reveals differential expression in response to changes in salinity.</a> PLoS ONE. 12 (7), 0181192(2017).</li>
<li>Lind, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+the+alpha-subunit+of+Na%2B%2FK%2B+ATPase+from+the+euryhaline+barnacle+Balanus+improvisus+reveals+multiple+genes+and+differential+expression+of+alternative+splice+variants%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of the alpha-subunit of Na+/K+ ATPase from the euryhaline barnacle Balanus improvisus reveals multiple genes and differential expression of alternative splice variants.</a> PLoS ONE. 8, 77069(2013).</li>
<li>Fyhn, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Holeuryhalinity+and+its+mechanisms+in+a+cirriped+crustacean%2C+Balanus+improvisus%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology+-+Part+A%3A+Comparative+Physiology%22%5BJournal%5D)">Holeuryhalinity and its mechanisms in a cirriped crustacean, Balanus improvisus.</a> Comparative Biochemistry and Physiology - Part A: Comparative Physiology. 53 (1), 19-30 (1976).</li>
<li>Wrange, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+story+of+a+hitchhiker%3A+population+genetic+patterns+in+the+invasive+barnacle+Balanus+%28Amphibalanus%29+improvisus+Darwin+1854%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">The story of a hitchhiker: population genetic patterns in the invasive barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus Darwin 1854.</a> PLoS ONE. 11 (1), 0147082(2016).</li>
<li>Berntsson, K. M., Jonsson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+and+spatial+patterns+in+recruitment+and+succession+of+a+temperate+marine+fouling+assemblage%3A+a+comparison+of+static+panels+and+boat+hulls+during+the+boating+season%5BTitle%5D)+AND+%22Biofouling%22%5BJournal%5D)">Temporal and spatial patterns in recruitment and succession of a temperate marine fouling assemblage: a comparison of static panels and boat hulls during the boating season.</a> Biofouling. 19 (3), 187-195 (2003).</li>
<li>Lind, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Octopamine+receptors+from+the+barnacle+Balanus+improvisus.+are+activated+by+the+alpha2-adrenoceptor+agonist+medetomidine%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Octopamine receptors from the barnacle Balanus improvisus. are activated by the alpha2-adrenoceptor agonist medetomidine.</a> Molecular Pharmacology. 78 (2), 237-248 (2010).</li>
<li>Semmler, H., Hoeg, J. T., Scholtz, G., Wanninger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+of+the+naupliar+musculature+and+a+scanning+electron+microscopy+atlas+of+nauplius+development+of+Balanus+improvisus+%28Crustacea%3A+Cirripedia%3A+Thoracica%29%5BTitle%5D)+AND+%22Arthropod+Structure+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction of the naupliar musculature and a scanning electron microscopy atlas of nauplius development of Balanus improvisus (Crustacea: Cirripedia: Thoracica).</a> Arthropod Structure & Development. 38 (2), 135-145 (2009).</li>
<li>Anderson, D. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAnderson%2C+DT+%22Barnacles+-+structure%2C+function%2C+development+and+evolution%22">Barnacles - structure, function, development and evolution</a>. , Chapman & Hall. London, UK. (1994).</li>
<li>Kennedy, V. S., DiCosimo, J. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.2307/1351700">Subtidal distribution of barnacles in Chesapeake Bay, Maryland.</a> Estuaries. 6, 95-101 (1983).</li>
<li>Dreanno, C., Kirby, R. R., Clare, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locating+the+barnacle+settlement+pheromone%3A+spatial+and+ontogenetic+expression+of+the+settlement-inducing+protein+complex+of+Balanus+amphitrite%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Locating the barnacle settlement pheromone: spatial and ontogenetic expression of the settlement-inducing protein complex of Balanus amphitrite.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 273, 2721-2728 (2006).</li>
<li>Rittschoff, D., et al. <a target="_blank" href="https://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/08927019809378344">Cues and context: larval responses to physical and chemical cues.</a> Biofouling. 12 (1-3), 31-44 (1998).</li>
<li>Berntsson, K. M., Jonsson, P. R., Lejhall, M., Gatenholm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+behavioural+rejection+of+micro-textured+surfaces+and+implications+for+recruitment+by+the+barnacle+Balanus+improvisus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Marine+BIology+and+Ecology%22%5BJournal%5D)">Analysis of behavioural rejection of micro-textured surfaces and implications for recruitment by the barnacle Balanus improvisus.</a> Journal of Experimental Marine BIology and Ecology. 251 (1), 59-83 (2000).</li>
<li>Gamfeldt, L., Wallén, J., Jonsson, P. R., Berntsson, K. M., Havenhand, J. N. <a target="_blank" href="https://esajournals.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1890/05-0377">Increasing intraspecific diversity enhances settling success in a marine invertebrate.</a> Ecology. 86, 3219-3224 (2005).</li>
<li>Rittschof, D., Clare, A. S., Gerhart, D. J., Sister Avelin, M., Bonaventura, J. Barnacle in vitro assays for biologically active substances: toxicity and settlement inhibition assays using mass cultured Balanus amphitrite amphitrite Darwin. Biofouling. 6 (2), 115-122 (1992).</li>
<li>Pansch, C., Schaub, I., Havenhand, J., Wahl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Habitat+traits+and+food+availability+determine+the+response+of+marine+invertebrates+to+ocean+acidification%5BTitle%5D)+AND+%22Global+Change+Biology%22%5BJournal%5D)">Habitat traits and food availability determine the response of marine invertebrates to ocean acidification.</a> Global Change Biology. 20 (3), 765-777 (2014).</li>
<li>Guillard, R. R. L. Culture of phytoplankton for feeding marine invertebrates. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGuillard%2C+RRL+%22Culture+of+marine+invertebrate+animals%22">Culture of marine invertebrate animals</a>. Smith, W. L., Chanley, M. H. , Springer. Boston, MA. 22-60 (1975).</li>
<li>Wrange, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+plasticity+and+local+adaptation+for+coping+with+changing+salinity+in+coastal+areas%3A+a+test+case+with+barnacles+in+the+Baltic+Sea%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Evolutionary+Biology%22%5BJournal%5D)">Importance of plasticity and local adaptation for coping with changing salinity in coastal areas: a test case with barnacles in the Baltic Sea.</a> BMC Evolutionary Biology. 14, 156(2014).</li>
<li>Bacchetti De Gregoris, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+an+adult+barnacle+%28Balanus+amphitrite%29+cDNA+library+and+selection+of+reference+genes+for+quantitative+RT-PCR+studies%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Construction of an adult barnacle (Balanus amphitrite) cDNA library and selection of reference genes for quantitative RT-PCR studies.</a> BMC Molecular Biology. 10, 62(2009).</li>
<li>Winnebeck, E. C., Millar, C. D., Warman, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+does+insect+RNA+look+degraded%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Why does insect RNA look degraded.</a> Journal of Insect Science. 10, 159(2010).</li>
<li>Panova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+extraction+protocols+for+whole-genome+sequencing+in+marine+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+BIology%22%5BJournal%5D)">DNA extraction protocols for whole-genome sequencing in marine organisms.</a> Methods in Molecular BIology. 1452, 13-44 (2016).</li>
<li>Berglin, M., Larsson, A., Jonsson, P., Paul Gatenholm, P. <a target="_blank" href="https://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1163/156856101753213321">The adhesion of the barnacle, Balanus improvisus, to poly(dimethylsiloxane) fouling-release coatings and poly(methyl methacrylate) panels: the effect of barnacle size on strength and failure mode.</a> Journal of Adhesion Science and Technology. 15, 1485-1502 (2001).</li>
<li>Larsson, A. I., Granhag, L. M., Jonsson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Instantaneous+flow+structures+and+opportunities+for+larval+settlement%3A+barnacle+larvae+swim+to+settle%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Instantaneous flow structures and opportunities for larval settlement: barnacle larvae swim to settle.</a> PLoS ONE. 11, 0158957(2016).</li>
<li>Toth, G. B., Lindeborg, M. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/237075903_Water-soluble_compounds_from_the_breadcrumb_sponge_Halichondria_panicea_deter_attachment_of_the_barnacle_Balanus_improvisus">Water-soluble compounds from the breadcrumb sponge Halichondria panicea. deter attachment of the barnacle Balanus improvisus.</a> Marine Ecology Progress Series. 354, 125-132 (2008).</li>
<li>Pansch, C., Jonsson, P. R., Berglin, M., Pinori, E., Wrange, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+flow-through+bioassay+for+testing+low-emission+antifouling+coatings%5BTitle%5D)+AND+%22Biofouling%22%5BJournal%5D)">A new flow-through bioassay for testing low-emission antifouling coatings.</a> Biofouling. 33 (8), 613-623 (2017).</li>
<li>Walne, P. <a target="_blank" href="https://www.cambridge.org/core/journals/journal-of-the-marine-biological-association-of-the-united-kingdom/article/observations-on-the-food-value-of-seven-species-of-algae-to-the-larvae-of-ostrea-edulis-i-feeding-experiments/11A8912C69162E0203BFC4079CD28070">Observation of food value of 7 species of algae to larvae of Ostrea edulis 1. Feeding experiments.</a> Journal of the Marine Biological Associateion of the UK. 43, 767-784 (1963).</li>
<li>Sandnes, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+and+automatic+density+control+of+large-scale+microalgal+cultures+using+near+infrared+%28NIR%29+optical+density+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring and automatic density control of large-scale microalgal cultures using near infrared (NIR) optical density sensors.</a> Journal of Biotechnology. 122 (2), 209-215 (2006).</li>
<li>Neufeldt, C. J., Palmer, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precisely+proportioned%3A+intertidal+barnacles+alter+penis+form+to+suit+coastal+wave+action%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+B+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Precisely proportioned: intertidal barnacles alter penis form to suit coastal wave action.</a> Proceedings of the Royal Society B Biological Sciences. 275, 1081-1087 (2008).</li>
<li>Dunstan, G., Volkman, J., Barrett, S., Leroi, J., Jeffrey, S. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0031942200905259">Essential polyunsaturated fatty acids from 14 species of diatom (Bacillariophyceae).</a> Phytochemistry. 35, 155-161 (1994).</li>
<li>Jonsson, P. R., Berntsson, K., André, C., Wängberg, S. -Å <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s002270050571">Larval growth and settlement of the European oyster (Ostrea edulis) as a function of food quality measured as fatty acid composition.</a> Marine Biology. 134 (3), 559-570 (1999).</li>
<li>Comps, M., Bonami, J. R., Vago, C. <a target="_blank" href="http://agris.fao.org/agris-search/search.do?recordID=FR19770139223">Virus-disease of Portuguese oyster (Crassostrea angulata. lmk).</a> Comptes rendus hebdomadaires des séances de l'Académie des Sciences. Série D, Sciences naturelles. 282, 1991-1993 (1976).</li>
<li>Segarra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+description+of+a+particular+Ostreid+herpesvirus.+1+genotype+associated+with+massive+mortality+outbreaks+of+Pacific+oysters%2C+Crassostrea+gigas%2C+in+France+in+2008%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Research%22%5BJournal%5D)">Detection and description of a particular Ostreid herpesvirus. 1 genotype associated with massive mortality outbreaks of Pacific oysters, Crassostrea gigas, in France in 2008.</a> Virus Research. 153 (1), 92-99 (2010).</li>
<li>Suquet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival%2C+growth+and+reproduction+of+cryopreserved+larvae+from+a+marine+invertebrate%2C+the+Pacific+oyster+%28Crassostrea+gigas%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Survival, growth and reproduction of cryopreserved larvae from a marine invertebrate, the Pacific oyster (Crassostrea gigas).</a> PLoS ONE. 9 (4), 93486(2014).</li>
<li>Martínez-Páramo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryobanking+of+aquatic+species%5BTitle%5D)+AND+%22Aquaculture%22%5BJournal%5D)">Cryobanking of aquatic species.</a> Aquaculture. 472, 156-177 (2017).</li>
<li>Anil, A. C., Tulaskar, A. S., Khandeparkar, D. C., Wagh, A. B. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0011224096919914">Cryopreservation of Balanus amphitrite nauplii.</a> Cryobiology. 34, 131-140 (1997).</li>
<li>Oo, K., et al. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/288595251_Cryopreservation_of_Nauplius_Larvae_of_the_Barnacle_Balanus_amphitrite_Darwin">Cryopreservation of nauplius larvae of the barnacle, Balanus amphitrite Darwin.</a> Fisheries Science. 64, 857-860 (1998).</li>
<li>Lin, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+study+on+gene+expression+of+cement+proteins+and+potential+adhesion-related+genes+of+a+membranous-based+barnacle+as+revealed+from+next-generation+sequencing+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Biofouling%22%5BJournal%5D)">First study on gene expression of cement proteins and potential adhesion-related genes of a membranous-based barnacle as revealed from next-generation sequencing technology.</a> Biofouling. 30 (2), 169-181 (2014).</li>
</ol>

המחברים יש ריהצהל.

התרבות ספחת-מעבדת המחקר הימי Tjärnö (שוודיה) פועל למעלה מ-20 שנה, שימש במשך מחקרים בתחומים רבים של מחקר שונים. מעל 30 מאמרים מדעיים פורסמו אשר נעזרו מערכת culturing במהלך השנים האחרונות, כולל מחקרים antifouling13,22, הידרודינמיקה23, אקולוגיה כימית24, האקלים שינוי16 , ביולוגיה אבולוציונית5וביולוגיה מולקולרית2.
כדי למנוע את הבחירה של אנשים מסוימים, כי הם יותר מתאימים לסביבת מעבדה (יחידים כי לא יכול להיות נציג של האוכלוסייה פראי), מומלץ לאסוף broodstock חדש מן השדה בכל שנה. בנוסף, זה גם תרגול טוב כדי להצעיר את התרבות מדי שנה, מאז יש בערך 50-80 אחוז התמותה בקרב מבוגרים במהלך שנה רגילה. עם זאת, אם המטרה היא לייצר קווים המפגרים או להגדיר לימודי האבולוציה ניסיוני, המשפחות גדלו-מעבדה בלבד הם כדי לשמש.
זמן טוב לאסוף improvisus דרב על לוחות במעבדת המחקר הימי Tjärnö הוא יוני – אוגוסט כי באותו הזמן, יש לאספקה טובה של הזחלים cyprid בים. בדיקת הלוחות פעם בשבוע כדי לראות מתי מתחיל ההתנחלות ספחת להסיר באופן ידני את השני התיישבו מינים מאשר improvisus דרב (למשל, מולים, tunicates, bryozoans, hydroids, nemerteans/tubeworms ו מינים אחרים ספחת) לוחות (למשל, עם מברשת שיניים). סביב Tjärnö, יש שלושה מינים במים רדודים ספחת הנוכחי (נולד ב- improvisus, Semibalanus balanoidesו Balanus crenatus). אולם, improvisus דרב הוא הדומיננטי הדחוס של חלק משטחים קשים במהלך יולי-אוגוסט. ס balanoides יש תקופת ההתנחלות שלו במהלך האביב המוקדם, מעדיף בעיקר טבעיים מצעים (למשל, אבנים). Crenatus דרב יכול להתרחש בכל המספרים הנמוכים על הלוחות במהלך הקיץ.
זה גם אפשר להתחיל הדורות ספחת למבוגרים cyprids בתרבית, אשר יהיה חיוני אם הוקמו מסוימים linages עם תכונות מיוחדות, או לימודי האבולוציה ניסיוני. הדרך הנוחה ביותר להתחיל דורות חדשים של מבוגרים הוא להתיישב cyprids על לוחות תרמופלסטיים במעבדה. לוחות אלה עם cyprids החדש שיוחסו יכול לשמש גם ניסיוני טיפולים או חשיפה בשטח. במקרים חירום, ניתן גם להשתמש מבוגרים על סלעים מאתר הסמוך (למשל, Idefjorden במקרה של המעבדה לחקר Tjärnö ימיים) איפה improvisus דרב נפוץ. מבוגרים שכבר פועלת אלה מטופלים באותו אופן כמו המבוגרים על הלוחות, ובכך להציב מגשים, מוזן דרך הזרימה דרך המערכת. תאים זרימה יכולה לשמש גם כדי ליצור לוחות עם ספחות25. אלה הם תאי זרימה דרך עם פלנקטון נטו על הצדדים בו cyprids אל תתפשר, עם פאנלים כמו פני השטח הישוב היחיד עבור הזחלים.
ישנם מספר שלבים הם קריטיים עבור הגדרת תרבות ספחת ארוכת טווח תפקוד כולל בכל שלבי החיים. בין השיטות התרבות דרב improvisus הם כנראה, במידה רבה, חלים גם על אחרים חסרי חוליות ימיים עם הזחלים planktotrophic free-swimming. נהלים culturing עבור מינים מסוימים הם כבר היטב תיאר (למשל, מולים כחולים, מינים שונים של צדפות)26, בעוד שלגבי שאר החוליות, ישנן רק כמה דוגמאות של תרבויות ארוכת טווח הנמשכים כל חייהם מחזור. אחד מהניסיונות המוצלחת הראשונה ספחות תרבות (נולד ב אמפיטריטה) בוצע על ידי. Rittschof et al. 15. משאבים אישיים ופיננסיים לטווח ארוך צריכה להיות במקום לפני בהתחשב הגדרה ספחת culturing מתקן. שמירה על סוג זה של השנה-סביב ספחת תרבות דורש אחד לפחות אדם לעבוד בחצי משרה. ייתכנו כמה פוטנציאל עתידי אוטומציה של כמה צעדים קו הייצור, בעיקר culturing microalgae27. בנוסף, כדי להצליח, זה חיוני כדי ש- access כדי כמויות גדולות של מי ים באיכות גבוהה. Culturing microalgae, Artemia, ו ספחות אינו כרוך כל נהלי בטיחות מסוים. עם זאת, בדיקות של כמה חומרים antifouling או כימיקלים רעילים, ייתכן שיהיה עליך באמצעי זהירות מיוחדים.
הלוחות נבדק מספר פעמים בשבוע עבור מציג. מי ים המשמשים את התרבות היה נרגש מן לעומק 40 מ' ב הפיורד Koster מחוץ למעבדה המחקר הימי Tjärnö, היה עבר שני מסננים חול לפני כניסתו למערכת המים במעבדה. אם אין סינון המים נעשה, יהיו הרבה יותר זיהום בתרבות. זה חיוני לנקות באופן קבוע הלוחות בתרבות דטריטי, פרוקי רגליים אחרים (למשל, בניית stolon hydroids ו- nemerteans טורפים) מזין את המערכת דרך אספקת מי ים מן השדה. לדוגמה, אם אין הזחלים מיוצרים למרות העובדה כי התרבות כבר מוזן היטב, אחרת נראה במצב טוב, ייתכן שהבעיה הנוכחות של nemerteans שמופיעים כדי לעכב את ההזדווגות. באופן טבעי, הרבה אורגניזמים מזהמים בתרבות במעבדת המחקר הימי Tjärnö היו ספציפיות עבור החוף המערבי שבדי ולאחר סוגים אחרים של מזהם אורגניזמים להיות שכיחה יותר אתגר באזורים גיאוגרפיים אחרים. בחוף המערבי של שבדיה, זה נדיר למצוא זיהום על ידי מינים אחרים ספחת על הלוחות. לעיתים, הקמת balanoides ס נמצאה, אך זוהי בעיה שולית מאוד (לכל היותר, אחד ס' balanoides מזהם עבור דגימות improvisus נולד ב- 10,000). העדר מזהמות מינים הייתה תלויה ככל הנראה המשטר להקים תרבויות חדשות במהלך הקיץ, כאשר larvaefrom improvisus נולד ב- היו מאוד דומיננטי. בנוסף, היה גם העשרה ברורה של improvisus דרב על הלוחות מאז שהמין הזה הוא סלקטיבי עבור משטחים חלקים13.
זה חיוני כדי להסיר ספחות מת למבוגרים. אם התרמילים הריקים השאיר על הלוחות, הם יכולים להפוך מקלט הן הדברים Artemia כמו גם עבור מינים מזהמים שונים. בנוסף, כבר הבחין כי אנשים מתים להשפיע לרווחתם של השכנה יחידים, כנראה עם שחרורו של תרכובות רעילים במהלך הפירוק. תוצאה נוספת של התמותה למבוגרים הוא כי אנשים מסוימים יישארו לבד, רחוק מדי ממבוגרים אחרים כדי לאפשר הזדווגות (למרות ספחות יש את הפין הארוך ביותר בעולם החי ביחס לגודלו)28. אנשים אלה ישרדו, אבל הם לא פרודוקטיביים עבור הזחלים. עם זאת, אלה אנשים מבוגרים בודד ניתן להסיר בעדינות מבלי לפגוע במשטח הבסיס, להיות ממוקמים בצורה אופקית קרוב אחרים כדי לאפשר הזדווגות. ספחות גם יכול להיות הזדווגו על ידי הנחת לוחות עם מבוגר אחד על אחד, אבל מספיק קרוב כך הפרייה יכול להתרחש. בדרך זו, קווים גנטיים יכול להיות מיוצר14.
זה חיוני כדי לייצר שידור באיכות גבוהה, להאכיל תרבויות כמעט כל יום. אפילו כמה ימים ללא מזון עלולה לגרום לשחרור יורדת של הזחלים. בדיקות קודמות של דיאטה קומפוזיציה הראו כי diatoms הם חיוניים עבור הצמיחה ואת ההישרדות של הדברים ספחת. מספר מינים צורניות נראה הולם כמו הזנה, למרות תאים קטנים או יחידי (פחות מ- 10 מיקרומטר בקוטר) יהיה צורך הבליעה של הדברים. המין marinoi ס, ג סימפלקסו pseudonana ט כל הוכיחו להיות הזנה הולמת עבור הדברים improvisus דרב , כמו גם קל לטפח. בנוסף, איכות המזון היא בדרך כלל גבוה יותר עבור שמתקדמות אצות. גם דווח כי diatoms הם חיוניים עבור הקמת תרבויות פרודוקטיבי אמפיטריטה ב15. תיאוריה על החשיבות של diatoms הוא שהם יש פרופיל חומצת שומן ייחודית, הם עשירים במיוחד חומצות שומן רב בלתי רווי מאוד 20:529. הוכח כי מסוימים חומצות שומן חשובים להתפתחות מוצלחת של הצדפה הזחלים30.
במהלך השנים, היו אין מקרים של מחלות מזיקה בתרבות ספחת. Aquacultures הגעה מסחריים רבים, כמו צדפות ומולים, מחלות נפוצות למדי, שעשויות להזיק מאוד. השפעות מזיקות של וירוסים דווחו גם של אוכלוסיות בר. הצדפה יליד צרפת הוחלף הצדפה פורטוגזית Crassostrea angulata בשנת 1925, אך מין זה נמחתה iridovirus סביב 197031. לאחרונה, היו אירועי תמותה מסיבית בתוך הצדפה פסיפיק Crassostrea גיגס בתרבויות ברחבי העולם, אשר מופיע לשייך ההרפס 1 ostreid32. אין דיווחים על פתוגנים, חיידקים או וירוסים על ספחות פורסמו עד כה. עם זאת, בפרוייקט מתמשך הגנום-על improvisus דרב, וירוס רצפים נמצאו (Alm Rosenblad. et al., נתונים שלא פורסמו) אבל עם אין קשר לכאורה סימפטומים של מחלות. תערובות של אנטיביוטיקה בעבר הוחלו על התרבויות כדי למזער את הסיכון לזיהומים חיידקיים; עם זאת, ההליך שנמצאת כרגע נטושה, עד כה, זה לא יצרה בעיות זיהום.
אם מי ים מחומם (כמתואר לעיל), התחממות יתר ייתכן הסכנה החמורה ביותר בתוך פס הייצור תרבות. קשה, כמובן, כאמצעי הגנה נגד התחממות יתר, למרות חיישנים ומערכות התראה מתאימה עשוי להיות בשימוש (לדוגמה, לשלוח דואר אלקטרוני והודעות טקסט אנשים אחראים). מקרים מסוג זה בעבר גרמו ההרג משמעותי של מבוגרים בתרבות. זה ניתן, כמובן, להיות הרסנית, להרוס בהשקעות לטווח ארוך של זמן וכסף. בפרט, זה יהיה אסון אם נקבעו קווים גנטיים המפגרים. כדי להבטיח את תוחלת החיים של קווים אלה ולאבטח אותם מפני אובדן מקרי, רצוי לפתח מתודולוגיה הקפאה קריוגנית ספחות. בעבר דווח כי הזחלים הצדפה השקט יכול להיות קפוא למטה, קמה לתחייה עם הצלחה חלקית33. Cryobanking היה גם כלי חשוב כדי לשמר משאבים גנטי של מגוון רחב של מינים34. הדברים אפילו מב' אמפיטריטה מדווחים לשרוד מקפיא35, נמצא כי 20% של האנשים למטה קפואה בהצלחה כשהתבוננה לתוך cyprids36. עם זאת, החלת הקפאה להישרדותם לטווח ארוך של תרבויות כה לא אומץ, אבל זה אכן יהיה נחוץ לשם קיום השורות שנבחרו; זה יהיה צעד חיוני לביסוס improvisus דרב בחוזקה לתוך modelsystem ימיים חזק.
. הנה, פרוטוקול הוצג רוברט של רקמות שונות מן הבוגרים של improvisus דרב (קריcirri, סומה, האח). עם זאת, יש להדגיש כי גם ניתן לחילוץ לרקמות אחרות. למשל, הרקמות הרכות בין המעטפת חיצוניים ופנימיים של המינים עלי הלוואי קרומיים בסיס Tetraclita חבוש יפני formosana יש כבר בקפידה מבודד ולא להשתמש בו עבור החילוץ-RNA וגם RNA-seq ניתוח של ביטוי גנים37. פרוטוקול מיצוי מיטבי מחולקת לרמות המתוארים כאן מספק כמויות מספיקות של RNA באיכות גבוהה עבור רצף של כמות מזערית של הפעלת חומר. ראשית, האוסף של הזחלים בודדים ישירות לתוך הצינורות המגון ממזער אובדן במהלך ההעברה של שפופרת אחת לאחרת. יתר על כן, בין השיטות השונות שנבדקו, את המגון עם חרוזי קרמיקה התבררה תשואות היעילה ביותר מבחינת RNA ויושר, בהשוואה המגון sonication או במכתש ועלי. בעת תכנון גנים או גנומיקה ניסויים, יש לזכור את האתגר של וריאציה גנטית גבוהה ספחות, לפחות עבור improvisus דרב. זיפרגליים יש מגוון גנטי בטווח של 3-5%, אפילו בקידוד אזורי (Alm Rosenblad. et al., נתונים שלא פורסמו). זה, כמובן, מעמיד והדרישות הספציפיות על העיצוב של צבעי בסיס לניתוח qPCR, שם יותר והתפאורה אזורים צריך להיות מזוהה ומשמש תבניות עבור תחל כדי לקבל ביטוי עקבי תוצאות betweenbatches. אזורים שנשמרת עבור היעד גנים, כמו aquaporins ו- Na + / K + ATPases, יכול להיות מזוהה על ידי לימוד ההשתנות רצף של גנים אלה ב- RNA-seq והנתונים שהתקבלו אוכלוסיות של cyprids המכילה מאות אנשים. עבור ניתוח הגנום, DNA ניתן לטעום. עם זאת, השגת DNA באיכות גבוהה מ- improvisus דרב עשויה להיות מאתגרת21.
לסיכום, התרבות ספחת מבוססים הוכיחה להיות אינסטרומנטלי סוגים שונים של מחקרים ניסיוניים. בפרט, ההפקה השנה-סביב כל זחל מאפשרת לנו לערוך ניסויים בלי להיות מוגבל לתקופה ההשרצה המתרחשים באופן טבעי (עבור improvisus דרב, מדובר במהלך הקיץ). הזחלים שהושג יכול לשמש כדי לבצע מערכת רחבה של מחקרים ניסיוניים, כולל מבחני ההתנחלות, מבחני התנהגות, ביטוי מחקרים על גנים ספציפיים, כמו גם מחקרים transcriptome הגנום כולו.

ספחות הם סרטנים ימיים עם מבוגר sessile free-swimming, פלנקטוניים הזחלים. רוב המינים 1,200 של ספחות המאכלסים במים רדודים, רבים נחשפים לעיתים קרובות מליחות נמוכה. מין אחד, ספחת המפרץ נורא Balanus (Amphibalanus) (נולד ב- improvisus), יכול לסבול כמעט מים מתוקים, צ'ארלס דרווין תיאר זן זה של נחל קטן בשפך של ריו דה לה פלטה אורוגוואי1. המליחות tolow סובלנות קיצוני הופך improvisus דרב מודל רלוונטיים במיוחד עבור הלימודים של מנגנונים osmoregulatory2,3. זיפרגליים הזה מעדיף תנאים מליחים אבל מסוגלת לחיות במים עם salinities של כח בסביבות 1.6 ל גבוה כמו כח 404. זה המין היחיד ספחת שנמצאו בים הבלטי מליחים. Improvisus ב' מאמינים שמקורם בחוף המזרחי של יבשת אמריקה אך היום נמצא ברחבי העולם עקב פיזור על ידי משלוח5. זה הוא יצור fouling הגדולות, נפוץ על סלעים, המזחים הסירה קליפות, ולכן הוא עניין כללי להבנת המנגנונים של ביופילמים על מבנים ימיים, מליחים מים6,7.
בדומה לרוב ספחות אחרים, improvisus דרב הוא אנדרוגיניות עם הפרייה; רבייה מתרחשת באמצעות הזדווגות בין יחידים שכנות באמצעות של הפין מוארך, הפריה פנימית. תקופת הרבייה היא בעיקר ממאי עד ספטמבר. Improvisus דרב יש שבעה שלבים זחל פלאגי (6 הדברים ואחריו cyprid אחד שלב8). הפתחים הביצית המופרית אל זחל nauplius free-swimming ואינה ניזונה עמודת המים עבור עד מספר שבועות לפני משיר אל זחל cyprid שאינם האכלה. Cyprid משתמשת מספר רמזים כדי למצוא אתר מתאים להתיישב, ואז עובר מטמורפוזה לתוך ספחת לנוער sessile9. המין יכול להיות בתרבית במעבדה, יש תוחלת חיים של 1 – 2 שנים בים (2 – 3 שנים בתרבות מעבדה). בממוצע, נולד ב- improvisus גדל עד 10 מ מ קוטר (עם מספר מרבי של 20 מ מ), מגיע לגובה מרבי של-6 מ מ (למרות שזה יכול לגדול גבוה בתנאים צפופים). המין יכול להיות מזוהה על ידי חלקה גירני אפילו קונכייתו (לבן או אפרפר), הבסיס גירני בדוגמת בצורה רדיאלית של צלחת מעטפת, צורת לוחות tergal1,10.
שברת את improvisus נולד ב- כולל מספר תכונות יתרון כמודל עבור מחקרים של osmoregulation, עם דגש על מנגנונים פיזיולוגיים המולקולריים וכן אינטראקציות אקולוגי והשלכות אבולוציונית. הוא גם משמש כמודל עבור החקירות ליישב בביולוגיה, במיוחד ביחס antifouling ומחקר של המנגנונים המעורבים7,11,12,13. עם זאת, ההשרצה עונתיים טבעי מניב אטומטי בלתי צפוי של הזחלים cyprid ללימודים. היכולת תרבות זו ספחת דרך מחזור החיים שלו כל כל השנה היא, לכן, נכס גדול כדי לאפשר סוגים שונים של מחקרים מכניסטית המולקולריים. בנוסף, נוכחותו במים מליחים/ים ברחבי העולם מאפשר שילוב של שדה ומחקרים ניסיוני. גידול מבוקר גם להפיק משפחות של שושלות יוחסין ידוע culturing לטווח ארוך14, זמן דור של כמה חודשים עשויה לאפשר התפתחות ניסיוני לטווח ארוך. שם זמין גם הגנום טיוטה, transcriptomes מספר, המשאבים הללו שימשו עבור השיבוט של גנים (למשל, גנים חשיבות osmoregulation) מספר2,3.
המטרה של פרוטוקול זה היא לתאר כיצד להקים ולתחזק תרבות של הכינוי נולד ב- improvisus לאורך כל השנה על מנת לבצע מחקרים ביטוי הגן על מבוגרים או הזחלים של האורגניזם. . Rittschof et al. 15 מתוארות בקצרה שיטה culturing ספחות מן המהדורה של הדברים להתנחלות של cyprids עבור המין אמפיטריטה Balanus. הפרוטוקול היה מותאם culturing בכל ימות השנה של improvisus דרב -מעבדת המחקר הימי Tjärnö (שוודיה), תיאור מפורט של כל השלבים בתוך פס הייצור המותווה, כולל את הייצור והגידול של ספחת הזחלים, כמו גם הממשל של הזנה הזחלים ולמבוגרים. לקבלת סקירה כללית של ההליך מלאה, ראה איור 1. השימוש במערכת culturing ביטוי עם קצת קופצים ניסיוני משותף, מאויר במחקרים גנומיקה תפקודית של Na+/K+ ATPase, aquaporins, שחקרתי שלהם פונקציות אפשריות osmoregulation2, 3. זה לפעמים חיוני כדי לבחון את ביטוי גנים ספציפיים ברקמות, כמה עקרונות הבסיסיים של ספחת ביתור יהיה מכוסה. אספקה טובה של מי ים באיכות גבוהה, culturing ה"בארנקל improvisus דרב, שעשוי להיות מינים נוספים רבים, צריך להיות אפשרי במעבדות ימית ברחבי העולם.

<table><tbody><tr><td>לוחות פרספקס (פולי-מתיל מתאקרילט) פלסטיק</td><td>פרודוקטר, ברומה, שוודיה</td><td></td><td>זכוכית שקופה</td></tr><tr><td>1.5 ליטר בקבוק</td><td></td><td></td><td></td>PET</tr><tr><td>Artemia</td><td>INVE Aquaculture, בלגיה</td><td></td><td>בדקנו חברות שונות; זה באמת הטוב ביותר</td></tr><tr><td>Skeletonema marinoi (זן CCAP 1077/5)</td><td>CCAP (אוסף תרבית של אצות ופרוטוזואה); סקוטלנד&nbsp;</td><td>זן 1077/5</td><td></td></tr><tr><td>Chaetoceros simplex var. gracilis (זן CCAP 1085/3)</td><td>CCAP (אוסף תרבית של אצות ופרוטוזואה); סקוטלנד&nbsp;</td><td>מתח 1085/3</td><td></td></tr><tr><td>מערכת מסנן מחסנית Millipore</td><td>Millipore&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מחסנית בגודל נקבוביות נומינלי של 0.2 ומיקרו; מ</td><td>Millipore&nbsp;</td><td>מחסנית CWSS01S03</td><td>קיבולת גבוהה לנפחים גדולים</td></tr><tr><td>בקבוק פוליקרבונט</td><td>Nalgene</td><td></td><td>RNA חיטוי</td></tr><tr><td>מאוחר יותר</td><td>Qiagen</td><td>76106</td><td>&nbsp; פתרון קיבוע לשימור ערכת RNA</td></tr><tr><td>TURBO DNA-FREE</td><td>Invitrogen/Thermofisher Scientific&nbsp; &nbsp;</td><td>ערכת AM1907</td><td>DNAse להסרת DNA מ-RNA מוכן</td></tr><tr><td>ערכת סינתזה של RNA iScript cDNA ערכת סינתזה</td><td>של Biorad</td><td></td><td>1708890-cDNA</td></tr><tr><td>SYBR Green supermix</td><td>Biorad</td><td>1708880</td><td>Dye ל-QPCR</td></tr><tr><td>RNeasy minikit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>מיצוי RNA של מבוגרים או ציפרידים רבים</td></tr><tr><td>הומוגניזציה של רקמות רכות CK 14, צינורות 2 מ"ל</td><td>Precellys</td><td>KT03961-1-003.2</td><td>חרוזי קרמיקה להומוגניזציה</td></tr><tr><td>ערכת מיקרו RNeasy</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td>מיצוי RNA של כמה ציפרידים</td></tr></tbody></table>

זיפרגליים balanus improvisus כמודל ימית - culturing, ביטוי גנים

The Barnacle Balanus improvisus as a Marine Model - Culturing and Gene Expression

ספחות הם סרטנים ימיים עם מבוגר sessile free-swimming, פלנקטוניים הזחלים. הכינוי Balanus (Amphibalanus) improvisus היא רלוונטית במיוחד כמודל עבור הלימודים של מנגנונים osmoregulatory שלה עמידות קיצוניים בפני מליחות נמוכה. הוא גם משמש כמודל ליישוב בביולוגיה, במיוחד ביחס antifouling מחקר. עם זאת, ההשרצה עונתיים טבעי מניב אטומטי בלתי צפוי של הזחלים cyprid ללימודים. פרוטוקול culturing בכל ימות השנה של improvisus דרב פותחה, תיאור מפורט של כל השלבים בתוך פס הייצור המותווה (כלומר, הממסד של תרבויות למבוגרים על לוחות, האוסף שלומות זיפרגליים הזחלים, הממשל של מזון עבור בוגרים וזחלים). התיאור מכיל הנחיות על פתרון בעיות ודן גם פרמטרים קריטיים (למשל, ההסרה של זיהום, הייצור של מזון באיכות גבוהה, את כוח האדם הדרוש, ואת החשיבות של מי ים באיכות גבוהה). כל אצווה ממערכת culturing מקסימאלית התשואות בערך 12,000 הדברים, יכול לספק לארבע אצוות בעוד שבוע, אז עד כמעט 50,000 רימות בשבוע יכול להיות מיוצר. השיטה המשמשת התרבות דרב improvisus הוא, כנראה, חלים גם על אחרים חסרי חוליות ימיים עם swimminglarvae חינם במידה רבה. פרוטוקולים מוצגים רוברט של רקמות שונות מבוגרים, כמו גם הייצור של RNA באיכות גבוהה עבור מחקרים על ביטוי גנים. הוא גם תיאר איך בתרבית מבוגרים, cyprids גדלו יכול להיות מנוצל במגוון רחב של עיצובים ניסיוני לבחינת ביטוי גנים ביחס גורמים חיצוניים. השימוש של ספחות בתרבית בביטוי הגנים מלווה באיורים מחקרים של תפקידים osmoregulatory אפשרי של Na+/K+ ATPase, aquaporins.

ההליך המתואר עבור culturing של ספחות למבוגרים של improvisus דרב, עד לארבע אצוות של nauplius הזחלים ניתן להפיק בכל שבוע. שזה יהיה אפשרי לאסוף את הזחלים nauplius כמעט כל לילה, אבל זה דורש יותר אנשים ותשתיות (עם ספחות רבים ב- broodstock, תרבות ישחרר הזחלים ברציפות). גורם מגביל נוסף לייצור הזחלים נראה הזמינות של הזנה באיכות גבוהה, בפרט בנוגע צורניות Skeletonema. מקסימאלית, כל אצווה ממערכת culturing מורכב הדברים בערך 12,000, כך עד 50,000 הדברים בשבוע יכול להיות בתרבית. עם זאת, כמה שבועות ייתכנו עד tenfold הזחלים פחות המיוצר. מבוגר אחד יכול לייצר עד 7,000 הזחלים לכל יום14, מה שאומר כי 1 – 2 מבוגרים משחררים הזחלים עבור כל אצווה. תוך שבוע, 70-90% הדברים שנאספו יתפתח cyprids (מניב בערך 30,000 cyprids בשבוע, מקסימאלית) יכול לשמש עבור מבחני ההתנחלות, במחקרים מולקולריים.
יודגש כי ישנן וריאציות cyprid תכונות בין אצוות, באופן כללי, ישנן וריאציות גדול יותר בין אצוות מאשר בתוך קבוצות. לדוגמה, הצלחת ההתיישבות מבחני שיקוע משתנה בין 30 ל- 70% עבור קבוצות שונות. סביר להניח, זה כתוצאה של וריאציה גנטית בין זוגות מסוימים של מבוגרים שחרור הזחלים בתקופות דגימה שונים. כמובן, מומלץ כי ניסויים חוזרים ונשנים (משכפל ביולוגי) צריך לכלול cyprids ממספר קבוצות אם הצהרות כלליות יותר על התוצאות להתבצע. וריאציית אצווה-כדי-אצווה מעמיד דרישות על הנבחנים, שבו פקדי תקין ו- normalizations במחקרים ביטוי גנים צריך להיות מיושם. אולם, גם לאחר מספר הליכים סטטיסטיים נורמליזציה יושמו זה להפחית במידה ניכרת בין-אצווה וריאציה, חלק מהאפקטים של אצוות בדרך כלל עדיין נראית לעין (נתונים שלא פורסמו).
בעקבות פרוטוקול שסופקו, זה ניתן להשיג, בממוצע, 500 ננוגרם של RNA באיכות גבוהה מ- cyprids קטנה כמו 20, ללא התחשבות השלב ההתיישבות ספחת (טבלה 1). איכות RNA נמדד בדרך כלל כיחס בין הפסגות 18S, 28S (המיקום הצפוי של שתי הפסגות הם הצביעו על איור 4). עם זאת, במקרה של ספחות ופרוקי רגליים רבים אחרים, rRNA 28S נשברת כאשר מחממים (כחלק שיטת הניתוח), נודד יחד עם שיא 18S20. זו הסיבה מדוע יש, באופן עקרוני, פסגה אחת rRNA יחיד בסוג זה של ניתוח של ספחות. ברור מן המבחן הזה (איור 4) כי המגון על ידי חרוזי קרמיקה מספק את הרנ א השלמות הגבוהה ביותר, היא, איפוא, שיטת הבחירה. הרנ א מספיקה הכמות והאיכות ליצירת ספריות רצף באיכות גבוהה עבור רצף, וכתוצאה מכך ממוצע של 70 מיליון קריאות עבור דגימה (מספר הקריאות, כמובן, תלוי ברמה של ריבוב במהלך הרצף). הכמות של RNA מספיקה גם עבור cDNA סינתזה qPCR ביטוי וניתוח של מספר רב של גנים.
איור 5 מראה התוצאה מניתוחי qPCR של aquaporins ושל Na+/K+ ATPase (NAK1) אחוי גרסאות, שבו נחקרו שינויים בביטוי בתגובה לשינויים רמזים סביבתיים2,3. השוואה של הביטוי היחסי של הארוך וקצר אחוי וריאציות של NAK1 מראה כפולה גידול עבור ה-mRNA NAK1 ארוך מליחות נמוכה ביחס NAK קצר (איור 5א). לפיכך, הנתונים מצביעים על כך שחבור חליפי הופכת את הטופס ארוך השולט בתנאי מליחות נמוכה. במקרה של aquaporins, ברור כי שני הובלת מים paralogs AQP1, AQP2 להציג ביטוי דיפרנציאלי (איור 5B). בפרט, בתוך רקמת מעטפת כדור הארץ, ברור כי AQP1 הוא משמעותי למטה מוסדר ב salinities נמוך, אשר לא נראה במשך AQP2. במקום זאת, AQP2 מראה ביטוי מוגבר מעט נמוכה יותר salinities, אבל בסומה. ממצאים אלה מספקים בסיס לחקירות של התפקידים פונקציונלי השונות מובילי יון נולד ב- improvisus ו- aquaporins ב osmoregulation ספחת.
<img alt="דיאגרמת מחזור חיים ימית: דגימת DNA/RNA, גידול נאופלי לציפרידים, תהליך התיישבות בוגרים." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57825/57825fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> איור 1 : סקירה של כל culturing הליך והפקת RNA ללימודי ביטוי גנים במבוגרים. ליזום תרבות חדשה, לוחות מחובר למסגרת, לפרוס בים ב 1-3 מ' עומק. לאחר מספר שבועות, הלוחות עם נוער/מבוגרים ממוקמים אנכית בארונות במגשים במעבדה. בכל מגש מחזיקה כ- 40 לוחות עם מבוגרים. עם מבוגרים בערך 100 לכל לוח, ≈ הכולל 4,000 אנשים מבוגרים הם בתרבית למגש. ספחות הבוגרים ניזונים מ- Artemia , יכול להישמר שנה-סביב. Nauplius הזחלים נאספים מספר פעמים בשבוע מ המגשים ויה סינון דרך מסננת. הדברים שנאספו מועברים דליים בטמפרטורה 26 ° C באמבט מים ולא נמאס microalgae. הדברים גדלים עד שהם הנשירה לתוך שאינם האכלה cyprids, אשר נאספו על-ידי סינון. לוחות חדשים יכול להתבסס במעבדה על שיקוע של cyprids על לוחות, גם כדי לספק פאנלים חדשים לשנה-סביב תרבות או שישמש עבור ספציפיים set-ups ניסיוני עם שינו תנאים חיצוניים. RNA ואז המופק נוער/מבוגרים בסוף הניסוי או בנקודות זמן מסוימות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57825/57825fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="ניסוי סינון מימי; שלבי ציוד ותהליך; מערך הפרדת משקעים; מחקר." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57825/57825fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> איור 2 : תמונות של כמה צעדים חשובים בהליך culturing. (א) תמונה זו מראה המסגרות עם לוחות לאיסוף אוכלוסיות חדשות מן השדה. (B) תמונה זו מציגה את הלוחות עם ספחות למבוגרים של improvisus דרב בארונות הממוקמות המגשים. הלוחות ממוקמים כ- 2 ס מ אחד מהשני. (ג) תמונה זו מציגה המגשים עם הכינוי פאנלים, הטנק האכלה משמאל. מ בכל מגש, אין פורקן היכן ממוקמים את הנפות של אוסף של הזחלים nauplius. (ד) תמונה זו מציגה שהייצור של Artemia feed ספחות למבוגרים. (E) תמונה זו מציגה גידול של הדברים בדליים מניחים באמבט מים מוגדר כ- 26 מעלות צלזיוס. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57825/57825fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="דיאגרמת אנטומיה של ברנקל; לוחות אופרקולריים, מעטפת, פרטי גוף; מחקר ביולוגי." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57825/57825fig3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> איור 3 : תיאור של המדרגות ניתוח ראשוני של ספחות למבוגרים: הסרת בגוף מהשריון שלו. (א) לתפוס אחד הלוחות opercular על-ידי הוספת מלקחיים בעדינות דרך הפתח. משוך בעדינות כדי להסיר את הצלחת ולחשוף את החיה. (B) לעקור החיה על ידי גרירה החלק סומא מתחת cirri. (ג) לוח זה מראה את האנטומיה הכוללת של ספחות בלוט. מנטל וביצים שעשויות להיות מופרית (בשחלה) לשהות בחלל מעטפת כאשר הגופה תיפלט. פתק על אנטומיה ספחת (על חשבון מעמיק יותר, ראו אנדרסון)9: צלחות קיר ספחת שיפוע פנימה ולאחר, וביחד הם יוצרים קונוס כמו הר געש. פתיחה, הצמצם, מכוסה על ידי שתי צלחות opercular, המהווים דלת, או operculum, כדי לסגור את הצמצם. בלוט ספחות בדרך כלל יש צלחת הבסיס גירני מודבקים בחוזקה תשתית; עם זאת, מינים מסוימים של ספחות חוסר הצלחת גירני הזו (למשל, ס' balanoides). ספחות מפרישים שלד חיצוני מן המעטפת בקדרות פיגמנט (השריון). המשטח החיצוני של המעטפת שכבות כפול התקשחה להיות נוקשה, ואילו השטח הפנימי של המעטפת לא התקשחה ולכן גמיש. בתוך הפתח, cirri נמצאים בעמדה שקועה. אלו הן תוספות בית החזה ספחות להשתמש עבור השעיה האכלה. השחלות ממוקמים סמוך הבסיס של הכינוי, ואילו האשכים נעוץ של סומא. איור זה אומץ מ. Panova et al. 21 , שפורסם באישור שפרינגר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57825/57825fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="גרף זמן פלואורסצנטי לעומת עוצמה, ניתוח נתונים של שיאי פליטה, מחקר ספקטרוסקופי." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57825/57825fig4.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> איור 4 : נחישות של rRNA שלמות על ידי אלקטרופורזה בג'ל נימי. RNA הוכן על ידי שתי שיטות שונות המגון: (א) sonication וחרוזים קרמיקה (B). יחידת בציר ה-y, פו, עומד על יחידות קרינה פלואורסצנטית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57825/57825fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="תרשימי עמודות המשווים מליחות, השפעות pCO₂ על ביטוי NKA-L1/NAK-S; ביטוי אקוופורין ברקמות." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57825/57825fig5.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> איור 5 : ביטוי גנים תוצאות שני מחקרים שונים של גנים חשוב osmoregulation ב נולד ב- improvisus. (א) לוח זה מראה את הביטוי דיפרנציאלית כפי שהוא נמדד qPCR של משתנים אחוי של Na+/K+ ATPase NAK1 בתגובה salinities השונות pCO2 רמות3. בטיפול מליחות נמוכה, הביטוי isoform ארוך (NAK1-L) הוא גדל יחסית הקצר (ANOVA, P &lt; 0.001). (B) לוח זה מראה את הביטוי של aquaporins אצל מבוגרים improvisus דרב של במהלך החשיפה שלהם salinities שונים2. qPCR נעשה שימוש כדי לקבוע את רמות ביטוי aquaporin ביחס אקטין. אנשים מבוגרים היו מתפשט-3 salinities שונים (3, 20, 33 PSU) למשך 14 ימים. לשם הכנת RNA, הופרדו סומא, cirri, קרנה של המבוגרים. בשתי דמויות, קווי שגיאה מציינות סטיית התקן. * * ו * * * מצביעים על החשיבות של רמה (ANOVA), 0.01 ו- 0.001, בהתאמה. הדמויות שונו מ לינד. et al. 2 , 3. הדמויות הן מפורסמים באישור PLoS ONE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57825/57825fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>שלב ההתיישבות</td>
			<td>הסכום הכולל של RNA (ng)</td>
		</tr>
<tr>
<td>שחייה חינם</td>
			<td>512</td>
		</tr>
<tr>
<td>חקר: חיפוש קרובים</td>
			<td>518</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cyprid המצורפת</td>
			<td>550</td>
		</tr>
<tr>
<td>לאחרונה כשהתבוננה לנוער</td>
			<td>832</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: התשואות של רנ א. טבלה זו מציגה את הכמות ה-RNA חילוץ עם ערכת הכנה RNA מתוך בריכות של 20 אנשים cyprid שנאספו בשלבים שונים במהלך תהליך ההתנחלות.

שברת את improvisus Balanus (Amphibalanus) היא דוגמנית ללמוד osmoregulation ו- antifouling. עם זאת, ההשרצה עונתיים טבעי מניב אטומטי בלתי צפוי של הזחלים cyprid. כאן, עבור culturing בכל ימות השנה של improvisus דרב פרוטוקול המתואר, כולל הייצור של הזחלים. השימוש של ספחות בתרבית במחקרים ביטוי גנים מודגם.

זיפרגליים Balanus improvisus כמודל ימית - Culturing, ביטוי גנים

Barnacles are marine crustaceans with a sessile adult and free-swimming, planktonic larvae. The barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus is particularly ...

מתקן התרבות יכול לעזור לענות על שאלות מפתח באקולוגיה של זחלים, ביו-פאולינג וביולוגיה אבולוציונית. ליתר דיוק, ניתן להשתמש בו במחקרים על אינטראקציות קולטן-ליגנד במהלך התיישבות הזחלים, פיתוח טכנולוגיות חדשות נגד עכירות והאבולוציה והתפקוד של גנים המעורבים בוויסות אוסמו. היתרון העיקרי של אורגניזם מודל זה הוא שהברנקל Balanus improvisus הוא חזק, מתרבה כל השנה ובעל זמן דור קצר יחסית.למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי גידול ברנקלים, ניתן ליישם אותה גם על גידול אורגניזמים ימיים אחרים. בדרך כלל אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו בגלל המספר הגדול של פרטים החשובים להצלחה, כגון אספקת מי ים טובים, ייצור חזק של מזון איכותי וטיפול מתמיד בניקוי והאכלת התרבויות. ידגימו את ההליך מרטין אוגמרק ואנה-ליסה ראנג', טכנאית וחוקרת שעובדת עם ברנקלים.כדי להתחיל, הגדר מסגרות שיכולות להכיל כמה לוחות תרמופלסטיים שקופים. קדחו שני חורים בפינות העליונות של כל פאנל והשתמשו בקשרי כבלים כדי לחבר את הלוחות למסגרות. כדי לאסוף ברנקלים בוגרים, פרשו את הפאנלים אנכית בעומק של מטר עד שלושה מטר במים רגועים.לאחר שאפשרתם לברנקלים להתיישב ולצמוח לקוטר של חמישה מילימטרים, הכניסו את הלוחות למעבדה. לאחר מכן הניחו את הלוחות אנכית במעמד עם חריצים טחונים במגש פוליאתילן. ראשית, בעזרת סרט לא רעיל ועמיד במים, הדביקו חמישה לוחות יחד כדי ליצור קובייה פתוחה בחלקו העליון.מניחים את הקובייה במגש קטן וממלאים אותה במי ים. לאחר מכן, הוסיפו כ-200 סייפרידים בחלק העליון של הקובייה. אחת ליומיים, האכילו את הברנקלים הצעירים ב-100 מיליליטר של Skeletonema marinoi.לאחר שבועיים-שלושה, לוחות הקובייה צריכים להכיל צעירים מבוססים בקוטר של חמישה מילימטרים לפחות. פרק את הקובייה והעבר את הלוחות למגשים עם מי ים זורמים. כדי לקצור ארטמיה נאופלי, כבה תחילה את משאבת האוורור והכהה את הבקבוק, ואז האר את החלק התחתון של הבקבוק למשך 10 דקות.הנאופלי הארטמיה שבקע ישחה לעבר האור. הציסטות שלא בקעו ישקעו לתחתית, ואילו קליפות ציסטה יצופו למעלה. פתח את המהדק בתחתית ואסוף את שבר הביניים כאוכלוסייה צפופה של Artemia nauplii השוחה.כדי לנקות את הפאנלים עם ברנקלים בוגרים, יש לרסס אותם בעדינות במים מתוקים ולהסיר כל עכירות בעזרת מברשת שיניים רכה. נקו את המגשים ללא ברנקלים ואת הצינורות במים מתוקים חמים. לאחר מכן, הניחו מסננת למגש הפוליאתילן עם יציאת הצפה.אוספים את זחלי הברנקל שמתיישבים במסננת למשך הלילה. לאחר מכן מלאו דלי עם 20 ליטר מי ים מסוננים וליטר אחד של תערובת מיקרו-אצות צורניות ליצירת צפיפות של 50,000 צורניות למיליליטר. מעבירים את נאופלי הברנקל שנאסף בעבר לכלי מתגבש ומאירים את המנה מהצד.לאחר מכן השתמש בפיפטה כדי לאסוף את הנאופלי ששוחים לכיוון האור ולהעביר אותם לצלחת אחרת. מעבירים את הנאופלי לכוס המכילה ליטר אחד של מי ים מסוננים לספירה. לאחר מכן, הוסף ליטר אחד של נאופלי לדלי שהוכן בעבר.לאחר שלושה ימים, השתמשו במסננת של 90 מיקרומטר כדי לאסוף את הנאופלי של הברנקל, ואז נקו את הדלי, מלאו אותו במי ים מסוננים והוסיפו מזון צורניות חדש ואת הברנקל. לאחר יומיים-שלושה נוספים של דגירה, השתמשו במסננת של 320 מיקרומטר על גבי מסננת של 160 מיקרומטר כדי להפריד את הברנקל הלא מותך מהסייפרידים. לאחר הקמת ארבעה בקבוקים של ארבעה ליטר לתרבית מיקרו-אצות, הניחו את הבקבוקים באור בעוצמה של 50 עד 100 מיקרומול למ"ר.קצרו את התרבויות כשהן צפופות מספיק כדי לשמש להאכלה. ראשית, בחר פרטים גדולים ומנע מזון במשך יומיים לפני הנתיחה. לאחר מכן, נקו את קליפת הברנקל בעזרת מברשת שיניים ושטפו במים כדי למזער זיהום ממינים אחרים הקיימים בסביבה.הניחו ברנקל בודד על משטח אחיד לדיסקציה, ולאחר מכן הכניסו את קצה המלקחיים בין צלחות הטרגל והסקוטל. אחזו בצלחת אחת ומשכו אותה בעדינות כדי להסיר אותה. לאחר מכן, השתמש במלקחיים כדי לאחוז בצירי ולמשוך את הברנקל ישר החוצה.לבסוף, הנח את הברנקלים המנותחים ישירות בתמיסה מייצבת אתנול או RNA 96% לקיבוע. עם הפרוטוקול המתואר כאן, ניתן לייצר עד ארבע קבוצות של זחלי ברנקל נאופליוס בשבוע אחד. מקסימום, כל אצווה ממערכת התרבות מורכבת מכ-12,000 נאופלי, מה שאומר שניתן לגדל עד 50,000 נאופלי בשבוע.תוך שבוע, 70 עד 90% מהנאופלי שנאספו יתפתחו לסייפרידים, ויניבו כ-30,000 סייפרידים בשבוע. בממוצע 500 ננוגרם של RNA איכותי התקבל מ-20 ציפרידים בודדים ללא קשר לשלב ההתיישבות. בברנקלים, 28S rRNA מתפרק כאשר הוא מחומם.הומוגניזציה על ידי חרוזי קרמיקה מספקת ל-RNA את השלמות הגבוהה ביותר, ובכך הופכת אותה לשיטה המועדפת לטיפול ברקמות ברנקלים ופרוקי רגליים. באמצעות ניתוח qPCR, נצפתה עלייה של פי שניים עבור הגרסאות הארוכות של NAK1 mRNA ומליחות נמוכה בהשוואה ל-NAK הקצר. זה הצביע על כך שהצורה הארוכה שולטת בתנאי מליחות נמוכה.נדרשים כמה שבועות של הכשרה כדי לשלוט בשלבים השונים המעורבים בתרבות הברנקלים. בעת ניסיון הליך זה, חשוב במיוחד למזער את הזיהום בכל שלבי זרימת העבודה של התרבית. לאחר פיתוחה, טכניקת התרבות הזו הייתה חיונית להבנה טובה יותר של אקולוגיה, פיזיולוגיה וביולוגיה מולקולרית.זהו גם אבן פינה חשובה בהפיכת הברנקל Balanus improvisus למערכת מודל ימי חזקה.

the-barnacle-balanus-improvisus-as-marine-model-culturing-gene

Research

JoVE Journal

Environment

סביבה

Hawaiensis amphipod Parhyale הוא אורגניזם מודל מבטיח ללימודים של אמבריולוגיה הסרטנים ופיתוח arthropod השוואתי ואבולוציה. פרוטוקול זה מתאר שיטה להסרה ידנית של לסטומרים אחד מעוברים בשלב המוקדמים של מחשוף Parhyale.

אבלציה של תא בודד משמונה תאי עוברים של סרטנאים Amphipod<em&gt; Parhyale hawaiensis</em

שיטות המייצרות עוברי morphant חיוניות ללמוד מנגנוני התפתחות ורשתות רגולציה גן. כוכב הים Patiria miniata הוא מערכת מודל מתעורר ללימודים אלה. כאן אנו מציגים פרוטוקול לקבלת תאי רבייה, בהפקת תרבויות של עוברים, וmicroinjection המהיר של zygotes ממין זה.

שיטה לMicroinjection של Minata Patiria Zygotes

אנו מדווחים כאן הביטוי חזק ויעיל של חלבוני ניאון לאחר הזרקת mRNA לביציות מופרה של lanceolatum מיתרני הראש. הפיתוח של טכניקת microinjection בchordate בסיס זה יסלול את הדרך למרחיקה לכת חידושים טכניים במערכת מודל מתפתח זה, לרבות בתחום ההדמיה vivo ומניפולציות גנטיות ספציפית.

ביטוי של חלבונים ניאון ב Lanceolatum מיתרני הראש על ידי הזרקת mRNA לביציות מופרה

מטרת פרוטוקול זה היא לספק למשתמשים סט של שיטות לפירוק קפסולציה בתפוקה גבוהה של עוברים וזחלים של Lymnaea stagnalis כהכנה להכלאה שלמה באתר, ולטיפולים הבאים לפני ואחרי הכלאה.

הר שלם<em&gt; באתרו</em&gt; כלת שיטה עבור חלזון הרכיכות<em&gt; Stagnalis Lymnaea</em

כאן אנו מדגימים כיצד לגרום ולנטר התחדשות בשושנת ים הכוכב Nematostella vectensis, מודל אנתוזואן קנידרי.  אנו מדגימים כיצד לקטוע ולסווג התחדשות באמצעות מערכת בימוי מורפולוגית, ואנו משתמשים במערכת זו כדי לחשוף דרישה לאוטופגיה בהתחדשות מבני פוליפ.

התרמת התחדשות פוליפ שלמה מן Aboral Physa של שושנת ים הכוכבת Nematostella vectensis

המטרה של פרוטוקול זה היא לבצע הכלאה בחיי עיר על דגימות אלמוגים מבוגרים שמוטבע פרפין, למחלקה על גבי מדרון זכוכית. זוהי שיטה איכותי המשמש כדי להמחיש את הביטוי המרחבי לווין אנטי-חוש RNA ברקמות פרפין-מוטבע.

בחיי עיר טכניקות הכלאה פרפין-מוטבע דגימות אלמוגים למבוגרים

המטרה של פרוטוקול זה היא גנוטיפ של כלנית המים ne, שושנת הימים במהלך המאבק מבלי להקריב את העובר.

הגנוזות של כלנית ימית במהלך ההתפתחות המוקדמת

Doliolids, כולל את המינים דולילטה gegenbauri, הם קטנים זואופלנקטון הג ימית של משמעות אקולוגית המצויים על מערכות משנה יצרנית המדף ברחבי העולם. הקושי של התקשות האורגניזמים העדינים האלה מגביל את החקירה שלהם. במחקר זה אנו מתארים גישות טיפוח לאיסוף, גידול ושמירה על הdoliolid דולילטה gegenbauri.

הטיפוח-תרגול של החיל הימי ( uljanin 1884) למחקרים ניסיוניים

המאמר מציג שיטות לתרבית זחלים של הגסטרופוד Crepidula fornicata במערכת בקנה מידה מעבדתי קטן ובמערכת מזוקוסמוס של מי ים שניתן לפרוס בשטח.

מעבדה ותרבית שדה של זחלים של צלע נעלי בית, Crepidula fornicata

מחקר זה מתאר מסגרת לפיתוח מודל ביופילם פולימיקרוביאלי מצטבר ואופטימיזציה של פרוטוקול מיצוי RNA כדי להעריך את ביטוי הגן Pseudomonas aeruginosa המשקף את סביבת הריאות של סיסטיק פיברוזיס. היישומים כוללים הערכת השפעות אנטי-מיקרוביאליות וחקר חלופות אנטיביוטיות בתנאים הרלוונטיים לסיסטיק פיברוזיס.

מודל ביופילם מצטבר של סיסטיק פיברוזיס לחקר ביטוי גנים רלוונטי לזיהום

מחקר זה פיתח תהליך עבודה ליצירה ותחזוקה של קווי מוטנטים יציבים עבור חילזון תפוח מים מתוקים, Pomacea canaliculata. הפרוטוקולים כוללים איסוף זיגוטים, הזרקת מיקרו עם רכיבי מערכת CRISPR/Cas9 לביצוע עריכת גנום, תרבית עוברים מחוץ לביציות , וגנוטיפינג לאחר הכלאות מבוקרות.

חילזון התפוח הזהוב Pomacea canaliculata: מזיגוטים ועד קווי מוטנטים יציבים

למד שיטת גידול שנתית לזיפרגליים Balanus improvisus לחקר אוסמורגולציה וטכנולוגיות נגד אבנית. השיטה מאפשרת ייצור של עד 50,000 נאופליי בשבוע וחילוץ RNA איכותי לניתוח ביטוי גנים.

זיפרגליים Balanus improvisus כמודל ימית - Culturing, ביטוי גנים

גלה סרטונים נוספים