Bioprintable Alginate/ג'לטין הידרוג 3D במבחנה דגם מערכות זירוז היווצרות ספרואיד תא

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של הסרטן, כגון היווצרות גידולים, מעקב אחר נדידת תאים ואיתות סרטן ותאים בריאים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת לנו לחקור גידולים בסביבה תלת מימדית יחד עם תאי סטרומל, כגון פיברובלסטים, בעלות נמוכה וביכולת שחזור גבוהה. חשוב לוודא שהחומרים ניתנים להדפסה ביולוגית וביו-פונקציונליים, מה שדורש מחקר כמותי של התכונות הריאולוגיות שלו ותאימות התאים.

הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד את שלבי הכנת ההידרוג'ל וערבוב ההידרוג'ל של התאים מכיוון שהיווצרות בועות מפריעה לנאמנות המודל המודפס. בארון בטיחות ביולוגית, ערבבו שלושה גרם אלגינט ושבעה גרם אבקת ג'לטין בכוס של 250 מיליליטר. הוסף מערבל מגנטי ו -100 מיליליטר DPBS.

אטמו את הכוס עם סרט פרפין סטרילי ונייר אלומיניום כדי למנוע זיהום. לאחר מכן הראו למשתתף את התרשימים הקוטביים הייחודיים והספציפיים התואמים את דפוסי האלקטרומיוגרפיה שלהם, או EMG. לאחר מכן, המשיכו בתסיסה בטמפרטורת החדר למשך שעתיים.

מחממים את התמיסה בחום של 37 מעלות צלזיוס עד שהג'ל עובר מעבר פאזה למצב נוזלי. לאחר מכן העבירו את התמיסה לצינורות צנטריפוגה חרוטיים סטריליים של 50 מיליליטר, ואטמו אותם. צנטריפוגה את הצינורות ב 834 פעמים גרם למשך חמש דקות כדי לחסל בועות גז.

לאחר מכן, שאפו את מבשר ההידרוג'ל למזרקים של 10 מיליליטר. אוטמים את המזרקים עם כובעים וסרט פרפין. יש לאחסן בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס עד שמוכן לשימוש.

כאשר מוכנים להתחיל בבדיקה, הניחו מזרק של מבשר הידרוג'ל מוכן באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה. בזמן שהמזרק מתחמם, הפעל ואתחל את הריאומטר. לאחר שעה מוציאים את המזרק מאמבט המים.

הוצא כ- 0.5 מיליליטר מהמבשר על פלטפורמת הריאומטר. בלוח הבקרה, לחץ על לחצן המשולש כלפי מטה. המתן עד שכלי המדידה יעבור למטה למצב החיתוך.

בעזרת מרית, חתוך את כל הקודמן העודף שנמלט מקצה כלי המדידה, והשליך את החומר המיותר. לאחר מכן פיפטה שמן מינרלי על קצה כלי המדידה. המתן עד שהשמן יאטום את הגבול במלואו.

בלוח הבקרה, לחץ על המשך. לאחר מכן לחץ על כפתור התחל. לאחר השלמת הבדיקה, שחרר את כלי המדידה ולחץ על כפתור המשולש כלפי מעלה.

הסר את כלי המדידה. נקה גם את כלי המדידה וגם את הפלטפורמה עם 70% אתנול. ראשית, סריקות משרעת וטמפרטורה מלאות כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

כדי להתחיל סריקת זמן איזותרמית, לחץ על היישומים שלי ולחץ על התבנית לבדיקת טמפרטורת זמן איזותרמית. לחצו על השלב 'מדידה' בתהליך העבודה. לאחר מכן לחץ על מתח התנודה המשתנה ומשוך כלפי מעלה את חלון ההגדרה.

הגדר את מתח התנודה ל-0.1% והגדר את תדר התנודה להרץ אחד. בחלון המשיכה, הגדר את מספר נקודות הנתונים ל-120. הגדר את תדירות איסוף הנתונים לנקודה אחת לדקה.

לחץ/י על הכפתור ״הוסף״ כדי להוסיף את משתנה הטמפרטורה. לחץ על הטמפרטורה המשתנה והגדר אותה ל- 25 מעלות צלזיוס. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על השלב התקן, עבור לנקודת מדידה בזרימת העבודה.

לחץ על מחק. לאחר מכן לחץ על השלב התקן, הגדר ערך. בטל את סימון התיבה המתן עד שתגיע לערך והגדר את הערך ל- 25 מעלות צלזיוס.

לחץ על תמונה, כותרת, כפתורים במסך התחתון. בטל את סימון התיבה המשך. לאחר מכן לחץ על השלב התחל, תן שם לפרויקט ושמור אותו.

כעת טען את הדגימה על פלטפורמת הריאומטר, והתחל את הבדיקה בהתאם לפרוטוקול הבדיקה הכללי שתואר קודם לכן. לאחר מכן, שימו לב ל-G ראשוני ו-G כפול לעומת הזמן. מצא את נקודת ההצלבה של G ראשוני ו-G כפול ראשוני, וקבע את הזמן בנקודת ההצלבה.

לאחר מכן לחץ על טבלה, העתק את כל הנתונים והדבק אותם בקובץ טקסט. כדי למדוד את חוזק התשואה בזמני ג'ל שונים, לחץ על האפליקציות שלי. לחץ על התבנית עבור תשואה ומתח זרימה, דמוי ג'ל.

תן שם לפרויקט זה. לאחר מכן, לחץ על שלב התחל בזרימת העבודה. בתפריט העליון, לחץ על הוסף.

לאחר מכן, בתפריט הנפתח, בחר המתן. משכו את חלון ההתקנה והגדירו את זמן ההמתנה ל-50 דקות. לחץ על התחל ולאחר מכן לחץ שוב על הוספה.

בחר מכשיר מהתפריט הנפתח. משוך את חלון ההתקנה כלפי מעלה, בחר טמפרטורה והגדר אותו 25 מעלות צלזיוס. בטל את סימון התיבה המתן עד שתגיע לערך.

בתהליך העבודה, בחר את השלב מדידה. בחר את המשתנה מתח גזירה ומשוך כלפי מעלה את חלון ההגדרה. הגדר את מתח הגזירה הראשוני והסופי לאפס ו -10, 000 פסקל, בהתאמה.

לאחר מכן לחץ על מחשבון, הגדר את צפיפות הנקודות ל-0.2 נקודה לפסקל. בכרטיסייה נקודות נתונים מימין, הגדר נקודה אחת לשנייה. בתחתית חלון המשיכה, בחר בכרטיסייה בקרת אירועים, הגדר את הקריטריון עצור את המדידה אם קצב הגזירה גדול מ-100 לשנייה.

טען את הדגימה על פלטפורמת הריאומטר, והתחל את הבדיקה בהתאם לפרוטוקול הבדיקה הכללי שתואר קודם לכן. לאחר השלמת הבדיקה, לחץ על דיאגרמה כדי לצפות בעקומת המתח-מתח. חזור על בדיקה זו עבור זמני המתנה של 30, 40 ו-50 דקות.

יש לבצע את השלבים הבאים בתנאים סטריליים. כדי להתחיל, עקר את המדפסת הביולוגית על ידי ריסוס יסודי באתנול 70% ולאחר מכן חשיפתה לאור UV למשך הלילה. הסר מזרק של מבשר הידרוג'ל מהאחסון, וחמם אותו באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה.

העבירו בקבוק T של תאים שעברו תרבית בעבר מאינקובטור CO2 לארון הבטיחות הביולוגית. השליכו את מדיום התרבות ואז שטפו את התאים פעמיים עם DPBS. הוסף תמיסת טריפסין-EDTA מחוממת לתאים.

דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שש דקות. לאחר מכן, השבת את הטריפסין על ידי הוספת אותו נפח של FBS. הסר את מזרק מבשר ההידרוג'ל מאמבט המים ונקה אותו.

עקר את המזרק עם אתנול 70% לפני העברתו לארון הבטיחות הביולוגית. הוצא כשלושה מיליליטר של מבשר הידרוג'ל למחסנית הדפסה של 10 מיליליטר. ערבבו את הפרקורסור עם תאי MDA-MB-231-GFP בריכוז של מיליון תאים למיליליטר על ידי פיפטינג איטי כדי למנוע יצירת בועות.

מכסים את המחסנית במכסה הקצה והעליון, ואטומים אותה בניילון פרפין. ואז צנטריפוגה אותו ב 834 פעמים גרם למשך דקה אחת כדי לחסל בועות גז. חזור על כל התהליך הזה עבור הקודמים האחרים.

לאחר מכן, יש לעקר את כל שלוש המחסניות עם 70% אתנול. טען את המחסניות המעוקרות לתאי המדפסת הביולוגית. בתוכנת הבקרה של המדפסת, לחץ/י על ״מדריך״.

לאחר מכן הרחב את הכרטיסייה ראש כלי בתוכנת הבקרה של המדפסת. לחץ על מחסנית אחת בממשק הגרפי בצד שמאל, הגדר את טמפרטורת המחסנית ל-25 מעלות צלזיוס והמתן 35 דקות כדי לאפשר לקודמן להגיע לתנאים הניתנים להדפסה. חזור על פעולה זו עבור שתי המחסניות האחרות.

בתוכנת הבקרה של המדפסת, הרחב את הכרטיסייה ראש כלי. לחץ על מחסנית אחת בממשק הגרפי ולאחר מכן לחץ על כפתור המדידה הקצר כדי למדוד את מיקום קצה הזרבובית. חזור על פעולה זו עבור שתי המחסניות האחרות.

לאחר מכן, מקם מיקרו-פלטת פוליסטירן שקופה על המדפסת stage. פתח את קוד ה- G file, ושנה את הלחץ ל -200 קילופסקל עבור כל המחסניות. חזור לתוכנת הבקרה ולחץ על הכרטיסייה Scaffolder Generator

בחר נקודה כדי להתחיל בהדפסה ולאחר מכן לחץ על לחצן הפעלה. חזור על תהליך זה כדי לקבל שלושה שכפולים. לאחר מכן, הוסף תמיסת סידן כלורי של 100 מילי-מולרית למשך דקה אחת כדי לקשר בין הדגמים.

שוטפים פעמיים עם DPBS. לאחר מכן השתמש במרית כדי להעביר בזהירות את הדגמים לצלחת מצופה אגרוז עם שש בארות. הוסף חמישה מיליליטר של DMEM לכל באר, ודגירה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני, והחלף את מדיום תרבית התאים כל שלושה ימים.

במחקר זה, מערכות הידרוג'ל תלת מימדיות מיוצרות כדי לסכם מיקרו-סביבות גידול in vivo ולהקל על היווצרותם של ספרואידים גידוליים רב-תאיים. סריקת טמפרטורה של מבשר A3G7 מראה ש-G כפול ראשוני גדול מ-G ראשוני ב-37 מעלות צלזיוס, מה שמאמת את התכונות הידועות של המבשר. ככל שהטמפרטורה יורדת, המבשר עובר ג'לציה פיזית עקב ההסתבכות הפיזית הספונטנית של מולקולות הג'לטין לתצורת תלת-סליל.

גם ה-G prime וגם ה-G הכפול הראשוני מגבירים את הטמפרטורה יורדת ומתכנסת ב-30.6 מעלות צלזיוס, מה שמעיד על מעבר סול-ג'ל. מיקרוסקופיה קונפוקלית של מודל המדחף המודפס מראה שתאי MDA-MB-231-GFP מתחילים לפתח ספרואידים 15 יום לתוך תקופת התרבית, והספרואידים ממשיכים לגדול בגודלם ובמספרם עד ליום ה-30. חלק מתאי IMR-90-mCherry נראים גם כיוצרים צבירות.

לאחר 30 יום של תרבית, ניתן היה לראות תאי IMR-90-mCherry באזור שנכבש בתחילה על ידי תאי MDA-MB-231-GFP, בעוד שתאי MDA-MB-231-GFP ניתן היה לראות באזור הנשלט על ידי IMR-90-mCherry. זה מרמז על אירועי הגירה אפשריים במודל. מיקרוסקופיה קונפוקלית של מודל הדיסק מגלה שתאי MDA-MB-231-GFP מתנהגים באופן דומה לאופן שבו הם התנהגו במודל המדחף, וכתוצאה מכך הידרוג'ל עמוס בספרואידים לאחר 21 יום של תרבית.

לאחר שליטה, טכניקה זו להדפסת דגמים יכולה להיעשות תוך שעתיים, אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשמור על הידרוג'ל ותאים טריים ככל האפשר, לא לערבב אצוות הידרוג'ל ישנות עם חדשות, ולעבוד בתנאים סטריליים כדי למנוע תוצאות מטעות. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו סריקת אלקטרונים ומיקרוסקופ זמן-lapse על מנת לענות על שאלות נוספות, כמו נקבוביות חומרים, קצב נדידת תאים ושיפוץ מטריצות.

ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול בסרטן מכיוון שמודל מבחנה זה מאפשר מחקרים מבוקרים באופן שיטתי של היווצרות גידול והתנהגותו במערכות תרבית משותפת. מלבד תאי סרטן השד, ניתן ליישם את המודל בקלות גם על מערכות המשתמשות בסוגים אחרים של תאים במיקומים ראשוניים שונים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליצור מודלים של מחלות הטרוגניות תלת מימדיות על ידי הכנה נכונה של הידרוג'לים, הטמעת תאים והדפסת החומר בחלון ההדפסה האופטימלי.

אל תשכח שעבודה עם דגימות ביולוגיות עלולה להיות מסוכנת ביותר ואמצעי זהירות כגון לבישת ציוד מגן אישי, כגון כפפות, מעיל מעבדה ומשקפי מגן בזמן ביצוע הליך זה.