ביטוי וטיהור של תעלות יונים Bestrophin מידע יונקים

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח הקשורות לביופיזיקה של תעלות יונים ביונקים, כולל אך לא רק משפחת הבסטרופין של תעלות יונים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן ליישם אותה על סוגים אחרים של תעלות יונים ומייצרת תוצרי מפתח לבדיקות שונות במורד הזרם. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול בבסטרופינופתיה מכיוון שבדיקות המשתמשות בחלבון המטוהר תורמות לידע שלנו כיצד פועלות תעלות בסטרופין ברשתית וכיצד מוטציות בגן BEST1 גורמות לניוון מקולרי.

עשרים וארבע שעות לפני הדבקה נגיפית, הוסף נפח שווה של טריפן כחול למנה של 15 מיקרוליטר של תרבית תאים HEK293F ובדוק את צפיפות התא ואת כדאיות התא באמצעות המוציטומטר תחת מיקרוסקופ. לאחר ביצוע ספירת התאים, יש לצלחת 0.6 כפול 10 עד שישית תאים למיליליטר בנפח של 500 מיליליטר בכל אחת משתי צלוחיות חד פעמיות של שני ליטר. הכניסו את הצלוחיות לחממה לחה של 37 מעלות צלזיוס עם 8% פחמן דו חמצני.

סובב את התרבית על פלטפורמה מסלולית ב-135 סל"ד. ביום ההדבקה, בדוק את צפיפות התאים והכדאיות של 15 מיקרוליטר של התרבית כמו קודם. כדאיות תאים גבוהה של מעל 95% חיונית לזיהום יעיל ולביטוי חלבונים.

צפיפות התאים הצפויה היא בערך 10 כפול 10 עד שישית התאים למיליליטר ומספר התאים הכולל הצפוי הוא בערך 1 כפול 10 עד תשעה. הוסף את נגיף ה-P3 Baculovirus לתאים בריבוי הדבקה של חמישה. כדי לקבוע את כמות הנגיף שיש לחסן השתמש במשוואה המוצגת על המסך.

לאחר מכן דגרו על התאים המחוסנים למשך 24 שעות. עשרים וארבע שעות לאחר מכן, הוסיפו נתרן בוטיראט לריכוז סופי של 10 מילימולר לכל תרבית תאים והחזירו לאינקובטור המוגדר ב-37 מעלות צלזיוס או 30 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות. ארבעים ושמונה שעות לאחר מכן, בדוק את האחוז והבהירות של תאים ירוקים המייצגים ישירות את החלבון במיקרוסקופ פלואורסצנטי.

קצרו את התאים על ידי צנטריפוגה בטמפרטורה של 1, 000 פעמים גרם בארבע מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את כדורי התא עם מי מלח חוצצים פוספט לנפח סופי של כ-80 מיליליטר. פצל כל תרחיף תאים בין שני צינורות חרוטיים של 50 מיליליטר וצנטריפוגה למשך 20 דקות ב-1, 000 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס.

כדי להתחיל בהליך טיהור החלבון, יש להפשיר תחילה את כדורי התאים באמבט מים מערבבים בטמפרטורת החדר. כאשר הכדורים מופשרים לאחר 10 עד 15 דקות, השעו מחדש את התאים בנפח כפול של בופר A בתוספת מעכבי פרוטאינאז. פיפטה למעלה ולמטה בהרחבה כדי להשיג תרחיף תאים הומוגני.

ליזה את התאים באמצעות הומוגנייזר בלחץ גבוה. העבירו את תרחיף התא דרך ההומוגנייזר במהירות של שבע עד 10 מגה-פסקל שלוש עד ארבע פעמים כדי להשיג הומוגניזציה מלאה. שמור את התא על קרח במשך שתיים-שלוש דקות בין סיבובים.

הוסף חומר ניקוי לליזט התא. דגירה בתסיסה למשך שעה בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס כדי לחלץ את חלבוני הממברנה. לאחר הדגירה, צנטריפוגה את התא ליזאט ב-150,000 פעמים גרם באולטרה-צנטריפוגה בארבע מעלות צלזיוס למשך שעה.

לאחר צנטריפוגה, ליזאט התא השקוף יהיה דחוס בין הגלולה בתחתית לשכבה עכורה מעל. השתמש בפיפטה העברה של 10 מיליליטר כדי לאסוף בזהירות את הליזאט השקוף ולאחר מכן עבור לפיפטה של מיליליטר אחד עבור המיליליטרים האחרונים של ליזאט. החל את הליזאט על עמודת זיקה של ניקל HisTrap NTA בנפח חמישה מיליליטר מאוזנת מראש עם מאגר A.לאחר מכן, שטפו את העמודה עם 25 מיליליטר של מאגר B ואחריו 40 מיליליטר של מאגר C.ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.

החלבון יישאר יציב כשהוא מחובר לעמוד למשך הלילה. לאחר הכביסה, חבר את העמודה למערכת כרומטוגרפיה נוזלית מהירה של חלבון ודלל את החלבון מהעמודה עם 13 מיליליטר של חיץ D עם פיצול. אסוף את השברים המועשרים בחלבון בהתאם לקריאת ספיגת ה-UV.

מדוד את ריכוז תוצר החלבון המועבר בספקטרופוטומטר מיקרו-נפח על ידי קריאת הספיגה ב-280 ננומטר. כדי להסיר את ה-GFP10x his-tag, הוסף את פרוטאז TEV ביחס מסה של אחד לאחד ודגירה בארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. רכז את החלבון לנפח סופי של 400 עד 500 מיקרוליטר עם יחידת סינון צנטריפוגלית של 15 מיליליטר על ידי סיבוב ב-4,000 פעמים גרם בצנטריפוגה של ארבע מעלות צלזיוס למרווחים משתנים החל מ-10 דקות.

העבירו את החלבון המרוכז לצינור נקי של 1.5 מיליליטר והסירו כל משקעים או בועות מהמוצר המרוכז. סובב ב-12,000 פעמים גרם במשך חמש עד 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס, ואז העביר את הסופרנטנט לצינור חדש של 1.5 מיליליטר. השתמש במזרק מיליליטר אחד ובמחט קצה עגולה כדי לטעון את המוצר הסופי על מערכת FPLC לכרומטוגרפיה של אי הכללת גודל עם עמודת אי הכללת גודל מאוזנת מראש עם מאגר E. חלבונים שמתנהגים היטב פועלים כשיא יחיד.

אסוף את חלק החלבון או שברים מרובים המתאימים לשיא זה. רכז את החלבון ביחידת פילטר צנטריפוגלית של ארבעה מיליליטר או 0.5 מיליליטר באותו חתך משקל מולקולרי ששימש בעבר. סובב ב -4, 000 פעמים גרם בארבע מעלות צלזיוס לריכוז סופי של חמישה עד 10 מיקרוגרם למיקרוליטר.

השתמש בספקטרופוטומטר כדי לבדוק את ריכוז המוצר הסופי. עוצמת הקרינה שנצפתה בתאי HEK293 דביקים חולפים הנראים כאן היא אינדיקטור טוב לרמת ביטוי החלבון הצפויה בתאי HEK293F מרחפים המוצגים כאן. טיהור מוצלח מסומן על ידי שיא ראשי יחיד בנפח הדילול הצפוי בכרומטוגרפיה של אי הכללת גודל ורצועה דומיננטית אחת על ג'ל דף SDS מפוגל.

בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשמור הכל על קרח במהלך הטיהור ואם מבצעים מספר טיהורים בו זמנית, החליפו כפפות לעתים קרובות והקפידו לא לזהם דגימות. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן ובדיקות דו-שכבתיות של שומנים כדי לענות על שאלות חשובות כמו קשרי פונקציות מבנה. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום מחלות רשתית תורשתיות לחקור את הגורמים לבסטרופינופתיה ברמה המולקולרית.