אפיון של אימונוגלובולינים התימוס תלוית ועצמאי התימוס תגובות Isotype בעכברים באמצעות אנזים-מקושרים Immunosorbent Assay
7 בספטמבר 2018
בנייר זה, אנו מתארים פרוטוקול לאפיין תלויי-T ו- T-עצמאית אימונוגלובולינים (Ig) תגובות isotype בעכברים באמצעות אליסה. בשיטה זו נעשה שימוש לבד או בשילוב עם זרימה cytometry יאפשר לחוקרים לזהות הבדלים בתגובות isotype איג B תאית בעכברים בעקבות חיסון אנטיגן תלויי-T ו- T-עצמאית.
שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האימונולוגיה לגבי תגובות נוגדנים תלויות ועצמאיות הנגרמות על ידי חיסון אנטיגן, כמו גם הפעלת תאי B ותגובות מרכז נבט. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת מדידות אמינות וכמותיות של תגובת איזוטיפ Ig עם השוואה ישירה של הפעלת תאי B וחסינות הומורלית בעכברים. לחיסון TNP-פוליסכריד טען מזרק אינסולין מיליליטר אחד לכל עכבר עם 100 מיקרוליטר של תמיסת אנטיגן טרייה שהוכנה והכנס את המחט לרבע הימני התחתון של כל בעל חיים בזווית של כ-30 מעלות כדי למנוע הזרקת איברים תחתונים.
לאחר שכל העכברים הוזרקו, החזירו את החיות לכלובים שלהם למגורים במתקן ספציפי נטול פתוגנים. בנקודות הזמן המתאימות לניסוי, אספו 150 עד 200 מיקרוליטר דם מכל בעל חיים מחוסן על ידי דימום רטרו-אורביטלי ואפשרו לדגימות להיקרש בטמפרטורת החדר למשך שעה עד שעתיים. בתום הדגירה, צנטריפוגה את דגימות הדם הקרושות ומעבירה את הנסיוב השקוף מהחלק העליון של כל קריש דם לצינור מיקרו-צנטריפוגה סטרילי של 1.5 מיליליטר.
לאחר צנטריפוגה שנייה להסרת כל קריש דם שנותר, העבירו 50 מיקרוליטר של סרום לצינורות מיקרו-צנטריפוגה סטריליים בודדים של 1.5 מיליליטר לאחסון במינוס 80 מעלות צלזיוס. לפני הציפוי, יש לצפות 96 לוחות חיסונים בודדים בריכוז המתאים של נוגדנים ללכידה ספציפיים לאיזוטיפ Ig של עכבר עבור אנטיגן Ig איזוטיפ TNP-38BSA בסרום עבור איזוטיפ Ig ספציפי ל-TNP או אנטיגן TNP-3BSA לאיזוטיפ Ig ספציפי ל-TNP בעל זיקה גבוהה ודגירה על הלוחות המצופים למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת בבוקר שטפו את הצלחות פעמיים עם 200 מיקרוליטר מאגר כביסה לבאר.
השלכת מאגר הכביסה וייבוש הצלחות על ערימת מגבות נייר לאחר כל כביסה. לאחר מכן, חסמו את הצלחות עם 200 מיקרוליטר חיץ חוסם לבאר למשך שעה דגירה בטמפרטורת החדר. בזמן חסימת הצלחות הכינו את הסטנדרטים המתאימים ואת דילול הסרום והמאגר החוסם בצלחת נפרדת לא מטופלת של 96 בארות ב-150 מיקרוליטר לבאר כפי שמצוין.
לאחר מכן שטפו את צלחת ELISA עם מאגר כביסה כפי שהודגם והוסיפו 100 מיקרוליטר מכל תקן איזוטיפ Ig מדולל ודגימת סרום לבארות המתאימות של צלחת ELISA. לאחר דגירה של לילה בארבע מעלות צלזיוס, שטפו את הצלחות כפי שהודגם והוסיפו 100 מיקרוליטר של נוגדן ספציפי לאיזוטיפ מצומד אלקליין פוספטאז מדולל במאגר חוסם לכל באר למשך שעה עד שעתיים בטמפרטורת החדר. בתום הדגירה יש לשטוף את הצלחות ולהוסיף 100 מיקרוליטר תמיסת מצע טרייה שהוכנה לכל באר.
ניטור התגובה תוך כדי התפתחותה במהלך הדקות הקרובות בטמפרטורת החדר. כאשר התגובה חזקה מספיק כדי לנתח, הנח את הצלחת בקורא מיקרו-פלטות ולחץ על הגדרות כדי להגדיר את אורך הגל ל-405 ננומטר. לחץ על אישור ולאחר מכן לחץ על תבנית כדי להקצות את הבארות הריקות, הסטנדרטיות והלא ידועות המתאימות בהתאם להגדרת לוח 96 הבארות.
לאחר מכן, כאשר התקן המרוכז ביותר מגיע לצפיפות אופטית של כאחד, 1.5, שניים ו-2.5, לחץ על קריאה כדי לקרוא את הלוח ולשמור את קובץ הנתונים המתקבל לאחר כל ניתוח. בהיעדר חיסון, נצפתה עלייה ברמות הסרום הבסיסי של IgM, IgG2a, IgG2b, IgG3 ו-IgA בעכברי נוקאאוט הקשורים לקולטן TNF ספציפי לתאי B או בעכברי נוקאאוט B-TRAF3, בהשוואה לבעלי חיים המותאמים למין ולגיל B-TRAF3. שבעה ימים לאחר החיסון עם TNP-פוליסכריד או TNP-KLH כפי שהודגם זה עתה ניתוח של תגובות איזוטיפ Ig בלתי תלויות בתימוס לחיסון, מגלה רמות גבוהות משמעותית של IgG3 ספציפי ל-TNP שאינו תלוי בתימוס, כמו גם רמות גבוהות של IgG2b ספציפיות ל-TNP התלויות בבלוטת התימוס בעכברי נוקאאוט TRAF3 ספציפיים לתאים מיאלואידיים בהשוואה לבקרות של בני זוג המלטה.
יתר על כן, הערכה של תגובות ראשוניות וזיכרון של עכברים תלויי תימוס לחיסון TNP-KLH מצביעה על נוכחות של ירידה חלקית בתגובות ראשוניות של IgM תלויות בלוטת התימוס ותגובות ראשוניות וזיכרון IgG1 פגומות בעכברי נוקאאוט TRAF3 ספציפיים לתאי T. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור של-ELISA יש מגבלות זיהוי המוגדרות בדרך כלל על ידי הטווח הליניארי של העקומות הסטנדרטיות ולכן ייתכן שיידרשו דילולים מרובים של הדגימה שלך. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות משלימות אחרות כמו זרימה ציטומטרית או נקודת L כדי לקבל הבנה מקיפה של תגובות נוגדנים בסביבה ניסויית נתונה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר פרוטוקול לאפיון תגובות של איזוטיפים של אימונוגלובולינים (Ig) תלויות-T ובלתי תלויות-T בעכברים באמצעות ELISA. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לזהות הבדלים בתגובות של איזוטיפים של Ig המתווכות על ידי תאי B בעקבות חיסון באנטיגן.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- אימונולוגיה
- תגובות נוגדנים
- הפעלה של תאי B
רקע
- הבנת תגובות נוגדנים תלויות-T ובלתי תלויות-T היא קריטית באימונולוגיה.
- אפיון תגובות של איזוטיפים של Ig מסייע בחקר החסינות ההומורלית.
- ציטומטריה של זרימה יכולה להשלים את בדיקת ה-ELISA לצורך ניתוח מפורט.
- מדידות מהימנות של תגובות איזוטיפים של Ig הן חיוניות למחקר.
מטרת המחקר
- מתן פרוטוקול למדידת תגובות של איזוטיפי Ig בעכברים.
- השוואת הפעלת תאי B בתגובה לאנטיגנים שונים.
- העמקת ההבנה של תגובות חיסוניות בהקשרים שונים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ELISA לכימות תגובות של איזוטיפי Ig.
- ציטומטריית זרימה לניתוח אקטיבציה של תאי B.
- הזרקת תמיסת אנטיגן לעכברים לצורך חיסון.
- איסוף דגימות דם לניתוח סרום.
תוצאות עיקריות
- בוצעו מדידות כמותיות של תגובות איסוטיפ של Ig.
- נצפו הבדלים בהפעלה של תאי B בהתבסס על סוג האנטיגן.
- השיטה הוכחה כאמינה לחקר החסינות ההומורלית.
- הושגו דגימות סרום צלולות לצורך ניתוח נוסף.
מסקנות
- הפרוטוקול יעיל לאפיון תגובות נוגדנים.
- הוא מספק תובנות לגבי חסינות המתווכת על ידי תאי B.
- ניתן ליישם שיטה זו במגוון מחקרים אימונולוגיים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך ניהולי
פרוטוקול זה מאפשר לחוקרי ביו-פרמה לנתח באופן כמותי תגובות של איזוטיפים של אימונוגלובולינים התלויות בטימוס ואלו שאינן תלויות בו במודלים של עכברים, ובכך מספק תובנה מכניסטית לגבי הפעלת תאי B וחסינות הומורלית. על ידי אספקת מדידות ELISA אמינות וספציפיות לאיזוטיפ, הוא תומך בתיקוף מטרות ובצמצום סיכונים חזוי בפיתוח חיסונים ומודולטורים חיסוניים. השיטה משפרת את הרצף התרגומי כאשר היא משולבת עם בדיקות משלימות כגון ציטומטריה עם זרימה, ומסייעת בקבלת החלטות לגבי המשך הפיתוח (go/no-go) בקווי גילוי מוקדמים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות על ידי כימות תגובות IgM ספציפיות לאנטיגן ותגובות IgG/IgA/IgE עם החלפת איזוטייפ (isotype-switched) לגירויים תלוי-תימוס ובלתי תלוי-תימוס.
- ערך תפעולי: מספק מדידות סטנדרטיות וניתנות לשחזור של נוגדנים בסרום, המבהירות את המעורבות הפונקציונלית במטרה ואת הפעילות הביולוגית של מועמדים לאימונומודולציה.
- ערך ניבוי: תומך בסינון תיקי הפיתוח על ידי הבחנה בין מחלקות מכניסטיות של אימונוגנים על בסיס דפוסי החלפת איזוטייפ וקינטיקה של תגובת זיכרון.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: מייצר מערכות ביולוגיות מתוקפות (סרומי עכבר) עם פלטי כמותיים של איזוטיפי Ig המתאימים לתהליכי סינון המשכיים.
- שחזור: מספק נהלי ELISA סטנדרטיים עם דרישות דילול מוגדרות ובקרות לטווח ליניארי, מה שמבטיח עקביות של הבדיקה בין ניסויים שונים.
- יכולת הרחבה: תומך בשימוש חוזר בפלטפורמה לצורך ניתוח השוואתי של פורמולציות של אנטיגנים, אדג'ובנטים או מודלים גנטיים במסעות של סינון אימונוגניות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מאפשר הערכה של תגובות ספציפיות לאנטיגן במודלים המשקפים את החסינות ההומורלית האנושית, ובכך תומך בהתאמה של ביומרקרים תרגומיים.
- המשכיות פרה-קלינית: מקשר בין אפיון איסוטיפ של Ig בשלבי הגילוי המוקדמים לוולידציה פרה-קלינית באמצעות דגימות סרום ארוכות טווח לפני ואחרי חיסון.
- החלטות מותאמות סיכון: מספק מידע לקריטריונים של קידום על ידי זיהוי פגמים בהחלפת איסוטיפ (למשל IgG1) או בתגובות זיכרון הקשורות למסלולים תאיים ספציפיים (למשל T cell TRAF3).
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף ראשוני של המטרה, דרך זיהוי מובילים ועד להערכה פרה-קלינית, ובמיוחד עבור אימונומודולטורים וחיסונים שבהם פרופיל האיזוטייפ מנבא תוצאות תפקודיות.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות ובהבהרת מסלולים על ידי קישור חשיפה לאנטיגן לחתימות מוגדרות של איזוטיפ Ig (למשל, TI IgG3 לעומת TD IgG2b).
- סריקה: מספק קריאות כמותיות המוכנות לבדיקה עם סגוליות ורגישות גבוהות, המאפשרות השוואה מהימנה של פוטנציאל אימונוגני בין מועמדים שונים.
- אנליטיקה: מספק מדידות המבוססות על צפיפות אופטית ב-405 nm המנובעות מעקומות סטנדרט, מה שמאפשר השוואה סטטיסטית בין-קבוצתית של תיתורי נוגדנים.
- מחקר תרגומי: עולה בקנה אחד עם המשכיות פרה-קלינית על ידי מתן אפשרות למעקב אורך של תגובות ראשוניות ותגובות זיכרון, דבר קריטי להערכת מועמדים לחיסונים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס כלי לאפיון אימונולוגי שניתן לשימוש חוזר וניתן ליישום בפרויקטים מרובים הכוללים תגובות המתווכות על ידי תאי B.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת העמימות המכניסטית במסלולי הפעלת תאי B.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה והדירות באמצעות פרוטוקולי דילול סרום מוגדרים ושלבי אופטימיזציה של ELISA.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך או הפסקה (go/no-go) על ידי קישור פרופילי איזוטייפ לתוצאות חיסוניות תפקודיות, ובכך מפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מועמדים מותאם סיכון בהתבסס על יכולתם לעורר תגובות זיכרון והחלפת איזוטייפ רצויות.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות באימונולוגיה של עכברים, טיפול בסרום ואופטימיזציה של ELISA כדי להבטיח כימות מדויק בתוך הטווח הליניארי של עקומות הסטנדרט.
- תלוי בגישה לקוראי מיקרו-פלטות, אינקובטורים, צנטריפוגות ומתקני תרבית רקמה סטריליים לצורך עיבוד הסרום וביצוע הבדיקה.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים לגבי תזמון איסוף הדגימות, טכניקות דימום (למשל, רטרו-אורביטלית) ותנאי אחסון (−80 °C) כדי לשמור על שלמות הנתונים.
- נדרשים שיקולי התאמה בעת הרחבה לזני עכברים שונים, אנטיגנים (למשל, TNP-KLH לעומת TNP-polysaccharide) או מערכות אדג'ובנטים (alum לעומת PBS).
- מגבלה מעשית: דילול סדרתי של דגימות נדרש לעיתים קרובות כדי למנוע רוויית אות ולהבטיח אינטרפולציה מדויקת מעקומות הסטנדרט, דבר המגדיל את זמן העבודה המעשית.
שאלות נפוצות בתחום הביו-פארמה
Chapters in this video
0:04
Title
0:43
2,4,6-Trinitrophenyl (TNP)-polysaccharide and TNP-keyhole Limpet Hemocyanin (KLH) Immunization and Serum Preparation
1:54
Enzyme-linked Immunosorbent Analysis (ELISA)
4:17
Results: Representative Thymus-independent (TI) and Thymus-dependent (TD) Ig Isotype responses to TNP-polysaccharide and TNP-KLH Immunization
5:36
Conclusion
