וזמינותו התקפה אלימה חיידקי מהירה מבוססת תמונה באמצעות אמבה

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הפתוגנזה החיידקית, כגון מתי מתבטאים אפקטורים אלימים הורגים מארח בתאי חיידקים, ומהם מצבי האלימות של תאים שתלים המחוברים לפני השטח? היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מהירה, כמותית ותאי המארח קלים יחסית לטיפול. הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר שמנו לב שלתת-אוכלוסייה שתלונית מחוברת לפני השטח של Pseudomonas יש פנוטיפים שונים של הרג מארח.

כדי להתחיל לגדל זן E.coli BR בן לילה כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן הביאו את תרבית ה-E.coli לטמפרטורת החדר. בעזרת מקל עץ מחסנים אמבה ל -750 ליטר של התרבות.

מוסיפים מיד 700 ליטר מתערובת האמבה E.coli לצלחת GYP. הטה את הצלחת כדי לפזר את התרבות באופן שווה על פני הצלחת. לאחר מכן הניחו את הצלחת בקופסה השומרת על לחות גבוהה.

דגרו את הצלחת בתוך הקופסה בחום של 22 מעלות צלזיוס למשך ארבעה עד חמישה ימים. לאחר סיום תקופת הדגירה, השתמש בקצה פיפטה סטרילי כדי לאסוף נבגי אמבה ממחצית הצלחת. לאחר מכן פיפטה למעלה ולמטה כדי להשעות מחדש את האמבה על קצה הפיפטה ב-1 מ"ל של מדיום PS.

העבירו את תערובת החיסונים לבקבוק של 250 מ"ל עם 25 מ"ל של מדיום PS בתוספת תמיסה אנטיביוטית אנטי-מיקרוטית. גדל את האמבה ב-22 מעלות צלזיוס בשייקר מסתובב ב-100 סל"ד. לאחר גידול Pseudomonas aeruginosa בן לילה, יש לדלל את התרבית במצע PSB בצלחת פטרי בגודל 6 ס"מ.

לאחר מכן נער את התרבית על מסובב ספסל המוגדר ל-100 סל"ד ב-37 מעלות צלזיוס.מיקרוגל ראשון 50 מ"ל של 1% אגר במאגר DB בבקבוק של 250 מ"ל. הוסף 15 ליטר סידן AM ל -15 מ"ל אגר מותך וערבב בעדינות. יוצקים את תערובת האגר המותכת לצלחת זכוכית בגודל 12 על 10 ס"מ, ומניחים לאגר להתמצק במשך עשר דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, השתמש בסרגל מתכת וברשת מודפסת כדי לחתוך את כרית האגר המוצקה לחלקים קטנים יותר בגודל 1.5 על 1.5 ס"מ. ודא שהג'ל נשאר לח עד שהוא מוכן לשימוש. לאחר מכן, כדי לבודד את התאים המחוברים למשטח, הסר את המדיום הנוזלי מצלחת הפטרי.

לאחר מכן שטפו את הכלי עם 1 מ"ל של מאגר התפתחות כדי להסיר את התאים הפלנקטוניים. כדי לבחון את האלימות של תאי חיידקים המחוברים על פני השטח, הוסף 10 ליטר של תאי אמבה מתאי החיידקים המחוברים לפני השטח שהושגו בעבר. כדי לבודד את התאים הפלנקטוניים, העבירו 10 ליטר מהתרבית לצלחת פטרי טרייה.

לאחר מכן, בדוק את האלימות של תאים פלנקטוניים על ידי ערבוב של 10 ליטר של תאי אמבה עם החיידקים הפלנקטוניים שהושגו בעבר. מניחים מיד את כרית האגר הקטנה על גבי תערובת אמבה החיידקים המתאימה על פני צלחת הפטרי. לאחר מכן, הסר עודפי נוזלים על ידי פיפטינג עדין של עודפי נוזלים, והניח לתבשיל להתייבש במשך 20 דקות.

מכסים את התבשיל במכסה ומדגרים אותו בטמפרטורת החדר למשך 40 דקות נוספות. לבסוף, השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לרכוש תמונות עבור לפחות 100 תאי אמבה. בפרוטוקול זה נבדקה האלימות של תאי Pseudomonas aeruginosa פלנקטוניים ומחוברים לפני השטח.

סוג פרא המחובר לפני השטח Pseudomonas aeruginosa הרג אמבה המסומנת על ידי צורת תא אמבה עגולה ונוכחות פלואורסצנטית של קלצאין. בהשוואה לתאים פלנקטוניים, לסוג הבר המחובר לפני השטח Pseudomonas aeruginosa היה אינדקס הרג מארח גבוה. תאים פלנקטוניים נצרכו על ידי האמבה המצוינת על ידי צורות תאי האמבה האמורפיות והפלואורסצנטיות המועטה יחסית של קלצאין.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להשתמש במלאי טרי של תאי קלצין, AM ואמבה ולעקוב מקרוב אחר הצפיפות האופטית של האמבה. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו פרופיל שעתוק על מנת לענות על שאלות נוספות כמו אילו גנים מופעלים בתת-אוכלוסייה פלנקטונית? לאחר צפייה בסרטון זה אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע את בדיקת האלימות המהירה מבוססת התמונה.