Name: הכנת דוגמאות זחל דרוזופילה עבור גז כרומטוגרפיה-ספקטרומטריית (GC-MS)-מבוסס מטבולומיקס (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: למד הכנת דוגמאות זחלי Drosophila לניתוח מטבולומי מבוסס GC-MS. פרוטוקול זה מאפשר מדידה ישירה של למעלה מ-100 מטבוליטים בצורה רגישה וניתנת לשחזור לחקר מסלולים מטבוליים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

תודה לחברים של המתקן ספקטרוסקופיית מסה אוניברסיטת אינדיאנה, המתקן הליבה גליקומיקס אוניברסיטת יוטה לעזרה בארגון אופטימיזציה של פרוטוקול זה. J.M.T. נתמך על ידי הלאומית המכון כללי רפואי למדעים של מכוני הבריאות הלאומיים תחת פרס מספר R35GM119557.

<ol><li>Owusu-Ansah, E., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+metabolic+homeostasis+and+nutrient+sensing+in+Drosophila%3A+implications+for+aging+and+metabolic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Modeling metabolic homeostasis and nutrient sensing in Drosophila: implications for aging and metabolic diseases.</a> Disease Models & Mechanisms. 7 (3), 343-350 (2014).</li>
<li>Sieber, M. H., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+metabolic+states+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+%26+Development%22%5BJournal%5D)">The role of metabolic states in development and disease.</a> Current Opinion in Genetics & Development. 45, 58-68 (2017).</li>
<li>Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+studying+metabolism+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods for studying metabolism in Drosophila.</a> Methods. 68 (1), 105-115 (2014).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+larvae+synthesize+the+putative+oncometabolite+L-2-hydroxyglutarate+during+normal+developmental+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Drosophila larvae synthesize the putative oncometabolite L-2-hydroxyglutarate during normal developmental growth.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (6), 1353-1358 (2017).</li>
<li>Tennessen, J. M., Baker, K. D., Lam, G., Evans, J., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+Estrogen-Related+Receptor+Directs+a+Metabolic+Switch+that+Supports+Developmental+Growth%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">The Drosophila Estrogen-Related Receptor Directs a Metabolic Switch that Supports Developmental Growth.</a> Cell Metabolism. 13 (2), 139-148 (2011).</li>
<li>Nicholson, J. K., Lindon, J. C., Holmes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabonomics%27%3A+understanding+the+metabolic+responses+of+living+systems+to+pathophysiological+stimuli+via+multivariate+statistical+analysis+of+biological+NMR+spectroscopic+data%5BTitle%5D)+AND+%22Xenobiotica%22%5BJournal%5D)">Metabonomics': understanding the metabolic responses of living systems to pathophysiological stimuli via multivariate statistical analysis of biological NMR spectroscopic data.</a> Xenobiotica. 29 (11), 1181-1189 (1999).</li>
<li>Fiehn, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomics+-+the+link+between+genotypes+and+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Metabolomics - the link between genotypes and phenotypes.</a> Plant Molecular Biology. 48 (1-2), 155-171 (2002).</li>
<li>Cox, J. E., Thummel, C. S., Tennessen, J. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28684601">Metabolomic Studies in Drosophila.</a> Genetics. 206 (3), 1169-1185 (2017).</li>
<li>Lenz, E. M., Wilson, I. D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17269702">Analytical strategies in metabonomics.</a> Journal of Proteome Research. 6 (2), 443-458 (2007).</li>
<li>Pasikanti, K. K., Ho, P. C., Chan, E. C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gas+chromatography%2Fmass+spectrometry+in+metabolic+profiling+of+biological+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+B-Analytical+Technologies+in+the+Biomedical+and+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Gas chromatography/mass spectrometry in metabolic profiling of biological fluids.</a> Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 871 (2), 202-211 (2008).</li>
<li>Want, E. J., Nordstrom, A., Morita, H., Siuzdak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+exogenous+to+endogenous%3A+The+inevitable+imprint+of+mass+spectrometry+in+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">From exogenous to endogenous: The inevitable imprint of mass spectrometry in metabolomics.</a> Journal of Proteome Research. 6 (2), 459-468 (2007).</li>
<li>Garcia, A., Barbas, C. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/book/10.1007%2F978-1-61737-985-7">Metabolic Profiling: Methods and Protocols Vol. 708 Methods in Molecular Biology</a>. Metz, T. O. , Humana Press Inc. Totowa, Nj. 191-204 (2011).</li>
<li>Chan, E. C. Y., Pasikanti, K. K., Nicholson, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+urinary+metabolic+profiling+procedures+using+gas+chromatography-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Global urinary metabolic profiling procedures using gas chromatography-mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 6 (10), 1483-1499 (2011).</li>
<li>Dunn, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procedures+for+large-scale+metabolic+profiling+of+serum+and+plasma+using+gas+chromatography+and+liquid+chromatography+coupled+to+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 6 (7), 1060-1083 (2011).</li>
<li>Ashburner, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAshburner%2C+M+%22Drosophila%3A+A+Laboratory+Manual%22">Drosophila: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 171-178 (1989).</li>
<li>Biyasheva, A., Do, T. V., Lu, Y., Vaskova, M., Andres, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glue+secretion+in+the+Drosophila+salivary+gland%3A+a+model+for+steroid-regulated+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Glue secretion in the Drosophila salivary gland: a model for steroid-regulated exocytosis.</a> Developmental Biology. 231 (1), 234-251 (2001).</li>
<li>Lommen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MetAlign%3A+Interface-driven%2C+versatile+metabolomics+tool+for+hyphenated+full-scan+mass+spectrometry+data+preprocessing%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">MetAlign: Interface-driven, versatile metabolomics tool for hyphenated full-scan mass spectrometry data preprocessing.</a> Analytical Chemistry. 81 (8), 3079-3086 (2009).</li>
<li>Xia, J., Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+MetaboAnalyst+3.0+for+comprehensive+metabolomics+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Using MetaboAnalyst 3.0 for comprehensive metabolomics data analysis.</a> Current Protocols in Bioinformatics. 55, (2016).</li>
<li>Xia, J., Sinelnikov, I. V., Han, B., Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MetaboAnalyst+3.0-making+metabolomics+more+meaningful%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">MetaboAnalyst 3.0-making metabolomics more meaningful.</a> Nucleic Acids Research. 43 (W1), W251-W257 (2015).</li>
<li>Lommen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data+%28pre-%29processing+of+nominal+and+accurate+mass+LC-MS+or+GC-MS+data+using+MetAlign%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Data (pre-)processing of nominal and accurate mass LC-MS or GC-MS data using MetAlign.</a> Methods in Molecular Biology. 860, 229-253 (2012).</li>
<li>Xia, J., Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+MetaboAnalyst+3.0+for+comprehensive+metabolomics+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Using MetaboAnalyst 3.0 for comprehensive metabolomics data analysis.</a> Current Protocols in Bioinformatics. 55, (2016).</li>
<li>Xia, J., Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Web-based+inference+of+biological+patterns%2C+functions+and+pathways+from+metabolomic+data+using+MetaboAnalyst%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Web-based inference of biological patterns, functions and pathways from metabolomic data using MetaboAnalyst.</a> Nature Protocols. 6 (6), 743-760 (2011).</li>
<li>Li, H., Tennessen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+studying+the+metabolic+basis+of+Drosophila+development%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Methods for studying the metabolic basis of Drosophila development.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews Developmental Biology. 6 (5), (2017).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

גליקומיקס מספק הזדמנות ללא תחרות סקר את תגובות חילוף החומרים שמרכיבים את חילוף החומרים מתווך. הרגישות של טכנולוגיה זו, מעבד עם זאת, נתונים רגישים הרקע הגנטי, רמזים התפתחותית, ומגוון של לחצים סביבתיים, לרבות טמפרטורה, לחות, צפיפות אוכלוסין וזמינות חומר מזין. לכן, גבוהה איכות, לשחזור גליקומיקס ניתוח דורש כי הדגימות ייאספו בתנאים מבוקרים מאוד. בעוד מספר הדעת להדגיש את הנקודה3,8,23, כאן אנו מספקים שיטה צעד אחר צעד עבור איסוף הזחלים ...

זבוב הפירות דרוזופילה melanogaster התפתחה מערכת אידיאלי ללמוד את מנגנון מולקולרי שבו לווסת את חילוף החומרים מתווך. לא רק מסלולים מטבוליים רוב נשמרים דרוזופילה בין בני אדם, אלא מפתח חיישנים התזונתיים ואת הרגולטורים הצמיחה, כגון אינסולין, טור myc, פעילים גם לעוף1,2. כתוצאה מכך, דרוזופילה יכול לשמש כדי לחקור את הבסיס מטבולית של מחלות האדם ועד סוכרת והשמנה הקשורים ניוון מוחיים וסרטן. בהקשר זה, התפתחות הזחל דרוזופילה מספק את המסגרת אידיאלי שבו ללמוד תוכנית מטבולית גליקוליזה אירובי, או ורבורג. בדיוק כמו גידולים רבים להשתמש גליקוליזה אירובי כדי לייצר ביומסה של פחמימות, אז לעשות דרוזופילה הזחלים להפעיל גליקוליזה אירובי כדי לקדם צמיחה התפתחותית-3,-4,-5. אלה קווי דמיון בין זחל ואת חילוף החומרים הגידול להקים דרוזופילה כמו דוגמנית מפתח להבנה כיצד אירובי גליקוליזה הוא מוסדר ויוו.
למרות העובדה כי הזבוב התפתחה כמודל פופולרי עבור הלומדים את חילוף החומרים, רוב המחקרים דרוזופילה להסתמך על שיטות שנועדו למדוד מטבוליטים בודדים3, כגון טרהלוז, טריגליצרידים או ATP. מאז פרוטוקול מסוים נדרש כדי למדוד כל מטבוליט, מחקרים מבוססי assay הם עתירי עבודה, יקר, מוטה לכיוון את התרכובות הללו, שניתן למדידה באמצעות ערכות מסחריות. פתרון מגבלות אלה התפתחה מן התחום גליקומיקס, אשר מספק אמצעים יותר יעיל, לא משוחד של הלומדים דרוזופילה חילוף החומרים. בניגוד מחקר מבוסס-assay, ניתוח metabolomic יחיד יכול בו זמנית של מולקולה קטנה מטבוליטים מאות וכולן מספקות והיכרות מעמיקה של אורגניזם מצב מטבולי6,7. טכניקה זו התרחב באופן משמעותי את היקף לימודי מטבולית דרוזופילה ומייצג את העתיד של שדה המתעוררים זה8.
Metabolomic הלימודים מתנהלים בעיקר באמצעות שלוש טכנולוגיות: (i) תהודה מגנטית גרעינית (NMR), כרומטוגרפיה נוזלית (ii) מסות (LC-MS) ו- (iii) גז כרומטוגרפיה-ספקטרומטריית (GC-MS)9. בכל אחת מהגישות מציע יתרונות וחסרונות, ו כל הטכנולוגיות האלה שימשו ללמוד בהצלחה דרוזופילה חילוף החומרים. מאז המחקרים שנערכו במעבדה שלנו מתמקדת מטבוליטים קטן, קוטב, אנו מעסיקים בעיקר בשיטה מבוססת-GC-MS. GC-MS מספק למשתמש עם מספר רב של יתרונות, כולל הפארמצבטית גבוהה, שיא רזולוציה, רגישות, וגילה הזמינות של ספרייה ספקטרלי ההשפעה (EI) אלקטרון רגיל, המאפשר זיהוי מהיר של חילוף החומרים תכונות10,11. ההכנה של דגימות GC-MS, אולם, היא מורכבת למדי, דורש את תשומת לב רבה לפרטים. דוגמאות חייב להיות שנאספו, שטף, שקל, קפוא באופן במהירות המרווה תגובות חילוף החומרים. יתר על כן, הגופה לטוס עמיד בפני פרוטוקולים סטנדרטיים המגון ודורש טחנה חרוז כדי להבטיח מיצוי מטבוליט אופטימלית. לבסוף, דגימות נותחו על ידי GC-MS חייב לעבור derivatization כימי לפני זיהוי12. בעוד שיטות שפורסמו בעבר לתאר כל אלה13,3,השלבים14, פרוטוקול חזותי אשר יאפשרו למשתמש המתחיל להפיק reproducibly נתוני איכות גבוהה עדיין נדרשת. כאן נדגים כיצד להתכונן גליקומיקס GC-MS מבוססי ניתוח דגימות זחל דרוזופילה . פרוטוקול זה מאפשר למשתמש למדוד רבים של מטבוליטים קוטב קטנים שמרכיבים פחמן מרכזי חילוף החומרים reproducibly.

<table><tbody><tr><td>מולסה שחורה ללא גופרית</td><td>Good Food, INC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Drosophila Agar Type II</td><td>Genesee Scientific</td><td>66-103</td><td></td></tr><tr><td>Pyridine</td><td>EMD Millipore</td><td>PX2012-7</td><td></td></tr><tr><td>Methoxyamine hydrocholoride (MOX)</td><td>MP Biomedicals, LLC</td><td>155405</td><td></td></tr><tr><td>MSTFA עם 1% trimethylchlorosilane</td><td>Sigma</td><td>69478</td><td></td></tr><tr><td>פליישמן' s שמרים יבשים פעילים</td><td>AB מאורי מזון בע"מ</td><td>2192</td><td></td></tr><tr><td>6oz בקבוק מלאי Drosophila</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-130</td><td></td></tr><tr><td>תערובת הומוגניזציה של רקמות רכות (2 צינורות מ"ל)&nbsp;</td><td>אומני אינטרנשיונל</td><td>מק"ט:19-627</td><td></td></tr><tr><td>תוספת בקבוקון, 250 ומיקרו; L זכוכית מנוטרלת עם רגלי פולימר</td><td>Agilent</td><td>5181-8872</td><td></td></tr><tr><td>חומצה סוקסינית-2,2,3,3-d4</td><td>Sigma</td><td>293075</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac</td><td>Thermo&nbsp;</td><td>SC210A</td><td></td></tr><tr><td>o-חומצה זרחתית</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>A242-1</td><td></td></tr><tr><td>חומצה פרופיונית</td><td>Sigma</td><td>P5561</td><td></td></tr><tr><td>p-הידרוקסי חומצה בנזואית מתיל אסטר</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-258</td><td></td></tr><tr><td>חרוזים Ruptor</td><td>Omni International</td><td>מק"ט:19-040E</td><td></td></tr><tr><td>ThermoMixer F1.5</td><td>Eppendorf</td><td>5384000012</td><td></td></tr><tr><td>שייקר MultiTherm עם בלוק 24 X 12 מ"מ</td><td>Benchmark Scientific</td><td>H5000</td><td></td></tr><tr><td>מתנול</td><td>סיגמא</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>צינור צנטריפוגה 1.5 מ"ל</td><td>Eppendorf</td><td>22364111</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 35 X 10 מ"מ צלחת תרבית רקמות</td><td>Corning Incorporated</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>GC column</td><td>Phenomex</td><td>ZB-5MSi</td><td></td></tr></tbody></table>

הכנת דוגמאות זחל דרוזופילה עבור גז כרומטוגרפיה-ספקטרומטריית (gc-ms)-מבוסס מטבולומיקס

Preparation of Drosophila Larval Samples for Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS)-based Metabolomics

ההתקדמות בתחום גליקומיקס הקימו זבוב הפירות דרוזופילה melanogaster כמודל גנטי רב עוצמה עבור הלומדים חילוף החומרים בעלי חיים. על ידי שילוב המערך העצום של כלים גנטיים דרוזופילה עם היכולת סקר כ"שטח נוף פתוח של חילוף החומרים מתווך, בגישה גליקומיקס יכול לחשוף לאינטרקציות מורכבות בין דיאטה, גנוטיפ, אירועי חיים-היסטוריה רמזים סביבתיים. בנוסף, מחקרים גליקומיקס ניתן לגלות מנגנונים אנזימטי הרומן, לחשוף קשרים ידועים בין מסלולים מטבוליים שונים לכאורה. על מנת להקל על השימוש הנרחב יותר של טכנולוגיה זו בקרב הקהילה דרוזופילה , כאן אנחנו מספקים. פרוטוקול מפורט המתאר כיצד להתכונן דגימות זחל דרוזופילה ספקטרומטריית גז כרומטוגרפיה (GC-MS)- metabolomic המבוססת על ניתוח. פרוטוקול שלנו כולל תיאורים של איסוף הדגימה זחל, מטבוליט החילוץ, derivatization כימי וניתוח GC-MS. סיומו המוצלח של פרוטוקול זה יאפשר למשתמשים למדוד את השפע היחסי של מטבוליטים קוטב קטנים, כולל חומצות אמינו, סוכרים, חומצות אורגניות מעורב גליקוליזה את מחזורי TCA.

לקטט דהידרוגנאז מוטציות (dLDH), שחסרה פעילות dLDH4ופקדים מתאימים מבחינה גנטית נאספו כ אמצע-L2 הזחלים ומעובדים על-פי הפרוטוקול המתואר לעיל. בהשוואה עם פקדים, הזחלים מוטציה התערוכה שינויים משמעותיים לקטט פירובט, L-2-hydroxyglutarate4. ספקטרה נרכשו עם מערכת Agilent GC6890-5973i MS. דוגמה של ספקטרום GC-MS ליצור עם פרוטוקול שלנו מוצג באיור1. ישנם תכונות גלויות רבות, רווי לשיא הבולטים של טרהלוז, אשר בדרך כלל ...

פרוטוקול זה מתאר כיצד להתכונן הרימות דרוזופילה metabolomic GC-MS מבוססי ניתוח.

הכנת דוגמאות זחל דרוזופילה עבור גז כרומטוגרפיה-ספקטרומטריית (GC-MS)-מבוסס מטבולומיקס

Recent advances in the field of metabolomics have established the fruit fly Drosophila melanogaster as a powerful genetic model for studying animal ...

שיטה זו יכולה לענות על שאלות מפתח בתחום חילוף החומרים, כגון כיצד מסונתז האונקומטבוליט L2-הידרוקסיגלוטראט בתאים בריאים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת למשתמש למדוד ישירות למעלה מ-100 מטבוליטים בצורה רגישה וניתנת לשחזור. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שהפרוטוקול דורש עיבוד דגימה יעיל ורגיש ביותר לאדי מים.כדי להתחיל בפרוטוקול, הוסף מיליליטר אחד של 0.9% נתרן כלורי קר כקרח לתוך צינור של 1.5 מיליליטר המכיל זחלים שהוכנו בעבר. סגור את המכסה, הפוך אנכית את הצינור כדי לשטוף היטב את הזחלים, והנח את הצינור על קרח למשך 30 שניות. הזחלים ישקעו לתחתית הצינור, אך השמרים יישארו בתלייה.לאחר שכל הזחלים יצרו גלולה רופפת, הסר את תמיסת הנתרן כלורי באמצעות פיפטה של מיליליטר אחד. צנטריפוגה את הדגימות ב -2, 000 גרם למשך דקה אחת בארבע מעלות צלזיוס. הסר את כל התמיסה הנותרת באמצעות פיפטה של 200 מיקרוליטר, והקפיא מיד את הדגימה בחנקן נוזלי.השתמש בטוש חסין אתנול כדי לתייג את הצד של צינור חרוז עם מכסה בורג של שני מיליליטר. לאחר מכן, טרדו את המסה של צינור החרוז המסומן באמצעות איזון אנליטי המסוגל למדוד במדויק 0.01 מיליגרם. השתמש במלקחיים ארוכים כדי להסיר את צינור הדגימה של 1.5 מיליליטר ממחסור החנקן הנוזלי.לבשו כפפות ניטריל, תפסו את הצינור הקפוא, הפכו אותו ודפקו בחדות את מכסה הצינור על הספסל כדי לעקור את הכדור הקפוא. שפכו מיד את הגלולה לתוך צינור חרוז מכסה בורג של שני מיליליטר זפת מראש. יש לעבד את הדגימה במהירות כדי להבטיח שמסלולים מטבוליים אנדוגניים לא יופעלו מחדש.מדוד במהירות את המסה המשולבת של גלולת הזחל וצינור החרוז. הנח מיד את צינור הדגימה לחנקן נוזלי. הנח את צינורות הדגימה במקרר ספסל שלילי של 20 מעלות צלזיוס.הוסף 0.8 מיליליטר של 90% מתנול מקורר מראש המכיל שני מיקרוגרם למיליליטר של חומצה סוקסינית-D4 לכל שפופרת. החזר את הדגימות למקרר הספסל השלילי של 20 מעלות צלזיוס. הגדר בקרה שלילית על ידי הוספת 0.8 מיליליטר של 90% מתנול מקורר מראש המכיל שני מיקרוגרם למיליליטר של חומצה סוקסינית-D4 לתוך שפופרת חרוזים ריקה.לאחר מכן, הומוגניזציה של הדגימות למשך 30 שניות במהירות של 6.45 מטר לשנייה באמצעות הומוגנייזר טחנת חרוזים הממוקם בחדר בקרת טמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. החזירו את הדגימות ההומוגניות למקרר הספסל השלילי של 20 מעלות צלזיוס, והעבירו את הצידנית למקפיא שלילי של 20 מעלות צלזיוס למשך שעה לפחות. לאחר הדגירה, צנטריפוגה את הצינורות ב -20, 000 גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי להסיר את המשקעים שנוצרו.העבירו 600 מיקרוליטר של הסופרנטנט לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש בנפח 1.5 מיליליטר, ואל תפריעו למשקעים. פתח את כל צינורות הדגימה והנח אותם בצנטריפוגת ואקום. יבש את הדגימות בטמפרטורת החדר עד להסרת כל הממס.אם הדגימות המיובשות אוחסנו בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס, הניחו צינורות דגימה שלא נפתחו בצנטריפוגת ואקום וייבשו אותם למשך 30 דקות. הכינו תמיסה של 40 מיליגרם למיליליטר מתוקסילאמין הידרוכלוריד, או MOX, בפירידין נטול מים. אחסן את ה-MOX והפירידין בחומר ייבוש.לאחר מכן, השתמש באקדח חום לייבוש מזרק זכוכית של מיליליטר למשך כחמש שניות. הכנס את מחט המזרק לבקבוק הפירידין נטול המים. הסר מיליליטר אחד של פירידין, והוסף אותו לשפופרת מיקרופוגה המכילה 40 מיליגרם MOX.חלק זה של הפרוטוקול רגיש מאוד למים. יש לאחסן את כל הריאגנטים בחומר ייבוש לפני השימוש. בנוסף, על המשתמש לוודא שלדגימה יש חשיפה מינימלית לאדי מים אטמוספריים.לאחר מכן, שטפו את בקבוק הפירידין נטול המים בארגון. אוטמים את הבקבוק ומחזירים אותו למייבש. ממיסים את ה-MOX בפירידין על ידי דגירה של הצינור במיקסר תרמי ב-35 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ב-600 סל"ד.לאחר מכן, הוסף 40 מיקרוליטר של 40 מיליגרם למיליליטר MOX בתמיסת פירידין נטולת מים לדגימה המיובשת. מערבל את הדגימה למשך 10 שניות, וצנטריפוגה קצרה. לאחר מכן, דגרו את הדגימה במיקסר תרמי.צנטריפוגה את הדגימה במהירות של 20, 000 גרם או במהירות מקסימלית למשך חמש דקות כדי להסיר את חומר החלקיקים. העבירו 25 מיקרוליטר של הסופרנטנט לבקבוקון דגימה אוטומטית עם תוספת מיקרו-נפח זכוכית מושבתת של 250 מיקרוליטר. הוסף 40 מיקרוליטר של MSTFA המכיל 1% TMCS.הניחו מכסה על בקבוקון הדגימה האוטומטית, ואטמו את הבקבוקון באמצעות כלי מלחץ. דגרו את הדגימה ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה עם ניעור ב-250 סל"ד. לבסוף, הוסף שלושה מיקרוליטרים של תמיסת חומצת שומן מתיל אסטר סטנדרטית, או FAMES, שהוכנה בעבר, לבקבוקון הדגימה האוטומטית באמצעות דגימה אוטומטית רובוטית מיד לפני ההזרקה.כרומטוגרפיית גז-ספקטרומטריית מסה של זחלים מוטנטיים של לקטט דהידרוגנאז מציגים שינויים משמעותיים בלקטט, פירובט ו-L2-הידרוקסיגלוטראט בהשוואה לזחלי ביקורת. ספקטרום ה-GC-MS שנוצר עם הפרוטוקול מראה תכונות גלויות רבות ושיא בולט עבור טרהלוז, המייצג בדרך כלל את השיא הגדול ביותר בדגימת זחל. ניתוח רכיבים עיקריים, או PCA, מראה בבירור שקבוצות הנוקאאוט והפרא נפרדות זו מזו וכי אין חריג באף אחת מהקבוצות.בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשמור את הדגימות קפואות לפני ההומוגניזציה ולשמור על כל הריאגנטים יבשים לאורך כל ההליך.

preparation-drosophila-larval-samples-for-gas-chromatography-mass

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

פרופיל איזוטופים יציבים ידי ניתוח כרומטוגרפיה מסת הגז spectrometric של השטף מטבולית מתווך מתואר...

פרופיל איזוטופים יציבים של שטף מטבולית מתווך בשלב פיתוח למבוגרים Caenorhabditis elegans</em

אנו מתארים כאן את ההליכים למיצוי והטיהור של mRNA ומטבוליטים...

טיהור של תמלילים ומטבוליטים מ<em&gt; דרוזופילה</em&gt; ראשים

מיטוכונדריה ממלאים תפקידים מרכזיים בוויסות חילוף החומרים וההומאוסטזיס. שינויים עדינים במטבוליזם המיטוכונדריאלי המשפיעים על הפיזיולוגיה של האורגניזם עשויים להיות קשים לאיתור במחקרי מטבולומיקה של אורגניזמים שלמים. כאן אנו מתארים שיטת בידוד המשפרת את הזיהוי של שינויים מטבוליים עדינים בדרוזופילה מלנוגסטר.

הכנת הברים מועשר מיטוכונדריאלי לניתוח חילוף חומרים ב<em&gt; דרוזופילה</em

מטרת פרוטוקול זה היא לספק גישה פשוטה וזולה לאיסוף עוברים תסיסנית בקנה מידה בינוני (0.5-1 גרם) והכנת תמציות חלבון שניתן להשתמש ביישומים proteomic במורד הזרם, כגון זיקה טיהור ספקטרומטריית מסה (AP-MS ).

הכנה בינונית של<em&gt; תסיסנית</em&gt; עוברי תמציות עבור ניסויים פרוטאומיים

עובדים מינור של המין נמלה Colobopsis explodens ביתר כדי לבודד את התוכן כמו שעווה המאוחסן שלהם מאגרים בלוטת mandibular מתעצם הממס-מיצוי הבאים וניתוח על ידי גז כרומטוגרפיה-ספקטרומטריית. ביאור וזיהוי של המרכיבים נדיף בתוכנות קוד פתוח MetaboliteDetector מתואר גם.

בידוד של בלוטת Mandibular תוכן המאגר של אפור פרווה "פיצוץ של הנמלים (Formicidae) לניתוח Volatilome על ידי GC-MS ו- MetaboliteDetector

פרוטוקול זה מתאר שיטה לגידול בקנה מידה גדול Caenorhabditis elegans במדיה מוצק. כחלופה תרבית נוזלית, פרוטוקול זה מאפשר קבלת הפרמטרים של סולמות שונים המעובדים המבוסס על צלחת. פעולה זו מגדילה את comparability של תוצאות על-ידי השמטת את ההבדלים מטבולית מורפולוגיים בין תרבות המדיה נוזלי ומוצק.

מבוסס על צלחת Large-scale טיפוח Caenorhabditis elegans: הכנת הדוגמא על המחקר של שינויים מטבוליים בחולי סוכרת

פרוטוקול זה מתאר תפוקת יחיד של שיטות אנליטיות, טכנולוגיות משלימים לשיאה אפיון מלא-זוגי של חומר אורגני טבעי, פרוטאומיקס מיקרוביאלית של מערכות אקולוגיות. גישה זו מאפשרת השוואות חזקים לזיהוי מסלולים מטבוליים והעתקות חשוב המתאר הפקת גז חממה, חיזוי תגובות השינוי הסביבתי.

יחיד-תפוקה משלימים שיטות אנליטיות ברזולוציה גבוהה עבור אפיון תערובות מורכבות חומר אורגני טבעי

בפרוטוקול זה אנו מציגים זרימת עבודה ממוטבת, המשלבת הכנת דגימות יעילה ומהירה של דגימות רבות. בנוסף, אנו מספקים מדריך שלב אחר שלב להפחתת וריאציות אנליטיות להערכת תפוקה גבוהה של מחקרי GWAS מטבוליים.

מחקרי אסוציאציה רב-גנומית בקנה מידה גדול (Mo-GWAS): קווים מנחים להכנת דגימות ונורמליזציה

מטרת פרוטוקול זה היא לספק הדרכה מפורטת על הכנת דגימה נכונה לניתוח שומנים ומטבוליטים ברקמות קטנות, כגון מוח דרוזופילה , באמצעות הדמיית ספקטרומטריית מסות בסיוע מטריצה.

הכנת דגימה לניתוח שומנים מהיר במוח דרוזופילה באמצעות הדמיית ספקטרומטריית מסה של ספיחה/יינון בלייזר בסיוע מטריצה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד רקמת האשכים של דג הזברה הזחל, אשר יקל על חקירות של בידול מין דג הזברה ותחזוקה.

דיסקציה של רקמות הזחל דג הזברה האשכים

למד הכנת דוגמאות זחלי Drosophila לניתוח מטבולומי מבוסס GC-MS. פרוטוקול זה מאפשר מדידה ישירה של למעלה מ-100 מטבוליטים בצורה רגישה וניתנת לשחזור לחקר מסלולים מטבוליים.

הכנת דוגמאות זחל דרוזופילה עבור גז כרומטוגרפיה-ספקטרומטריית (GC-MS)-מבוסס מטבולומיקס

גלה סרטונים נוספים