טיפ פיפטה המבוסס על שיטה עבור תאים זריעה על פלטפורמות Microfluidic רביב

שילוב מתודולוגיה זו עם מיקרופלואידים מבוססי טיפות מסייע לענות על שאלות מפתח הקשורות לתחום אימונולוגיה של מערכות לקוד הטרוגניות תאית ותקשורת בין תאים בודדים או פתוגנים. היתרון העיקרי של טכניקה זו שפיתחנו הוא, כי הליך טעינת קצה זה מאפשר אנקפסולציה של תאים נדירים טיפות תואמים באופן הדוק את התפלגות האחוזים החזויה. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית להבנת אופן השימוש בטיפות פיפטה כדי לטעון תאים לטיפות מגדריות ולאחזר תאים מהטיפות.

להעמסת טיפות עבור ייצור טיפות מים, ראשית להוסיף שלושה מיליליטר של פעילי שטח לשני מיליליטר של שמן קמח ולמשוך את תערובת שלב השמן לתוך מזרק 2.5 מיליליטר. מוציאים את כל בועות האוויר מהמזרק ומחברים את המזרק לחתיכת צינורות טפלון באורך מתאים. טוענים שני מזרקים לדוגמה בשמן מינרלי דו-תואם מתאים, ומחברים את המזרק לחתיכה שנייה של צינורות טפלון באורך מתאים.

לאחר מכן, ניקוב תקע Polydimethylsiloxane או PDMS בקוטר חמישה מילימטר מלוח EDMS נרפא, וניקוב חור של מילימטר אחד במרכז התקע. הכנס את התקע בחוזקה לקצה העליון של קצה פיפיאט של 200 מיקרוליטר והכנס את הצינור המחובר למזרק שמן מינרלי דו-תואם לתקע. לדכא את הבוכנה מזרק לאט כדי למלא את פיפטה קצה עם שמן מינרלי דוחף את כל האוויר שיורית.

מניחים בזהירות הן מזרקים מדגם מזרק שמן קמח, על משאבת מזרק. כאשר כל האוויר הוסר, להוריד כל טיפ פיפטה לתוך פתרון המדגם לשופע כ 100 microliters של דגימת תא לתוך הטיפים. לאחר מכן, הכנס את שני קצות הפיפיטים המכילים מדגם לשני הכניסות הפנימיות הפנימיות של שבב PDMS והכנס את הצינור המכיל את תערובת שלב השמן לתוך הכניסה החיצונית.

הגדר את שיעורי הזרימה במשאבת המזרק כמצוין והזן והגדר את הממדים של כל מזרק. הפעל את המשאבה כדי לשטוף את פתרון הדגימה דרך הערוצים הפנימיים של המכשיר, ואת שלב השמן דרך הערוץ החיצוני של המכשיר. ואז לחבר חתיכת צינורות של אורך מתאים לשקע כדי להתחיל לאסוף את טיפות כאשר היווצרות טיפה יציבה, איסוף טיפות בצינור מנעול.

כאשר כל טיפות נאספו, להוסיף 200 microliters של מדיום RPMI, ללא סרום, על גבי טיפות דגירה המדגם עם החור על המכסה של צינור המנעול לתקופת הזמן הניסיונית המתאימה. לשבירת אמולסיה, ראשית להוסיף שני מיליליטר של PFO לשמונה מיליליטר של שמן flouinated ולהשתמש מזרק כדי להסיר את השמן העודף מתחתית צינור איסוף טיפה. לאחר מכן הוסיפו 100 מיקרוליטרים של פתרון 20%PFO לאמולסה כדי לשחרר את התאים המוקפצים לשלב המים, והקש על הצינור לזמן קצר כדי לערבב.

אל תשכח כי PFO יכול להזיק לתאים. ולכן, לשמור על קשר עם PFO למינימום. לאחר דקה עד שתי דקות, סובב את הפתרון בכוח הצנטריפוגלי היחסי הנמוך ביותר האפשרי למשך 30 שניות והעבר מיד 550 מיקרוליטרים של השבר המים לצינור נעול חדש המכיל 500 מיקרוליטרים של PBS קר, בתוספת 2% סרום עגל עוברי, או FCS.

תן לכל שאריות שמן לשקוע לתחתית צינור הנעילה החדש ולהעביר בזהירות 950 מיקרוליטרים של התא המכיל שלב מיוודי לצינור נעילה חדש. ודא כי השמן לא מועבר יחד עם השלב הממימי לתוך צינור הנעילה החדש. לאחר מכן לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה מחדש להשעות את גלולה ב 300 microliters של PBS קר טרי בתוספת 2%FCS.

באמצעות גישת טעינת קצה כפי שהודגם רק, שיעורי אנקפסולציה תא Jurkat T בד בבד עם הערכים החזויים סטטיסטית ניתן להשיג. למרבה הפלא, אפילו עם תאים חסידים כמו תאים סרטניים, אשר נוטים לגוש, או תאים נדירים כגון תאים דנדריטיים plasmacytoid, יעילות אנקפסולציה משופרת נצפתה. במהלך אנקפסולציה מייצגת זו, טיפות מחדש באמצעות טמפרטורת gelling אולטרה נמוך agarose ו gelled לאחר הייצור כדי ליצור גם הידרוג'ל אגרוז שאיפשר ניתוח במורד הזרם הבאים באמצעות מיקרוסקופיה וציטומטריה זרימה.

ניתוח מיקרוסקופי גילה כי זיווג תאים הושג בשילובים שונים המעידים על זיווג וניתוח של תאי תפוקה גבוהים וניתוח של אותה אוכלוסייה של חרוזי הידרוג'ל על ידי ציטומטריית זרימה, גילה כי ניתן להפריד חרוזים ללא תאים מהחרוזים עם תאים המבוססים על דפוסי פיזור ברורים קדימה וצד. ואכן, גת על אוכלוסיית חרוזים ללא תאים אישר חוסר אנקפסולציה של תאים על ידי היעדר אותות פלואורסצנטיים תוך gating על אוכלוסיית חרוזים עם תאים גילה את קיומו של אוכלוסיות משנה מרובות המעידות על אנקפסולציה של תאים אחרים שכותרתו Jurkat T. בעת עבודה עם שיטה זו, חשוב לזכור כי ריכוז התא הוא גורם מגביל, ויש למטב כדי לבטח אנקפסולציה יעילה של תאים וזוג תאים.

בעקבות הליך זה, לא רק תא אחד או שניים ניתן לכלול טיפות עם יעילות גבוהה, אבל תאים מרובים, או סוגי תאים, ניתן encapsulated עבור שכפול מדויק יותר של סביבת מיקרו הסלולר. טכניקה זו תסלול את הדרך לחוקרים בתחומי האימונולוגיה והדיסציפלינות הקשורות לניצול אופטימלי של אוכלוסיות תאי צלקת ועכום יעיל שלהם טיפות, כדי לחקור התנהגות תאית בסביבה נטולת רעש.