Name: בחיי עיר טכניקות הכלאה פרפין-מוטבע דגימות אלמוגים למבוגרים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: למד הכלאה in situ בדגימות אלמוגים מוטבעות פרפין לחקר ביטוי גנים ברקמות ותאים ספציפיים. שיטה זו מספקת מידע חזותי על ביטוי RNA ומאפשרת הבנה מעמיקה של ביולוגיית אלמוגים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומן על ידי פרס אין. OCE-1323652 דרך no.1012629 הלאומי למדע קרן האוקיינוס המדע בתר ופרס מתוכנית בורוז Wellcome קרן פוסט-דוקטורט העשרה.

1. הסרת פרפין
שים לב: בצע את השלבים הבאים תחת ברדס fume.
<ol><li>Dewax דק-למחלקה פרפין-מוטבע השקופיות. עם 100% קסילן מתחת למכסה המנוע בצנצנות זכוכית Coplin למשך 10 דקות. אל תשתמש/י צנצנות פלסטיק Coplin, כפי קסילן נמס פלסטיק. לעקר את הצנצנות Coplin ב החיטוי לפני השימוש.</li>
	<li>הכינו ארבע צנצנות זכוכית סטריליים Coplin את הפעולות הבאות: אתנול 100%, 80% אתנול, אתנול 70% ו-60% אתנול. לדלל האתנול עם RNase ללא מים.<ol>
<li>להעביר את השקופיות הצנצנת Coplin זכוכית סטריליים עם 100% אתנול, להשרות אותם למשך 10 דקות. לאחר 10 דקות, לרוקן את צנצנת הזכוכית Coplin והחלף חדש 100% אתנול. משרים את השקופיות שוב למשך 10 דקות.</li>
		<li>להעביר את השקופיות הצנצנת Coplin זכוכית סטריליים עם 80% אתנול עבור 1 דקות.</li>
		<li>להעביר את השקופיות הצנצנת Coplin זכוכית סטריליים עם אתנול 70% עבור 1 דקות.</li>
		<li>להעביר את השקופיות הצנצנת Coplin זכוכית סטריליים עם 60% אתנול עבור 1 דקות.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. רעלני של שקופיות עבור הכנה של RNA בדיקה הכלאה
<ol><li>לבצע את מנקי הבאים בטמפרטורת החדר, אלא אם צוין אחרת. מבצע בטמפרטורת החדר-מנקי תפקודי לב / נשימה במהירות איטית. להשתמש את פרסומי שקופית סטרילי עם חדר עבור שקופיות עד חמישה לשטיפת מכוניות של השקופיות.</li>
	<li>להעביר את השקופיות למבוטחים שקופית סטרילי עם 18 מ ל 1 x buffered פוספט תמיסת מלח (PBS). לרחוץ למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>יוצקים את מגניב 1 x, ולטפל באופן מיידי הרקמה בשקופיות עם proteinase K כדי לאפשר חדירה בדיקה של הרקמה. להוסיף כ 18 מ של proteinase K פתרון מיילר שקופית (ראה טבלה 1 לעבודה פתרון ריכוז). דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. אל תלחץ.<ol>
<li>בזמן, השקופיות הן המקננת להכין מאגר prehybridization (מאגר Prehybe). למקם את המאגר Prehybe באמבט מים רותחים למשך 10 דקות ולאחר מכן מגניב על אמבטיית קרח למשך 5 דקות. לקבלת מתכון של מאגר Prehybe, ראה טבלה 1.</li>
		<li>העיכול של התגובה proteinase K שמוציא את הפתרון proteinase K, ולקבל מיד להוסיף 18 מ של 0.2% גליצין-PBS פתרון מיילר שקופיות. תן את מיילר שקופית לשבת בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.</li>
		<li>שופכים את הפתרון גליצין-PBS 0.2% ולהוסיף mL 18 בפתרון נתרן מלוחים ציטראט (האס) 2 x מיילר כל שקופית. לשטוף את השקופיות 2 x SSC 10 דקות בטמפרטורת החדר, עם רועדת במהירות של 100-150 סל ד.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. prehybridization של שקופיות לקראת בדיקה RNA הכלאה
<ol><li>בזמן שהשקופיות להיות נשטפים עם 2 x SSC, להשיג למבוטחים סטרילי שקופית חדשה ולשים כ 18 מ של מאגר Prehybe לתוך מיילר שקופיות. מקם את מיילר שקופיות לתוך התנור הכלאה בטמפרטורת הכלאה. הערה: הטמפרטורה הכלאה תלויות המכשיר בשימוש אבל בדרך כלל נע בין 50-60 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>עם סיום לשטוף את x SSC 2, שופכים את 2 x האס, והמקום השקופיות בתוך מיילר שקופית במאגר Prehybe בתנור הכלאה לשעה.</li>
</ol>4. הכלאה של המכשיר RNA
<ol><li>בעוד השקופיות הן המקננת עם המאגר Prehybe בתנור הכלאה, להכין פתרון הכלאה-בדיקה.<ol>
<li>לדלל כל בדיקה במאגר הכלאה (0.5 µL של בדיקה עם µL 24.5 הכלאה מאגר). הערה: המתכון הכלאה המאגר נמצא בטבלה 1. דוגמה של ריכוז והכנה של המכשיר ניתן למצוא טריילור-נואלס. et al. 11.</li>
		<li>למקם את המכשיר מדולל בבלוק חום 86-90 מעלות צלזיוס במשך 12 דקות, ואז להתקרר למשך 1 דקות על קרח.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להסיר את מיילר שקופית מהתנור הכלאה ולהסיר באופן אינדיבידואלי שקופיות מיילר שקופיות באמצעות פינצטה סטרילי. להניח את השקופיות על מגבת נייר, בזהירות. תנגב את מאגר עודף Prehybe סביב דגימות רקמה. להיזהר לא לגעת הדגימות, ועבודה במהירות כדי למנוע התייבשות דגימות רקמה.</li>
	<li>להקיף את הרקמה עם עט PAP. להחיל µL 25 בפתרון בדיקה מדולל עם פיפטה ולכסות את הדגימה עם coverslip פלסטיק.<ol>
<li>מקם את הדגימות בבית הבליעה לחות שקופיות עם 4 x האס + 50% פתרון formamide בחלק התחתון של החדר.</li>
		<li>ברגע הגששים נוספו כל השקופיות, מקום תא לחות שקופיות לתוך התנור הכלאה לפחות 24 שעות בטמפרטורה הכלאה של 50-60 מעלות צלזיוס. זמן הדגירה יכולה להשתנות בהתאם הריכוז של המכשיר, אבל צריך להיות מינימום של 24 שעות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לאחר דגירה לילה עם הגששים מדולל, להסיר תא לחות שקופית מהתנור הכלאה.<ol>
<li>הסר כל אחת מהשקופיות, נזהר לא לעקור את רקמת coverslips. פיפטה µL 1000, להוסיף 1000 µL של פתרון x SSC 2, בעדינות לשטוף את השקופית.</li>
		<li>מקם את השקופית למבוטחים שקופית סטרילי עם 18 מ של x SSC 2, לפתרון 5 דקות בטמפרטורת החדר. שופכים את הפתרון ולהחליף אותו עם 18 מיליליטר 2 טריים x SSC. חזור על הדגירה שוב עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר עם טלטול עדין.</li>
		<li>יוצקים את הפתרון x SSC 2. להוסיף 18 מ של 1 x SSC פתרון ושטוף במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. שופכים את הפתרון x SSC 1 ולהחליף אותו עם 18 מ ל 1 טרי x SSC. חזור על הדגירה עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר עם טלטול עדין.</li>
		<li>שופכים את 1 x SSC. להוסיף מ 18 ל 0.5 x האס ושטוף במשך 10 דקות ב 42 ° C ללא רועד. שופכים את 0.5 x האס והחלף אותו עם 18 מ של 0.5 טרי x SSC. לשטוף שוב 10 דקות ב 42 ° C ללא רועד.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. ויזואליזציה של המכשיר RNA
הערה: המדגימה את החללית, מוניטור סגול ייעשה שימוש בתהליך הפיתוח. עם זאת, לפני שלב זה, מספר שוטף נדרשים להכין את הדגימות מכתים.
<ol><li>לשטוף את השקופיות 18 מ ל מאגר phosphatase אלקליין (AP-מאגר) ללא MgCl2 ב 1 מינימלית שופכים AP-למאגר מבלי MgCl2, ולהוסיף mL 18 1 x Boehringer-מנהיים חסימה מאגר מדולל עם חומצה maleic מאגר. תקופת דגירה של פחות שעה בטמפרטורת החדר למבוטחים שקופיות עם טלטול עדין. הערה: מאגר חסימה Boehringer-מנהיים ומאגר חומצה maleic השתמשו היו premade ורכש החפירה לשטוף, להגדיר מאגר בלוק (זמין מסחרית).<ol>
<li>לחלופין, ניתן לבצע הדגירה למשך הלילה ב 4 ° C. תקופה עוד חסימה יעמעם את המראה של איגוד שאינם ספציפיים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להכין mL 20 של קטעים Fab anti-digoxigenin-AP החפירה מדולל (נוגדן אנטי החפירה = 2 µL של נוגדן אנטי החפירה + 20 מ ל 1 x מאגר חסימה Boehringer-מנהיים). זה מספיק לשימוש במיילר פלסטיק שקופית 1 יותר של פתרון זה חייב להיות מוכן אם אחד או יותר מיילר שקופית כדי לשמש.</li>
	<li>מוסיפים נוגדן אנטי החפירה למבוטחים סטרילי שקופית חדשה, להעביר את השקופיות מיילר שקופיות עם הפתרון נוגדן אנטי החפירה. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 3 שעות עם טלטול עדין.</li>
	<li>לאחר דגירה, שופכים הנוגדן אנטי החפירה ולשטוף את השקופיות ב מיילר שקופית 18 מ ל AP-מאגר ללא MgCl2 עבור חמש דקות עם טלטול עדין.</li>
	<li>שופכים את AP-המאגר ללא MgCl2, ולהוסיף מ 18 ל AP-Buffer. רחץ במשך חמש דקות עם טלטול עדין. לאחר 5 דקות הדגירה, יוצקים את המאגר AP, להחליף אותו עם 18 מ ל AP טריים-מאגר, לשטוף במשך חמש דקות עם טלטול עדין.</li>
	<li>בחושך, שופכים את AP-המאגר ולהוסיף 18 מ של מוניטור סגול מיילר שקופיות. דגירה השקופיות בטמפרטורת החדר בחושך, בדיקת לפיתוח צבע סגול שכל זמני התגובה ה ½ להמחשת ישתנו בהתבסס על החללית זה מפותח. הערה: במקום מוניטור סגול ויזואליזציה, פיתוח פתרון יכול להתבצע באמצעות 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) ו- tetrazolium ניטרו כחול (NBT). לקבלת הוראות, ראה טבלה 1 .</li>
	<li>לעצור התפתחות צבע על ידי העברת השקופיות למבוטחים סטרילי שקופית חדשה עם mL 18 טריס-EDTA (TE) המאגר עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר, בחושך.</li>
	<li>יוצקים את המאגר טה ולהוסיף 18 מיליליטר מים נטולי RNase מיילר שקופיות ו בשביל 1 דקות, בחושך.</li>
	<li>הסר את השקופיות מן המים, לייבש אותם בקצוות של הרקמה. להוסיף גליצרול הרכבה בינונית ומניחים על coverslips. אחסן את השקופיות ב 4 ° C עד תמונות מוכן לקחת.</li>
</ol>

<ol><li>Hughes, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Climate+Change%2C+Human+Impacts%2C+and+the+Resilience+of+Coral+Reefs%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Climate Change, Human Impacts, and the Resilience of Coral Reefs.</a> Science. 301 (5635), 933(2003).</li>
<li>Chen, P. -Y., Chen, C. -C., Chu, L., McCarl, B. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0959378014001782">Evaluating the economic damage of climate change on global coral reefs.</a> Global Environmental Change. 30 (Supplement C), 12-20 (2015).</li>
<li>Hoegh-Guldberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coral+Reefs+Under+Rapid+Climate+Change+and+Ocean+Acidification%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Coral Reefs Under Rapid Climate Change and Ocean Acidification.</a> Science. 318 (5857), 1742(2007).</li>
<li>Grasso, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+identifies+candidate+genes+for+key+roles+in+coral+development%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis identifies candidate genes for key roles in coral development.</a> BMC Genomics. 9 (1), 540(2008).</li>
<li>Miller, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+innate+immune+repertoire+in+Cnidaria+-+ancestral+complexity+and+stochastic+gene+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">The innate immune repertoire in Cnidaria - ancestral complexity and stochastic gene loss.</a> Genome Biology. 8 (4), R59(2007).</li>
<li>Shinzato, C., Iguchi, A., Hayward, D. C., Technau, U., Ball, E. E., Miller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox+genes+in+the+coral+Acropora+millepora%3A+divergent+expression+patterns+reflect+differences+in+developmental+mechanisms+within+the+Anthozoa%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Evolutionary+Biology%22%5BJournal%5D)">Sox genes in the coral Acropora millepora: divergent expression patterns reflect differences in developmental mechanisms within the Anthozoa.</a> BMC Evolutionary Biology. 8 (1), 311(2008).</li>
<li>Anctil, M., Hayward, D. C., Miller, D. J., Ball, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+and+expression+of+four+coral+G+protein-coupled+receptors+distinct+from+all+classifiable+members+of+the+rhodopsin+family%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Sequence and expression of four coral G protein-coupled receptors distinct from all classifiable members of the rhodopsin family.</a> Gene. 392 (1-2), 14-21 (2007).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22In+situ+hybridization+protocols%22">In situ hybridization protocols</a>. Darby, I. A., Hewitson, T. D. , Humuna Press. Towtowa, New Jersey. (2006).</li>
<li>Valentino, K. L., Eberwine, J. H., Barchas, J. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aValentino%2C+KL+%22In+situ+hybridization%22">In situ hybridization</a>. , Oxford University Press. (1987).</li>
<li>Tautz, D., Pfeifle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-radioactive+in+situ+hybridization+method+for+the+localization+of+specific+RNAs+in+Drosophila+embryos+reveals+translational+control+of+the+segmentation+gene+hunchback%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback.</a> Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).</li>
<li>Traylor-Knowles, N., Rose, N. H., Palumbi, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+specificity+of+gene+expression+in+the+response+to+heat+stress+in+corals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">The cell specificity of gene expression in the response to heat stress in corals.</a> Journal of Experimental Biology. 220 (10), (2017).</li>
<li>Wolenski, F. S., Layden, M. J., Martindale, M. Q., Gilmore, T. D., Finnerty, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+the+spatiotemporal+expression+of+RNAs+and+proteins+in+the+starlet+sea+anemone%2C+Nematostella+vectensis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Characterizing the spatiotemporal expression of RNAs and proteins in the starlet sea anemone, Nematostella vectensis.</a> Nature Protocols. 8, 900(2013).</li>
<li>Schnitzler, C. E., Simmons, D. K., Pang, K., Martindale, M. Q., Baxevanis, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+multiple+Sox+genes+through+embryonic+development+in+the+ctenophore+Mnemiopsis+leidyi+is+spatially+restricted+to+zones+of+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22EvoDevo%22%5BJournal%5D)">Expression of multiple Sox genes through embryonic development in the ctenophore Mnemiopsis leidyi is spatially restricted to zones of cell proliferation.</a> EvoDevo. 5 (1), 15(2014).</li>
<li>Traylor-Knowles, N. G., Kane, E. G., Sombatsaphay, V., Finnerty, J. R., Reitzel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex-specific+and+developmental+expression+of+Dmrt+genes+in+the+starlet+sea+anemone%2C+Nematostella+vectensis%5BTitle%5D)+AND+%22EvoDevo%22%5BJournal%5D)">Sex-specific and developmental expression of Dmrt genes in the starlet sea anemone, Nematostella vectensis.</a> EvoDevo. 6 (1), (2015).</li>
<li>Barry, S. N., Crow, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+HoxA11+and+HoxA13+in+the+evolution+of+novel+fin+morphologies+in+a+representative+batoid+%28Leucoraja+erinacea%29%5BTitle%5D)+AND+%22EvoDevo%22%5BJournal%5D)">The role of HoxA11 and HoxA13 in the evolution of novel fin morphologies in a representative batoid (Leucoraja erinacea).</a> EvoDevo. 8 (1), 24(2017).</li>
<li>Sharma, P. P., Gupta, T., Schwager, E. E., Wheeler, W. C., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subdivision+of+arthropod+cap-n-collar+expression+domains+is+restricted+to+Mandibulata%5BTitle%5D)+AND+%22EvoDevo%22%5BJournal%5D)">Subdivision of arthropod cap-n-collar expression domains is restricted to Mandibulata.</a> EvoDevo. 5 (1), 3(2014).</li>
<li>Piatigorsky, J., Kozmik, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cubozoan+jellyfish%3A+an+Evo%2FDevo+model+for+eyes+and+other+sensory+systems%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Cubozoan jellyfish: an Evo/Devo model for eyes and other sensory systems.</a> The International Journal of Developmental Biology. 48 (8-9), 719-729 (2004).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

השיטה המתוארת ב פרוטוקול זה השתנה מהעבודה הקודמת מחקר התפתחותי רפואי ואבולוציוני8,9,10,12,17. פרוטוקול זה מתמקד הניואנסים של הכלאה בחיי עיר גשש אנטי-תחושה RNA התווית על-ידי לחפור על מבוגרים אלמוגים, אשר נשמר, נעוץ פרפין. בשיטה זו ניתן להעביר בקלות את דגימות של אורגניזמים מעבר אלמוגים זה היו גם פרפין-מוטבע. לבסוף, שיטה זו יכולה להתבצע בשלבים חיים שונים...

האלמוגים הם בוני המערכת האקולוגית קריטי וחשוב עבור מגוון ביולוגי האוקיינוס ובריאות האדם-1,-2,-3. הם תחת איום בשל שינויי האקלים ואת שאר גורמי אנתרופוגניים, אלמוג מינים רבים נחשבים בסכנת הכחדה חמורה. לפיכך, יש צורך בכלים תאית ומולקולרית לאבחן אלמוגים תחת לחץ משמעותי. בנוסף, יש קצת מובנת על שבו גנים מבוטאים בתוך רקמת האלמוג למבוגרים, ולכן מעט הבנה של הפונקציות של גנים אלה. כדי לטפל בבעיה זו, אנחנו הסתגלו בחיי עיר הכלאה (איש) הפרוטוקול, נפוץ האנושי רפואה וביולוגיה התפתחותית אבולוציונית, לשימוש על דגימות רקמה פרפין-מוטבע של אלמוגים למבוגרים. טכניקה זו היא עוצמתי ביותר כאשר משתמשים באלמוגים מבוגרים שעברו אירוע מלחיץ כגון חשיפה עומס חום. עם זאת, טכניקה זו ניתן להשתמש במגוון רחב של רקמות, שלבי החיים באלמוגים, אינה מוגבלת רק אלמוגים הדגיש חום4,6,7. בנוסף, ניתן להשתמש בטכניקה זו על רקמות או תאים של כל metazoan כל עוד יש cDNA רצף מידע זמין.
מטרת שיטה זו היא להמחיש RNA הגששים בתוך רקמת האלמוג למבוגרים יש כבר נשמר, המוטבעות פרפין, למחלקה על שקופיות. שיטה זו היא כלי אבחון רב עוצמה המאפשר הפריט החזותי של חומצות גרעין בתוך רקמת האלמוג למבוגרים. בתחילה שיטה זו פותחה עבור אבחון רפואי, זה ומאז הפך להיות כלי פופולרי בתחומים כגון ביולוגיה התפתחותית ביולוגיה אבולוציונית התפתחותית8,9,10. איש גם שיטה קריטי, במיוחד במערכות שאינן-דגם, כאשר גנומית, transcriptomic רצף נתונים זמינים אך דפוסי ביטוי מרחבי הגן אינם ידועים. לעבודה האבחון במערכות שאינן-דגם, טכניקה זו היא חזקה כי זה יכול לציין אילו תאים ורקמות אקספרס הגן עניין והוא יכול להוביל יותר ממוקד גישות טיפוליות8,9,10, 11,12. לבסוף, טכניקה זו היא חזקה יותר כאשר יחד עם נתונים של ביטוי כמותי ג'ין11וכמותיים.
הגישה המתוארים במאמר זה יהיה עניין החוקרים כבר עיצבו את digoxigenin (מחדירים)-הנקרא RNA בדיקה (הגיוני והן antisense הגששים) והם עכשיו מוכן לבצע בחיי עיר הכלאה של הגששים מדגם. כדי לבצע בשיטה זו, יהיה צורך שני מקטעי רקמה פרפין אלמוג טורי עבור כל בדיקה הנבדקת. מקטע אחד ישמש עבור המכשיר הגיוני והשני עבור המכשיר antisense. החללית הגיוני יהיה פקד כדי לציין מחייב שאינם ספציפיים. אם צביעת הוא ציין את הגשוש הגיוני, ואז המכשיר antisense אינה ספציפית הרנ א עניין. הגששים יכולים מיועד לכל הגן בא לידי ביטוי. פרוטוקול זה, מספר דוגמאות משמשים שנמצאו קודם לכן לבוא לידי ביטוי במהלך עומס חום באלמוגים: FBJ אוסטאוסרקומה מאתר אונקוגן ויראלי homolog B (פוס-B), מפעיל חלבון (AP1), גידול נקרוזה מקדם קולטן 41 (TNFR 41)11. איש באמצעות התווית על-ידי החפירה RNA הגששים היא עדיפה על שימוש רדיואקטיבי הגששים כי הטיפול הוא הרבה יותר בטוח10. בנוסף, טכניקה זו היא רגישה מאוד, ניתן לבצע מגוון רחב של רקמות העוברים מעבר חום הדגיש אלמוגים למבוגרים13,14,15,16.

<table><tbody><tr><td>הפתרון של דנהרדט</td><td>Affymetrix</td><td>70468 50 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>Bioworld מאגר פוספטאז אלקליין</td><td>פישר</td><td>50-198-724</td><td></td></tr><tr><td>דיוור שקופיות</td><td>פישר</td><td>12-587-17B</td><td></td></tr><tr><td>Bioworld מאגר פוספטאז אלקליין</td><td>פישר</td><td>50-198-724</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל צינורות פלקון</td><td>פישר</td><td>14-959-49A</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת DNA של זרע סלמון UltraPure</td><td>Invitrogen</td><td>15632-011</td><td></td></tr><tr><td>PBS - מי מלח עם חוצץ פוספט (10X) pH 7.4</td><td>Invitrogen</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>מים מזוקקים ללא DNase/RNase UltraPure , 10 x 500 מ"ל</td><td>Invitrogen</td><td>10977-023</td><td></td></tr><tr><td>מים מזוקקים ללא DNase/RNase UltraPure , 10 x 500 מ"ל</td><td>Invitrogen</td><td>10977-023</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת DNA זרע סלמון UltraPure</td><td>Invitrogen</td><td>15632-011</td><td></td></tr><tr><td>שקופית קודקוד לבן דבק מעולה</td><td>Leica Biosystems</td><td>3800080</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת PBS, pH 7.4</td><td>Life Technologies</td><td>10010072</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K, כיתה מולקולרית, 2 מ"ל</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>חוסם נוזלים עט סופר פאפ</td><td>Promega</td><td>22309</td><td></td></tr><tr><td>DIG אנטי-דיגוקסיגנין-AP שברי Fab</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>BM סגול, 100 מ"ל</td><td>Roche</td><td>11442074001</td><td></td></tr><tr><td>DIG סט חיץ כביסה ובלוק</td> תמיסת פורמלדהיד <td>Roche</td><td>11585762001</td><td></td></tr><tr><td>NBT/BCIP</td><td>Roche</td><td>11681451001</td><td></td></tr><tr><td>פורמלדהיד, גודל 500 מ"ל</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549-500ML</td><td></td></tr><tr><td>SSC Buffer 20X ריכוז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S6639-1L</td><td></td></tr><tr><td>אצטי אנהידריד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>320102-100 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>פורממיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>47670-250ML-F</td><td></td></tr><tr><td>טריאתנולאמין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>90279-100 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>מלח נתרן הפרין מרירית המעי של חזיר</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>H3149-10KU</td><td></td></tr><tr><td>קסילנים, AR (ACS), לשימוש</td> <td>היסטולוגיVWR</td><td>MK866806</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>VWR</td><td>EM-EX0276-4S</td><td></td></tr><tr><td>TE מאגר</td><td>VWR</td><td>תנור</td> היברידיזציה PAV6232 <td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>97005-252, 97005-254</td><td></td></tr><tr><td>שייקר אורביטלי</td><td>VWR</td><td>89032-088</td><td></td></tr></tbody></table>

בחיי עיר טכניקות הכלאה פרפין-מוטבע דגימות אלמוגים למבוגרים

In Situ Hybridization Techniques for Paraffin-Embedded Adult Coral Samples

אלמוגים הם אוקיינוס חשוב חסרי חוליות קריטית לבריאות הכללית של האוקיינוס, כמו גם בריאות האדם. עם זאת, בשל בהשפעה האנושית כגון עליית הטמפרטורות התחמצות, אלמוגים הם יותר ויותר תחת איום. כדי להתמודד עם האתגרים הללו, ההתקדמות התא וביולוגיה מולקולרית הוכיחו להיות חיונית לאבחון הבריאות של אלמוגים. שינוי כמה מן הטכניקות הנפוצות ברפואה האנושית יכולה לשפר באופן ניכר של חוקרים היכולת לטפל ולשמור אלמוגים. כדי לטפל בבעיה זו, עבור בחיי עיר הכלאה בעיקר בשימוש ברפואה האנושית וביולוגיה התפתחותית אבולוציונית פרוטוקול כבר מותאם לשימוש באלמוגים למבוגרים תחת לחץ.
מטרת שיטה זו היא להמחיש את הביטוי המרחבי של בדיקה RNA ברקמת האלמוג למבוגרים יש כבר מוטבע פרפין, למחלקה על גבי מדרון זכוכית. שיטה זו מתמקדת הסרת פרפין, התייבשות של המדגם, רעלני לדוגמה כדי להבטיח חדירות של המדגם, הכלאה קדם דגירה, הכלאה של המכשיר RNA, הפריט החזותי של המכשיר RNA. זוהי שיטה חזקה בעת שימוש אורגניזמים שאינם-דגם לגלות שבו באים לידי ביטוי גנים ספציפיים, הפרוטוקול ניתן להתאים בקלות עבור אורגניזמים אחרים שאינם-מודל. עם זאת, השיטה זו מוגבלת כי זהו בעיקר איכותיים, כי עוצמת הביטוי יכול להשתנות בהתאם כמות הזמן בשימוש במהלך השלב חזותי וריכוז של המכשיר. יתר על כן, סבלנות נדרשת, כמו פרוטוקול זה יכול לקחת עד 5 ימים (וגם במקרים רבים, ארוכים יותר) בהתאם המכשיר בשימוש. לבסוף, צביעת הרקע שאינם ספציפיים שכיחה, אך ניתן להתגבר על מגבלה זו.

לאחר השלמת פרוטוקול זה, זיהוי של תאים ורקמות כי הם ביטוי החללית RNA עניין תושג. התוצאות נציג עבור פרוטוקול זה מיועדות AP-1, FosB ו- TNFR41. התוצאות, שפורסמו קודם לכן על ידי טריילור-נואלס. et al. 11, הצג ביטוי מרחבי של RNA רגשים על אלמוגים למבוגרים זה נחשפו עומס חום. שתי דוגמאות מסוגים שונים מכתימים מוצגים באיור1. איור 1A היא דוגמה של צביעת רקמות ' מאטום לשקוף '. הכתם נמצא בכל הרקמות, לא רק בתוך תא...

המטרה של פרוטוקול זה היא לבצע הכלאה בחיי עיר על דגימות אלמוגים מבוגרים שמוטבע פרפין, למחלקה על גבי מדרון זכוכית. זוהי שיטה איכותי המשמש כדי להמחיש את הביטוי המרחבי לווין אנטי-חוש RNA ברקמות פרפין-מוטבע.

Corals are important ocean invertebrates that are critical for overall ocean health as well as human health. However, due to human impacts such as rising ...

שיטה זו יכולה לסייע לענות על שאלות מפתח בביולוגיה של תאי אלמוגים, כמו למשל אילו סוגי רקמות ותאים מבטאים סוגים מסוימים של גנים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שיש לך מידע חזותי על ביטוי RNA. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי ביטוי גנים מרחבי באלמוגים בוגרים, ניתן להשתמש בה גם בשלבי חיים אחרים של אלמוגים, כמו גם במערכות חסרי חוליות אחרות.בדרך כלל אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שיש כל כך הרבה שלבים ופתרונות שצריך לעקוב אחריהם. אז הם צריכים לשים לב היכן הם נמצאים בפרוטוקול, ולעקוב היטב אחר הזמן בעת ביצוע השטיפות. קווין רודריגז, טכנאי במעבדה שלי, ידגים את ההליך הזה.כדי להתחיל, הסר שעווה שקופיות משובצות פרפין בחתך דק עם 100% קסילן בצנצנות קופלין זכוכית למשך 10 דקות מתחת למכסה המנוע. לאחר מכן, מלאו ארבע צנצנות קופלין מזכוכית סטרילית ב-100% אתנול, 80% אתנול, 70% אתנול ו-60% אתנול בהתאמה. ראשית, העבירו את השקופיות לצנצנת קופלין המכילה 100% אתנול, והניחו להן להשרות במשך 10 דקות.לאחר מכן העבירו את השקופיות לצנצנת קופלין אחרת המכילה 100% אתנול. חזור על תהליך זה עם כל אחת מצנצנות קופלין בסדר יורד של ריכוז האתנול. ראשית העבירו את השקופיות לדיוור שקופיות סטרילי עם 18 מ"ל של PBS.לאחר מכן שטפו את השקופיות במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שפכו נפח אחד של PBS, והוסיפו כ -10 מ"ל של תמיסת

in-situ-hybridization-techniques-for-paraffin-embedded-adult-coral

Research

JoVE Journal

Environment

סביבה

שילוב של טכניקות שונות על מנת למקסם את איסוף הנתונים מרקמות העכבר מוצג.

שילוב של צבע lipophilic, באתרו</emהכלאה>, אימונוהיסטוכימיה ו היסטולוגיה

הר שלם<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה של E8.5 לעוברי E11.5 עכבר

ב הכלאה באתרו עבור לוקליזציה המדויק של תמלילי בצמחים

על ידי שילוב של כל שיטות להר...

רנ&quot;א<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה בעוברי הר שלמים והיסטולוגיה הסלולרית מותאמת לElasmobranchs הימי

דג הזברה, דגים טרופיים קטנים, הפכה לדגם פופולרי ללימוד תפקוד גן במהלך התפתחות מחלה וחוליות. הביטוי של הזמן ומרחב של גני המטרה יכול להיקבע על...

הר שלם ברזולוציה גבוהה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה בתוך עוברי דג הזברה לחקר ביטוי גנים ותפקוד

חבילה משולבת של טכניקות הדמיה יושמה כדי לקבוע מורפולוגיה פוליפ ומבנה רקמה בannularis Montastraea אלמוגי האיים הקריביים ומ ' faveolata. הקרינה, פנים בלוק סדרתי, ומיקרוסקופ סריקת לייזר confocal שני פוטונים זיהו מבנה lobate, קירות פוליפ, וchromatophore מוערך וצפיפויות zooxanthellae והפצות.

Multimodal שיטות מיקרוסקופית אופטיות לחשוף רקמות מורפולוגיה ומבנה פוליפ בקריביים אלמוגי בניית ריף

פרוטוקול זה מתאר יעיל באתר היברידיזציה באתרו כדי לזהות את רמות ביטוי mRNA ודפוסי מרחבית של גנים היעד בנוזל הסיפונקולוס nuomic .

באתרו היברידיזציה עבור סיפונקולוס נודוס מנוזל קואוממית

פרוטוקול זה מתאר כיצד להשיג תמונות על ידי שילוב הכלאה באתרו ואימונוהיסטוכימיה של חלקים עובריים של דגי זברה. הכלאה באתרו בוצעה לפני הקפאה, ואחריה הכתמת נוגדנים. כדאי לזהות את דפוסי הביטוי של שני גנים בדגי זברה אם יש מיעוט נוגדנים.

ב Situ הכלאה בשילוב עם אימונוהיסטוכימיה בעוברי דגי זברה Cryosectioned

כאן אנו מתארים פרוטוקול להדמיית תאים מתרבים דמויי גזע במדוזה Cladonema. הכלאה פלואורסצנטית שלמה באתרה עם סמן תאי גזע מאפשרת זיהוי של תאים דמויי גזע, ותיוג 5-אתיניל-2'-דאוקסיורידין מאפשר זיהוי של תאים מתרבים. יחד, ניתן לזהות תאים דמויי גזע המתרבים באופן פעיל.

הכלאה פלואורסצנטית באתרה ותיוג 5-אתיניל-2'-דאוקסיורידין לתאים דמויי גזע במדוזה הידרוזואנית Cladonema pacificum

במאמר זה אנו מציגים את ההפקה וההכנה של מטבוליטים קוטביים וקוטביים למחצה מהולובונט אלמוגים, כמו גם רקמת מארח אלמוגים מופרדת ושברי תאים Symbiodiniaceae, לצורך ניתוח ספקטרומטריית מסות של כרומטוגרפיית גז.

כרומטוגרפיית גז - ספקטרומטריית מסות מבוססת מטבולומיקה ממוקדת של דגימות אלמוגים קשים

פרוטוקול זה מתאר מסלול אוטומטי למחצה לשיפור היעילות והיכולת של עיבוד ושימור בהקפאה של זרע ממיני אלמוגים מאוימים, במטרה להבטיח מגוון גנטי ולתמוך במאמצי שיקום שוניות.

זרימת עבודה חצי-אוטומטית לשימור בהקפאה של זרע אלמוגים לתמיכה בביו-בנקאות ובחקלאות ימית

למד הכלאה in situ בדגימות אלמוגים מוטבעות פרפין לחקר ביטוי גנים ברקמות ותאים ספציפיים. שיטה זו מספקת מידע חזותי על ביטוי RNA ומאפשרת הבנה מעמיקה של ביולוגיית אלמוגים.

בחיי עיר טכניקות הכלאה פרפין-מוטבע דגימות אלמוגים למבוגרים

גלה סרטונים נוספים