שילוב ניתוח של דנ א ב מיצוי Virion גולמי עם הניתוח של RNA של עלים נגועים לגלות הגנום וירוס חדש

שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הווירולוגיה הסביבתית, כגון הופעתן של מחלות חדשות. היתרון המרכזי של שיטה זו הוא טיהור וריאנטים מרכיבים תאיים ושימוש בווריאנטים אלו להפקת DNA לצורך ריצוף. הגעתי לרעיון זה לראשונה כאשר גילינו כי הצמחים בחממות שלנו נגועים ב-Badnaviruses אחד או יותר שאינם ידועים. אנשים שאינם מכירים את השיטה יתקלו בשלוש קשיים. ראשית, הומוגנזציה היא שלב קריטי להבטחת תנובה איכותית. שנית, סרצופוגה דיפרנציאלית עשויה להניב מספר משקעים (pellets), ויש לדעת כיצד לזהות ולהפריד ביניהם. שלישית, פענוח תוצאות של bio-analyzer עשוי להיות מאתגר גם הוא.

יש ללבוש חלוק מעבדה וכפפות בכל שלבי הליך זה. התחל בגזירת 80 עד 100 גרם של עלים מצמחים חולים שהוקפאו בעבר במינוס 20 °C. לאחר מכן, טחון את העלים בבלנדר Waring באמצעות 200 milliliters של בופר טחינה ו-0.5% sodium sulfite. העבר את ההומוגנאט לכלי בכר של ליטר אחד.

בעודכם לובשים ציוד מגן אישי מתאים, הוסיפו 18 גרם urea ו-25 מיליליטר של דטרגנט לא-יוני בריכוז 10% להומוגנאט וכסו את הכלי ברדיד אלומיניום. ערבבו באמצעות מערבל מגנטי למשך הלילה. למחרת, העבירו את ההומוגנאט לבקבוקי רוטור של צנטריפוגה בנפח 250 מיליליטר וסבבו ברוטור בזווית קבועה ב-4000 ×g בטמפרטורה של 4°C למשך 10 דקות. אספו את הנוזל העליון (supernatant) וסננו דרך ארבעה שכבות של בד גזה. מדדו את נפח ההומוגנאט הנוזלי שאספתם ולאחר מכן חלקו את ההומוגנאט למבחנות צנטריפוגה מפוליפרופילן בנפח 38.5 מיליליטר. סבבב את ההומוגנאט ב-40,000 ×g בטמפרטורה של 4°C למשך 2.5 שעות. עם סיום הסבב, בדקו אם נוצר משקוע (pellet) ירוק בתחתית המבחנה ומשקוע לבן לאורך דפנות המבחנה. שפכו את הנוזל העליון, תוך שמירה על שני המשקעות, והניחו את הדגימות על קרח.

הפרדת המשקע הלבן מהמשקע הירוק היא אחד השלבים המאתגרים ביותר בפרוצדורה. היא דורשת סבלנות ומיומנות.

בעבודה תחת מapay חולקים כימיים, השתמש במגרדת גומי (rubber policeman) כדי להפריד את המשקעים. גרד והעבר את המשקעים לבקבוקי רוטור שונים. הנח את בקבוקי הרוטור המכילים את המשקעים הלבנים על קרח. הוסף מיליליטר אחד של מים לכל בקבוק ובצע פיפוט למעלה ולמטה. מדי חמש דקות, לאורך שעה עד שעתיים, פפפט את התערובת למעלה ולמטה כדי להשHות שוב את המשקע. לאחר שהמשקעים הלבנים הושחיו, שמור את התוך-תלייה למשך הלילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.

ביום למחרת, סנטריפוגו את הסספנסיה ב-6000 $\times\text{g}$ בטמפרטורה של 4 °C למשך 10 דקות כדי להסיר את השאריות. העבירו את הסספנסיות המרוכזות למבחנות חדשות וסנטריפוגו ב-136,000 $\times\text{g}$ בטמפרטורה של 4 °C למשך שעתיים כדי לשקיע את הוויריונים. הסירו את העליון (supernatant) ותלו את המשקע ב-1 מיליליטר של באפר.

התחל את הפרוצדורה על ידי פירוק הוויריונים. הוסף 40 µL של תמיסת proteinase K בריכוז 2 µg/µL לתשמויות המשקע והדגר בטמפרטורה של 37 °C למשך 15 דקות. הוסף נפח אחד של פנול כלורופורם איזואמיל אלכוהול לכל דגימה ונער ידנית למשך 20 שניות.

סבב במערך צנטריפוגה בטמפרטורת החדר ב-16,000 ×g למשך חמש דקות. הסר את הפאזה המימית העליונה והעבר אותה למבחנה חדשה. חזור על תהליך מיצוי זה פעמיים או יותר.

רכז את ה-DNA באמצעות שיקוע אתנול. השתמש בנתרן אצטט 0.3 molar ב-pH 5.2 וב-2.5 נפחים של 95% ethanol. הנח את הדגימות בטמפרטורה של minus 20 degrees Celsius למשך 30 עד 60 דקות. לאחר מכן, סבב במערך צנטריפוגה במהירות של 13,000 ×g למשך 10 עד 20 דקות כדי לשקע את ה-DNA.

בעבודה על שולחן מעבדה, השביחו מחדש את משקע ה-DNA ב-1 ml של תמיסת TE बפר בריכוז 0.1 mM. סננו את התמיהה דרך עמודת סינון ג'ל מסחרית באמצעות סנטריפוגה. נתחו את הדגימות באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז 1% עם צביעה בברומיד אתידיום כדי לבחון את איכות התכשירים ולהעריך את איכות ה-DNA כפי שפורט בטקסט.

בבדיקה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני חודר, נמצאו חלקיקי נגיף במשקע הלבן שהופק על ידי הפרדה גסה של עלי קנה (canna) נגועים. אלקטרופורזה של DNA על ג'ל אגרוז, שהופק מהמשקעים הירוקים והלבנים, זיהתה שני פסי DNA בעלי משקל מולקולרי גבוה בפרקציה הלבנה, המסומנים על ידי הנקודות האדומות והצהובות.

את שלמות ה-RNA שהבודד מעלים נגועים איששו גם באמצעות אלקטרופורזה בג'ל אגרוז. תרשים זה מציג את השכיחות והפיזור הטקסונומי של קונטיגים (contigs) שחושבו מהכנה גולמית של הנגיף. ותרשים זה מתאר את הפרופורציות של קונטיגים של נגיפים הקשורים למשפחת ה-Caulimoviridae, לסוג ה-Badnavirus ולקונטיגים הקשורים לשלושה מינים קרובים.

שני התרשימים הבאים מראים את שפע הקונטיגים (contigs) שהופקו מרצף RNA, בהתבסס על ההתפלגות הטקסונומית שלהם. התרשים מימין מציג את שפע הקונטיגים בתוך אוכלוסיית קונטיגי הווירוסים הקשורים למשפחת ה-Caulimoviridae, לסוג ה-Badnavirus ולשלושה מינים קרובי שווא. השוואה בין קונטיגים באורך גנום וירוס שנוצרו על ידי רצף DNA ו-RNA כפיגום (scaffold) הדדי מאשרת את נוכחותם של שני גנומים וירוסיים מלאים.

לבסוף, ניתוח RT-PCR באמצעות RNA שבודד מעלים נגועים בנגיף גילה את שני הגנומים של הנגיף.

לאחר שולטה בטכניקה זו, ביצועה עשוי לארוך יומיים, בעוד שמתחיל עשוי להזדקק לשלושה ימים. בעת ביצוע הליך זה בפעם הראשונה, חשוב לתעד את נפח ההומוגנאט בכל אחד מהעל-נוזלים, כדי שניתן יהיה להשוות בסוף התהליך את תנובת ה-DNA הסופית לחומר המוצא ההתחלתי.

לאחר גילויו, סלל שיטה זו את הדרך בתחום הוירולוגיה של צמחים עבור חוקרים לזיהוי נגיפי DNA חדשים בסביבה. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן הומוגניזציה של חומר צמחי, ריכוז של וריאנטים, והשגת תנובה טובה של DNA שניתן להשתמש בה לריצוף דור הבא. אין לשכוח כי עבודה עם urea ו-phenol chloroform היא מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון הרכבת משקפי מגן, כפפות, חלוק מעבדה ומסכה בעת עבודה עם כימיקלים אלו. לצורך ביצוע an ultra centrifugation בטוח, חשוב לאזן את המבחנות כראוי; לכן יש לשקול אותן ולהניחן זו מול זו ברוטור, כאשר הפרש המשקל ביניהן לא יעלה על 0.01.