שיטה פולשני עבור ההפעלה של הכישור משוננת העכבר על ידי גירוי בתדירות גבוהה
2 ביוני 2018
פרוטוקול זה מראה כיצד להגדיר שיטה אמינה מערכת קבצים הירארכית בעכברים. נוירונים ברחבי הכישור משוננת בהיפוקמפוס הם גירוי חשמלית על-ידי מערכת קבצים הירארכית ישירות ובעקיפין בתוך vivo. פעילות. עצבית והאיתות מולקולרית נבדקים על ידי c-פוס Notch1 immunofluorescent מכתים, בהתאמה; נוירוג'נסיס לכמת על-ידי bromodeoxyuridine תיוג וזמינותו.
המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לבחון את ההשפעה של גירוי בתדר גבוה על פעילות עצבית בנוירוגנזה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח במנגנונים תאיים ומולקולריים מיושרים של גירוי מוחי עמוק בתדר גבוה, כגון אינדוקציה של פעילות נוירונים ונוירוגנזה בהיפוקמפוס. היתרון של טכניקה זו הוא בכך שהיא מדגימה את ההשפעה העוצמתית של TBS בתדר גבוה על פעילות הנוירונים והנוירוגנזה במוח הבוגר.
למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי ההשפעות של TBS בתדירות גבוהה על הבליטה המשוננת של העכבר, ניתן ליישם אותה גם על מערכות אחרות כמו גרעיני הבסיס והאזורים התת-תלמיים להפרעות המוח במרפאה. כדי להתחיל בהליך זה, הנח עכבר מורדם על המסגרת הסטריאוטקטית. יישר את רצועות האוזניים עם ראשו, והדק אותן בעדינות כדי לתמוך בראש הממורכז.
אחוז בעור הקדמי לאוזניו והסר כסנטימטר מרובע ממנו מעל הגולגולת. לאחר מכן הסר את השריר ואביזר אחר המכסה את הגולגולת בעזרת צמר גפן כדי לחשוף את פני הגולגולת. לאחר מכן, יש למרוח תמיסת מי חמצן לייבוש הגולגולת על מנת לזהות את קווי התפרים הסגיטלים והלמבדה.
לאחר מכן, זהה את הברגמה והלמבדה. נקודת הברגמה תשמש כנקודה המקורית לקביעת מיקום הגרעין. לאחר מכן, יישר את הגולגולת במישור האופקי באמצעות שתי הנקודות הללו.
וודאו שהגבהים של שתי הנקודות הללו כמעט זהים במישור הגחון הגבי. בנוסף, וודאו כי הגולגולת מפולסת במישור הרוחבי המדיאלי. לאחר מכן, הרכיב אלקטרודת מיקרו חוט נחושת דו-ערוצית תוצרת בית למחזיק האלקטרודה המסתובב על המסגרת הכירורגית הסטריאוטקטית.
הנח את האלקטרודה ישירות מעל הברגמה והגדר אותה כאתר מקורי. לאחר מכן, הזיזו את האלקטרודה בעדינות למיקום הנכון מעל הגולגולת, מבלי לגעת בה. השתמש בתצוגה הדיגיטלית על המסגרת הכירורגית הסטריאוטקטית כדי לציין את המיקום האחורי הקדמי, הצדדי המדיאלי והאחורי.
כאשר מזוהה האתר הרצוי להכנסת האלקטרודה, סמן את המיקום בטוש שחור. לאחר מכן, השתמש בהתאמות הסטריאוטקטיות האחוריות כדי להרים את מחזיק האלקטרודה. לאחר מכן, יש לעקר את המקדחה עם אתנול 70%.
השתמש במקדחה בעזרת מיקרומניפולטור כף יד, צור חור בור בדיוק במיקום המסומן. השתמש במקלון צמר גפן סטרילי כדי לעצור כל דימום במהלך הניתוח. המשך לקדוח עד לחשיפת דורה.
השתמש במחט כפופה כדי להסיר שאריות עצם שנוצרות במהלך הקידוח, וצור חור סיכה על הדורה מבלי לפגוע ברקמת המוח הרכה הבסיסית. כדי לאשר כי חור הבור עשוי כראוי במיקום הרצוי, הורד את האלקטרודה כדי לוודא שהיא נכנסת דרך חור הבור בצורה חלקה מבלי לגעת במכשול כלשהו. אם לא מתגלה התנגדות, הכנס לאט את האלקטרודה לעומק המטרה מפני השטח של הגולגולת.
לאחר מכן, מרחו מלט דנטלי באמצעות מרית קטנה כדי להחזיק את האלקטרודה במקומה. כשהמלט מתעבה, יצקו אותו סביב האלקטרודה המוכנסת וברגי עצם אחרים ליצירת מכסה יפה וחלק. לאחר מכן, נתק את האלקטרודה ממחזיק האלקטרודה.
הסר את העכבר מהמסגרת הסטריאוטקטית והחזיר אותו לכלוב חם. תן לעכבר לנוע בחופשיות ואפשר לו להתאושש במשך יומיים בכלוב. כדי לספק גירוי, חבר את האלקטרודה המושתלת לגירוי הניתן לתכנות באמצעות מובילים.
הגדר את ממשק התוכנה. לאחר מכן, הגדר את פרמטרי HFS כשש סדרות של שש רכבות של שישה פולסים ב-400 הרץ, ועוצמת הגירוי של 200 מיליאמפר . ספק HFS לפרק הזמן הרצוי כפי שהוגדר.
עבור קבוצת הביקורת, השתלת אלקטרודות בעכברים מבלי לספק גירוי כלשהו. עבור צביעת CFAS, גרו את עכברי הניסוי פעמיים למשך יום אחד. לתיוג BrdU, יש להחיל גירויים מתאימים הן על קבוצת הגירוי החריף והן על קבוצת הגירוי הכרוני.
במהלך הגירוי, ודאו שהעכבר ער. זכור לוודא שהמובילים אינם מעוותים. בסיום הגירוי, נתק בזהירות את סיכת האלקטרודה ממחזיק האלקטרודה במחבר של מערכת ההקלטה.
עבור ה-CFAS וצביעה אחת, כשלוש שעות לאחר ה-HFDBS האחרון, יש להרדים את העכברים על ידי הזרקת פנטוברביטל כדי להשיג מישור כירורגי של הרדמה. עבור תיוג BrdU, כ-12 שעות לאחר הגירוי האחרון של HFDBS, תנו שש זריקות של BrdU לביקורת ולעכברים המגורים במרווחים של שעתיים. 36 שעות לאחר הזריקה האחרונה, יש להרדים עמוק את העכברים עם פנטוברביטל ולהעשיר אותו ב-50 מיליליטר PBS קר ואחריו 50 מיליליטר קר 4% פרפורמלדהיד.
הסר את ראשו ובצע חתך בעור כדי לחשוף את המיומנות. בעזרת מלקחיים חותכים מעט את הגולגולת ומסירים בזהירות את כל המוח. לאחר מכן, לאחר תיקון המוח הוא 4% פרפורמלדהיד למשך יומיים נוספים, והעבירו אותו לתמיסת סוכרוז 30% בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה.
בעזרת קריוסטט, פורסים את המוח למקטעים עטרתיים של 20 מיקרון. העבירו והרכיבו את החלקים למגלשת הזכוכית בעזרת מברשת, ואחסנו אותם במינוס 20 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, העבירו את השקופיות ל-PBS רגיל שאינו מכיל מקבע.
שטפו את החלקים עם PBS שלוש עד ארבע פעמים למשך חמש דקות כל אחד כדי להסיר עודפי קיבוע. עבור הקבוצה המסומנת BrdU, דגרו את החלקים בשני HCL טוחנת למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, ושטפו אותם במאגר בוראט של 0.1 מולארי. לאחר 10 דקות יש לשטוף את החלקים פעמיים ב-PBS למשך חמש דקות בכל פעם.
לאחר מכן, דגרו את החלקים בתמיסת חסימה למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, דגרו את החלקים עם נוגדן רב-שבטי נגד CFAS, נוגדן נגד חריץ אחד או נוגדן נגד BrdU בתמיסה חוסמת בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. האם החלקים היו שלוש פעמים ב-PBS למשך 10 דקות בכל פעם, ואז דגרו אותם עם Alexa Fluor 568 מצומד נגד כלבת, Alexa Fluor 488 מצומד נגד עזים, או Alexa Fluor 488 מצומד נגד חולדות נוגדן משני למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
היה הקטעים שלוש פעמים ב-PBS במשך 10 דקות בכל פעם. לאחר מכן, כסו את חלקי המוח המסומנים במערכת החיסון באמצעות מדיום הרכבה של ריאגנט נוגד דהייה המכיל DAPI. הניחו לחלקים להתייבש באוויר, ואחסנו אותם מוגנים מפני אור בארבע מעלות צלזיוס.
מוצגת כאן פרדיגמה ניסויית לטיפול ב-HFS בדור של תאי עצב מתרבים BrdU ב-DG. החיות חולקו לקבוצה אקוטית וכרונית כדי לקבל דפוסים שונים של גירויים. לאחר מכן, החיות בשתי הקבוצות הוזרקו ל-BrdU ביום השישי. ביום השמיני, החיות הורדמו והועברו שפע להכנת קטעי קריוסטט.
להלן התמונות של צביעת האימונופלואורסצנט של BrdU לאחר HFDBS ב-DG. ניתוח כמותי של הייצור העצבי הצביע על כך שהגירוי החריף ב-DG לא יכול היה לשפר את הנוירוגנזה. בעוד שהגירוי הכרוני ב-DG העלה משמעותית את הנוירוגנזה. בהשוואה לקבוצת הביקורת, מספר תאי התיוג של BrdU גדל באופן משמעותי בקבוצה הכרונית, הן בהמיספרה המקבילה והן בהמיספרה הנגדית.
אלו הן התמונות של צביעה אימונו-פלואורסצנטית של BrdU לאחר HFDBS בתת-אזור PP. ניתוח כמותי של הייצור העצבי הצביע על כך שהגירוי החריף או הכרוני ב-PP לא יכול היה לשפר את הנוירוגנזה באופן משמעותי. מספר תאי התיוג של BrdU היה יציב יחסית עם או בלי הטיפול ב-HFS.
בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לאתר את האלקטרודה כראוי, ולהעביר את הגירוי בהצלחה. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום מדעי המוח לגירוי בתדר גבוה שנרשמו למודלים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לספק גירוי בתדר גבוה לגרעין המוח העמוק
.צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מתווה פרוטוקול לבדיקת ההשפעות של גירוי בתדר גבוה (HFS) על פעילות נוירונלית ונוירוגנזה בהיפוקמפוס של עכברים. הוא מדגיש כיצד HFS משפיע על סיגנלינג מולקולרי ועל פעילות נוירונלית באמצעות שיטות צביעה ספציפיות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- נוירוגנזה
- אלקטרופיזיולוגיה
רקע
- גירוי בתדר גבוה (HFS) עשוי להשפיע על פעילות נוירונלית ועל נוירוגנזה.
- הפיתול המשונן (dentate gyrus) בהיפוקמפוס הוא קריטי להבנת תהליכים אלו.
- ניתן להעריך מנגנוני איתות מולקולריים באמצעות טכניקות ספציפיות של צביעה אימונופלואורסצנטית.
- שיטה זו עשויה להתרחב למערכות מוחיות אחרות הרלוונטיות להפרעות קליניות.
מטרת המחקר
- להערכת ההשפעות של HFS על אקטיבציה נוירונלית ונוירוגנזה במודל של עכבר.
- לבחינת המנגנונים התאיים והמולקולריים שבבסיס גירוי עמוק של המוח בתדר גבוה.
- לספק תובנות הישימות לא רק לנוירוגנזה, אלא גם לאזורים אחרים המעורבים בהפרעות מוחיות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- פרוטוקול HFS in vivo בעכברים תחת הרדמה.
- השתלת אלקטרודות ב-dentate gyrus של ההיפוקמפוס.
- שימוש בצביעה אימונופלורסצנטית של c-fos ו-Notch1 להערכת פעילות נוירונלית.
- בדיקת סימון ב-Bromodeoxyuridine (BrdU) לכימות נוירוגנזה.
- לוח הזמנים כולל מספר שלבים, ביניהם התאוששות, גרייה וניתוח של רקמות המוח לאחר הגרייה.
תוצאות עיקריות
- גירוי חשמלי הוביל לשינויים משמעותיים בפעילות הנוירונלית, כפי שהודגם על ידי ביטוי של c-fos.
- סיגנל Notch1 נקשר לנוירוגנזה כמענה ל-HFS.
- סימון BrdU הראה ראיות כמותיות לנוירוגנזה תחת תנאי גירוי מוגדרים.
- המתודולוגיה שביצעה מספקת מסגרת למחקרי המשך על השפעות גירוי מוחי במחקר נוירולוגי.
מסקנות
- מחקר זה מדגים את התועלת של HFS לחקירת מנגנונים עצביים בהיפוקמפוס.
- הבנת הקשר בין פעילות עצבית לבין נוירוגנזה עשויה להיות בעלת השפעות על הטיפול בהפרעות נוירולוגיות.
- התוצאות תומכות בפיתוח יישומים של HFS במודלים שונים של המוח, ובכך מרחיבות את הידע שלנו על פלסטיקה עצבית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטה זו מאפשרת הפחתת סיכונים מכניסטית של גרייה עמוקה של המוח בתדר גבוה (HF-DBS) על ידי קישור פרמטרי הגרייה לתוצאות כמותיות של פעילות נוירונית ונוירוגנית במערכת הרלוונטית למחלה. היא תומכת בתיקוף מטרות ובפיתוח בדיקות עבור אינדיקציות נוירופסיכיאטריות כגון הפרעהו דפרסיבית מז׳ור והפרעה טורדנית-כפייתית, על ידי אספקת ביטחון ניבוי במסלולי תרגום (translational pathways) במורד הזרם. גישה זו מבססת מודל פרה-קליני להערכת השפעות ביולוגיות של נוירומודולציה לפני זיהוי מובילים או קידום מועמדים קליניים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות על ידי מדידת השהיות של c-fos ואותות Notch1 כמדדים לעירור עצבי ולמודולציה של מסלולים.
- ערך תפעולי: מאפשר תיקוף תפקודי של מטרות באמצעות כימות נוירוגנזה המסומנת ב-BrdU בתוך ה-dentate gyrus, מערכת רלוונטית למחלות בהקשר של הפרעות תלויות היפוקמפוס.
- ערך ניבוי: תומך בביטחון הניבוי על ידי ביסוס קשרי תגובה-מינון בין תדירות הגירוי, משכו והתוצר הנוירוגני.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: הכנת פרוסות מוח סטנדרטיות לצביעה אימונופלואורסצנטית, המאפשרת כימות הדיר בשיטה הדירה של c-fos, Notch1 ו-BrdU כמדדים מרובים (multiplexed readouts).
- פלט כמותי: מספק משתנים תלויים מדידים (ספירת תאים, עוצמת פלואורסצנציה) התומכים בסטנדרטיזציה של הבדיקה ובהשוואות בין קבוצות.
- יכולת הרחבה של הסריקה: מקל על הכנת מערכות ביולוגיות מאושרות לסריקת תרכובות או מודולטורים בהמשך, במודלים של גרייה כרונית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מדמה שינויים בנוירוגנזה של ההיפוקמפוס הרלוונטיים להפרעה דיספרסיבית מז׳ור ולתחלואה קוגניטיבית נלווית באינדיקציות נוירופסיכיאטריות.
- המשכיות תרגומית: מגשר בין פרדיגמות של גרייה אקוטית וכרונית להערכת תגובות נוירוגניות מאוחרות, המשקפות לוחות זמנים קליניים של תחילת השפעה טיפולית.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מבהיר האם השפעות התנהגותיות שנצפו נובעות מנוירוגנזה לעומת הפעלה נוירונלית אקוטית, ובכך מפחית עמימות בנוגע למעורבות המטרה.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
השיטה נכללת ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות על מטרות ועד לתיקוף פרה-קליני, ובמיוחד עבור אסטרטגיות של נוירומודולציה המכוונות למעגלים בהיפוקמפוס בהפרעות מצב רוח והפרעות קוגניטיביות.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות על ידי בידוד ה-dentate gyrus כאתר לתגובה נוירוגנית ותעתוקית המושראת על ידי גרייה.
- סריקה: מאפשרת פיתוח של בדיקות עבור תרכובות שעשויות להגביר או לחקות נוירוגנזה המושראת על ידי HF-DBS, באמצעות מדדי BrdU ו-Notch1.
- אנליטיקה: מספקת משתנים תלויים כמותיים (צפיפות תאי BrdU+, אחוז נוירונים c-fos+) לצורך השוואה סטטיסטית בין קבוצות הגרייה.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין פרוטוקולי גרייה לתוצאות נוירוגניות הרלוונטיות למחלה, ובכך תומכת בהחלטות קידום מותאמות סיכון.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה כירורגית ופלטפורמת צביעה לשימוש חוזר, שניתן להחיל על אזורי מוח אחרים (למשל, basal ganglia, subthalamic nucleus) לצורך הרחבת ההתוויות.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית על ידי קישור הגירוי לנקודות סוף מולקולריות (Notch1) ותאיות (BrdU, c-fos) מוגדרות.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של השתלת אלקטרודות, מתן גירוי ועיבוד רקמות להערכה נוירוגנית הניתנת לשחזור בין מעבדות.
- ערך אסטרטגי: משפר קבלת החלטות מסוג go/no-go על ידי אספקת ראיות מוקדמות למעורבות המטרה ולעוצמת ההשפעה הביולוגית.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של גישות לנוירומודולציה מותאם סיכונים, בהתבסס על תוצאות מוגרמות של נוירוגנזה ואיתות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בניתוח סטריאוטקטי, אלקטרופיזיולוגיה ועיבוד היסטולוגי לצביעה אימונופלורסצנטית.
- תלוי בציוד הכולל מסגרות סטריאוטקטיות, מעוררים הניתנים לתכנות, קריוסטטים ומערכות מיקרוסקופיה פלורסצנטית.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרמטרי העירור, לוחות זמנים למתן BrdU ותיקוף נוגדנים כדי להבטיח קריאות עקביות.
- כולל שיקולי התאמה בעת התמקדות באזורים שאינם היפוקמפליים, בשל שונות אנטומית במיקום האלקטרודות ובנגישות לרקמה.
- מגבלות מעשיות כוללות שונות בניתוחי הישרדות, סובייקטיביות בכימות הצביעה והצורך בביקורות של עירור דמה (sham-stimulated) כדי לבודד השפעות ספציפיות לעירור.
