איפה אתה חותך בנושאים: דיסקציה ומדריך ניתוח האוריינטציה המרחבי של הרשתית העכבר מן ציוני דרך עינית

מטרת פרוטוקול דיסקציה זה היא לספק מתודולוגיה סטנדרטית לשימוש בציוני דרך אנטומיים של העין, כמו שרירי פי הטבעת, סדק כורואיד ושיפוע S-opsin לכיוון הטופוגרפי של רשתית העכבר. היתרון העיקרי של טכניקות אלו הוא שהן מספקות דרך אמינה לזהות במדויק את הקוטב הגבי, הגחוני, האף והטמפורלי של רשתית עכבר מבודדת. התחל בזיהוי נקודה על הקרנית הגבית ליד גבול הקרנית סקלרה ובין הקנתי האף והטמפורלי.

גע בקרנית עם עט צריבה מחומם למשך פחות משנייה כדי ליצור סימן צריבה למטרות התמצאות. חזור על הפעולה עבור העין השנייה. נוכחות הכוויה הגבית מאפשרת זיהוי של שריר פי הטבעת העליון.

לצורך הוצאת גרעין, השתמשו במלקחיים מעוקלים כדי לדחוף בעדינות את העין החוצה מארובת העין ולאחוז בכדור הארץ מתחתיה. לאחר מכן, הרם לאט את הגלובוס מהשקע שלו ובמקביל הזז אותו בעדינות משמאל לימין עד שהגלובוס משתחרר מהשקע. העבירו את הגלובוס עם שרירי פי הטבעת המחוברים לצלחת פטרי המכילה מדיום דיסקציה.

אם אתם עובדים עם שתי העיניים, הקפידו לעקוב אחר איזו עין היא העין השמאלית ואיזו היא העין הימנית. תחת היקף הדיסקציה, אתר חזותית את כוויית הקרנית הגבית וזהה את שריר פי הטבעת העליון אליו הוא קשור. בעזרת מספריים לדיסקציה או מחט בגודל 20, נקב את הקרנית בסימן הכוויה.

לאחר מכן, בצע חתך עמוק לתוך הגלובוס לכיוון עצב הראייה כדי לחצות את השריר העליון. רשתית מבודדת עם חתך זה נראית כאן, ורשתית משוחזרת עם חתך זה מוצגת כאן. השתמש בשני סטים של מלקחיים כדי להתחיל לבודד את הרשתית על ידי קריעה עדינה של החור שנוצר עם הניקוב עד לחשיפת חלק מהרשתית.

לאחר מכן, הפרידו את הרשתית מהסקלרה עד שהסקלרה הוסרה לחלוטין. הסר את הקשתית, העדשה, הזגוגית וכל המבנים שנותרו עד לבידוד מוחלט של הרשתית. נוכחות של כוויה גבית מאפשרת זיהוי של סדק הכורואיד באף והטמפורלי.

אם עובדים עם עין ימין, סדק הכורואיד באף ממוקם מימין לכוויה וסדק הכורואיד הטמפורלי ממוקם משמאל לכוויה. זה הפוך מעבודה עם עין שמאל. כדי להשתמש בציון הדרך של סדק הכורואיד לזיהוי כיוון הרשתית, אתר וזהה את סדק הכורואיד בחלק האחורי של העין.

כוון את הגלובוס כך שסימן הצריבה הגבי ימוקם בקוטב העליון, כפי שהיה אם העין הייתה עדיין בעכבר. לאחר מכן, השתמש במספריים לדיסקציה או במחט בגודל 20 כדי לבצע ניקוב אחד בגלובוס, תחילה היכן שנמצאת כוויית הגב. לאחר מכן, בצע חתך הקלה רדוד לכיוון עצב הראייה שבו נמצאת כוויית הקרנית הגבית.

לאחר מכן, בצע את שני החתכים העמוקים הבאים לכיוון עצב הראייה. אחד על ידי ריפוד הלהבים של מספרי הדיסקציה כלפי מעלה עם קו הסדק הכורואיד הטמפורלי בחלק האחורי של העין, ואחד על ידי ריפוד הלהבים של מספריים הדיסקציה כלפי מעלה עם קו הסדק הכורואיד באף בחלק האחורי של העין. חתכים אלה מוצגים כאן על רשתית מבודדת ומשוחזרת.

לאחר ביצוע חתכים אלה, השתמש בשני סטים של מלקחיים כדי לקרוע בעדינות את חורי הניקוב עד שחלק מהרשתית נחשף. בעזרת מספריים לדיסקציה, בצע ארבעה חתכים מקלים ברשתית כך שהיא תשכב שטוחה. הרכיבו את הרשתית, צד תאי הגנגליון כלפי מעלה, על קרום הניטרוצלולוזה על ידי לחיצה עדינה על כל פינה של הרשתית על הממברנה בעזרת מלקחיים.

לאחר מכן, השתמש במלקחיים כדי לטבול את הרשתית המותקנת לתוך מיליליטר אחד של 4% פרפורמלדהיד הכלול בבאר הראשונה של צלחת של 24 בארות. הניחו את צלחת 24 הבארות על שייקר אורביטלי בטמפרטורת החדר וקבעו את הרשתית למשך 40 דקות בדיוק. לאחר הקיבוע, העבירו את הרשתית לבאר השנייה של הצלחת, הממולאת במיליליטר אחד של 0.1 PBS מולארי ושטפו את הרשתית למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.

בסיום הכביסה, העבירו את הרשתית המותקנת לבאר החמישית המכילה מיליליטר אחד של תמיסת חסימה ודגרו למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת, הוסיפו את הנוגדן הראשוני נגד S-opsin לתמיסת החסימה בריכוז של 1 עד 500 ודגרו במשך שלושה ימים בארבע מעלות צלזיוס. לאחר שלושת ימי הדגירה, שטפו את עודפי הנוגדן הראשוני מהרשתית שש פעמים על ידי הנחתו ברצף בשש בארות מלאות במיליליטר PBS למשך 10 דקות כל אחת בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן מניחים את הרשתית השטופה בבאר עם תמיסת חסימה טרייה ומוסיפים נוגדן משני נגד ארנב חמור Alexa 594. דגרו על הרשתית עם הנוגדן המשני למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה יש לשטוף את הרשתית ב-PBS שש פעמים, כמו קודם.

בעזרת מלקחיים, העבירו את הרשתית המותקנת לצלחת פטרי המכילה PBS. שחררו את הרשתית מקרום הניטרוצלולוזה על ידי החדרה עדינה של קצות המלקחיים בין הרשתית לקרום עד שהרשתית כבר לא מחוברת. טבלו שקופית מיקרוסקופ זכוכית ב-PBS והרכיבו את הרשתית על המגלשה על ידי הצפתה על המגלשה ודחיפתה בעדינות בעזרת מלקחיים עד שהרשתית נדבקת לזכוכית.

מכסים את הרשתית על השקופית במדיום הרכבה ומניחים כיסוי 1.5. הכניסו את השקופית למגש שקופיות והניחו לה לשבת בטמפרטורת החדר למשך שעה. לאחר שעה, הניחו את מגש השקופיות על ארבע מעלות צלזיוס.

לאחר כיסוי המגלשה למשך 24 שעות, השתמש בלק כדי לאטום את דפנות המגלשה כדי למנוע התייבשות. זוהי דוגמה לרשתית שבודדה מהעין הימנית שעברה צביעה חיסונית כדי לסמן S-opsin וצולמה במיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי. חשוב לציין כי החתכים ברשתית זו הם שרירותיים מכיוון שניתן לזהות את הכיוון הטופוגרפי על ידי שיפוע S-opsin.

לאחר מכן ניתן לשחזר את התמונה הנרכשת של הרשתית באופן דיגיטלי באמצעות תוכנת ReadiStruct. החיתוכים המקוריים הם בצבע אדום פסאודו-בתמונה זו. שים לב שקובץ הפלט של תוכנית זו אינו מיישר כראוי את הרשתית.

לאחר שהרשתית עברה את קוד מעבדת המחצלת המותאם אישית, הרשתית מסובבת כך שהריכוז הגבוה ביותר של צביעת S-opsin ממוקם בתחתית ומזוהה כרשתית הגחונית. תמונה זו מציגה את הרשתית מעין שמאל. הקוטב הטמפורלי ממוקם ב-90 מעלות נגד כיוון השעון מהקוטב הגחוני וקוטב האף ממוקם 90 מעלות בכיוון השעון מהקוטב הגחוני.

לאחר שליטה, טכניקות דיסקציה אלה יכולות להיעשות די מהר תוך מספר דקות בלבד אם הן מבוצעות כראוי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לכוון בצורה מדויקת ואמינה את רשתית העכבר באמצעות שריר פי הטבעת העליון, סדק כורואיד או שיפוע S-opsin כציון דרך.